贯叶连翘的组织培养和快速繁殖
作者：丁如贤 许铁峰 张汉明
单位：丁如贤(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)；许铁峰(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)；张汉明(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)
关键词：贯叶连翘；组织培养；愈伤；培养基
第二军医大学学报001002 [摘要] 目的：探索贯叶连翘外植体组织 培养的适合培养基配方。方法：将贯叶连翘种子发芽产生的根、带节 茎段、叶作为外植体，培养在含不同种类及浓度激素的Murashige and Skoog (MS)基本培养 基上，诱导愈伤组织、芽和根的形成，并进行试管苗的移栽。结果： 不同激素配比和不同种类外植体对愈伤组织和芽的形成有较大区别。2,4-二氯苯氧乙酸 (2 ,4-D)有利于促进贯叶连翘愈伤组织的形成；在细胞分裂素中，6-苄基氨基嘌呤(6-BA)促 进生芽的作用很明显，而激动素(KT)、玉米素(ZT)则不明显；α-萘乙酸(NAA)1 mg/L与6- BA 0.2 mg/L的组合有利于贯叶连翘的生根。结论：含有2,4-D的MS培 养基有利于愈伤的诱导，外植体根最适合丛生芽的快速诱导。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 282.71 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0904-03
Tissue culture and rapid regeneration of Hypericum perforatum
DING Ru-Xian, XU Tie-Feng, ZHANG Han-Ming
(Department of Pharmacognosy, Colle ge of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[ABSTRACT]Objective: To study the proper medium for tissue c ulture of the explants from Hypericum perforatum. Methods: The root, stem with node and leaf of the Hypericum perforatum seedling wer e used as explants, and cultured in basic Murashige and Skoog (MS) medium supple mented with different kinds and different concentrations of hormones. The callus , buds and roots were induced. The cultivation of the tube seedling were carried out. Results: Different hormones and explants had different eff ects on the induction of callus and the formation of buds. 2,4-D could promote the formation of the callus of Hypericum perforatum. Among cytokinins, 6-B A had great effect on the formation of buds, but the effects of KT and ZT were insignificant. The combination of NAA 1 mg/L and 6-BA 0.2 mg/L was found most effective in promoting the rooting of Hypericum perforatum. Conclusi on: The results indicate that the callus is easy to be induced when MS m edium supplemented with 2,4-D. The root of explants is most suitable for the ro sette bud rapid induction.
, 百拇医药
[KEY WORDS] Hypericum perforatu m; tissue culture; callus; culture media
贯叶连翘(Hypericum perforatum)是藤黄科金丝桃属植物，是中国传统中药，为多 年生草本植物，主要用于抗菌消炎、收敛止血、解毒消肿，用药已有近2 400年的历史 [1]。公元800年，希腊医师盖伦最早用贯叶连翘(俗名St.John′s Wort, 简称SJW)提 取物治疗抑郁症，后经几个世纪的应用证实它的安全性较好。80年代后期，人们研究发现其 植物体内所含的金丝桃素具有显著的抗DNA，RNA病毒繁殖的作用，引起了世界各国研究者的 广泛兴趣[2]。1998年3月在美国加州召开了第一次国际贯叶连翘会议，各位专家详 细介绍了贯叶连翘的历史、植物学、资源、化学成分、制剂、药理等内容[3]。目 前金丝桃素已作为药物在德国、英国等上市，主要用于治疗抑郁症、甲型肝炎、乙型肝炎等 疾病[4,5]。由于贯叶金丝桃的广泛应用，导致其资源供不应求，许多国家除采挖 野生资源外，现都已开始人工栽培。为保护野生资源、为人工栽培提供优质种苗，我们开展 贯叶连翘的组织培养和快速繁殖研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料来源 贯叶连翘种子购于陕西，并经作者鉴定。
1.2 材料处理 贯叶连翘种子用70%乙醇浸泡30 s，取出水洗，然后用0.1%HgCl 2灭菌10 min，置超净台上用无菌水冲洗3，4次，接种于MS固体培养基上，发芽长苗。待 苗长至5 cm左右，具约6个茎节时，分别剪其根、带节茎段和叶作为外植体进行培养。
1.3 培养基和培养条件 利用不同的激素配比，分别设置诱导愈伤、诱导丛生芽 和诱导生根的培养基。以MS为基本培养基分别附加2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、 6-苄基 氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、玉米 素(ZT)和水解酪蛋白(CH)。每种培养基均附加3%蔗糖和0.7%琼脂，pH 5.8。培养温度(25 ±1)℃，光照每天12 h，光照度2 000 lx。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 愈伤组织诱导 结果见表1。从表1结果可以看出，2,4-D有利于促进愈伤组 织的形成，特别是加入CH后能显著提高愈伤的诱导率。6-BA的高浓度也有较强的辅助作用 。在2号配方上，10 d左右根首先在接触培养基处开始膨大并愈伤化，色泽发绿并稍红，以 后愈伤化逐渐加速扩大到整个外植体。愈伤组织连接较紧，有点粘稠。茎的愈伤开始及程度 要次于根。叶的愈伤诱导率最差，在4种激素配比中，许多外植体叶经过一段时间后都枯死 了。我们也尝试了其他生长素IAA，IBA，其愈伤诱导率都很低，有些虽开始稍愈，但经过一 段时间后则转变为丛生芽。
表 1 愈伤诱导结果
Tab 1 Results of callus induction No.
MS medium supplemented
, http://www.100md.com
with different hormones
(ρB/mg*L-1)
Root
Stem
Leaf
No. of
explants
No. of
callus
Inducing
rate (%)
, http://www.100md.com
No. of
explants
No. of
callus
Inducing
rate (%)
No. of
explants
No. of
callus
Inducing
rate (%)
, 百拇医药
1
2,4-D(0.2)+6-BA(1)
58
8
14
54
10
54
56
6
11
2
2,4-D(0.5)+6-BA(1)+CH(500)
, http://www.100md.com
56
56
100
55
52
95
58
22
38
3
2,4-D(0.1)+6-BA(2)+CH(500)
56
52
, http://www.100md.com
93
57
50
88
55
10
55
4
NAA(2)+6-BA(0.5)
60
27a
45
57
, 百拇医药
21a
37
59
5a
8
a Embryos are gradually formed after the induction of callus； Values in bra ckets are concentrations of hormones2.2 丛生芽的诱导 我们设计了6种激素配比，外植体根、茎、叶在培养基5，6号配方上丛生芽的
诱导率很高(见表2)，外植体在5号配方上一开始几不愈伤，直接长芽而且长得碧 绿很好，在6号配方上也是直接生芽，经过一段时间培养后，不仅丛生芽的数目比5号配方上 的多，芽也较小，而且接触培养基处稍有点愈伤化。从激素配比可以看出6-BA在促进生芽 方面起到较关键的作用，其他细胞分裂素KT，ZT促进芽形成的作用不明显，CH也一样；但在 培养基8，10号配方上长出的芽与同期其他培养基上的芽相比则生长得快，且叶大、茎长，Z T可能根本没有促进芽形成的作用，但可能有促进生长的作用。从根、茎、叶3种外植体比较 来看，不管在什么培养基上外植体根的芽诱导率最高，并且每个外植体根上形成芽的数目也 最多，其次是茎，再次是叶。
, 百拇医药
表 2 丛生芽的诱导结果
Tab 2 Induction results of shoots from explants directly No.
MS medium supplemented
with different hormones
(ρB/mg*L-1)
Root
Stem
Leaf
No. of
explants
, 百拇医药
No. of
shoots
Inducing
rate (%)
No. of
explants
No. of
shoots
Inducing
rate (%)
No. of
explants
, http://www.100md.com
No. of
shoots
Inducing
rate (%)
5
NAA(1)+6-BA(0.5)
45
45
100
46
46
100
43
, 百拇医药
43
100
6
IBA(0.5)+6-BA(2)
42
42
100
44
44
100
45
45
100
, 百拇医药
7
NAA(1)+KT(1)
43
25
58
45
5
11
42
4
10
8
ZT(2)+NAA(0.1)+CH(500)
, 百拇医药
43
12
28
44
12
27
44
5
11
9
KT(2)+IAA(0.1)+CH(500)
44
22
, 百拇医药
50
45
27
60
47
8
17
10
ZT(1)+IAA(0.2)+CH(500)
42
6
14
43
, 百拇医药
16
37
43
3
7
Values in brackets are concentrations of hormones
2.3 诱导生根 将诱导芽培养基上诱导的芽小心分开移至生根培养基上，这些小 芽能在培养基上继续生长。20 d左右时，11号配方上的小苗可以看到有根长出，数目较少， 而且根较细，随后根逐渐长长，颜色有点发黑，结果是根数目少，但较长。12号配方上根形 成较晚，效果较差，13号配方则更次之，但苗长得较旺盛，可能是由于6-BA浓度较高，NAA 浓度相对较低的结果(表3)。
表 3 诱导生根结果
, 百拇医药
Tab 3 Induction results of root formation No.
MS medium supplemented
with different hormones
(ρB/mg*L-1)
No. of
explants
No. of
roots
Inducing
rate (%)
, 百拇医药
11
NAA(1)+6-BA(0.2)
64
45
70
12
NAA(2)+6-BA(0.5)
67
37
55
13
NAA(1)+6-BA(1)
66
, http://www.100md.com
23
35
Values in brackets are concentrations of hormones2.4 试管苗的移栽 将培养有试管苗的三角锥瓶打开，在室温中炼苗3 d，然后取 出，洗去根部的琼脂，移至盛有蛭石与泥炭(1∶1)的花钵中，每天浇含MS大量元素的稀释 培养液，移栽成活率64%。
3 讨 论
从实验结果来看，贯叶连翘愈伤组织的形成较容易，特别是根与茎在含2,4-D的培养基上基 本都能形成，生长速度也较快，继代培养后速度更快。不定芽可由外植体直接产生，也可由 愈伤组织形成胚状体，再分化成芽，两种类型的繁殖系数都很高。贯叶连翘的组织培养曾有 报道[6]。本研究发现，其丛生芽的快速诱导以外植体根最为合适。因此贯叶连翘 的快速繁殖可以设计为：外植体根置于诱导芽培养基，再转移至生根培养基，这样可以在短 时期内获得大量所需种苗。此研究为解决药用植物贯叶连翘资源短缺及实验室生产金丝桃素 提供了理论依据。
, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39870919).
[作者简介] 丁如贤(1963-), 男(汉族),硕士,讲师.
[参 考 文 献]
[1] 江苏新医学院 编. 中药大辞典(上册)[M]. 上海：上海人民出版社 ，1977. 1488-1489.
[2] Tang J, Colacino JM, Larsen SH, et al. Virucidal activity of hype ricin against enveloped and non-enveloped DNA and RNA viruses[J]. Antiviral Res, 1990,13(6):313-325.
[3] 第一次国际贯叶金丝桃会议介绍[J]. 国外医药*植物药分册，1999，14(4 )：161-164.
, 百拇医药
[4] Miller AL. St.John′s Wort (Hypericum perforatum): clinical effec ts on depression and other conditions[J]. Altern Med Rev, 1998,3(1):18-26.
[5] Chatterjee SS, Bhattacharya SK, Wonnemann M, et al. Hyperforin as a possible antidepressant component of hypericum extracts[J]. Life Sci, 1998 ,63(6): 499-510.
[6] 徐元红，李发荣，王之. 贯叶连翘组织培养及植株再生研究[J]. 中草药,1 999,30(2):132-134.
[收稿日期] 2000-04-24
[修回日期] 2000-07-17, 百拇医药
单位：丁如贤(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)；许铁峰(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)；张汉明(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)
关键词：贯叶连翘；组织培养；愈伤；培养基
第二军医大学学报001002 [摘要] 目的：探索贯叶连翘外植体组织 培养的适合培养基配方。方法：将贯叶连翘种子发芽产生的根、带节 茎段、叶作为外植体，培养在含不同种类及浓度激素的Murashige and Skoog (MS)基本培养 基上，诱导愈伤组织、芽和根的形成，并进行试管苗的移栽。结果： 不同激素配比和不同种类外植体对愈伤组织和芽的形成有较大区别。2,4-二氯苯氧乙酸 (2 ,4-D)有利于促进贯叶连翘愈伤组织的形成；在细胞分裂素中，6-苄基氨基嘌呤(6-BA)促 进生芽的作用很明显，而激动素(KT)、玉米素(ZT)则不明显；α-萘乙酸(NAA)1 mg/L与6- BA 0.2 mg/L的组合有利于贯叶连翘的生根。结论：含有2,4-D的MS培 养基有利于愈伤的诱导，外植体根最适合丛生芽的快速诱导。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 282.71 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0904-03
Tissue culture and rapid regeneration of Hypericum perforatum
DING Ru-Xian, XU Tie-Feng, ZHANG Han-Ming
(Department of Pharmacognosy, Colle ge of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[ABSTRACT]Objective: To study the proper medium for tissue c ulture of the explants from Hypericum perforatum. Methods: The root, stem with node and leaf of the Hypericum perforatum seedling wer e used as explants, and cultured in basic Murashige and Skoog (MS) medium supple mented with different kinds and different concentrations of hormones. The callus , buds and roots were induced. The cultivation of the tube seedling were carried out. Results: Different hormones and explants had different eff ects on the induction of callus and the formation of buds. 2,4-D could promote the formation of the callus of Hypericum perforatum. Among cytokinins, 6-B A had great effect on the formation of buds, but the effects of KT and ZT were insignificant. The combination of NAA 1 mg/L and 6-BA 0.2 mg/L was found most effective in promoting the rooting of Hypericum perforatum. Conclusi on: The results indicate that the callus is easy to be induced when MS m edium supplemented with 2,4-D. The root of explants is most suitable for the ro sette bud rapid induction.
, 百拇医药
[KEY WORDS] Hypericum perforatu m; tissue culture; callus; culture media
贯叶连翘(Hypericum perforatum)是藤黄科金丝桃属植物，是中国传统中药，为多 年生草本植物，主要用于抗菌消炎、收敛止血、解毒消肿，用药已有近2 400年的历史 [1]。公元800年，希腊医师盖伦最早用贯叶连翘(俗名St.John′s Wort, 简称SJW)提 取物治疗抑郁症，后经几个世纪的应用证实它的安全性较好。80年代后期，人们研究发现其 植物体内所含的金丝桃素具有显著的抗DNA，RNA病毒繁殖的作用，引起了世界各国研究者的 广泛兴趣[2]。1998年3月在美国加州召开了第一次国际贯叶连翘会议，各位专家详 细介绍了贯叶连翘的历史、植物学、资源、化学成分、制剂、药理等内容[3]。目 前金丝桃素已作为药物在德国、英国等上市，主要用于治疗抑郁症、甲型肝炎、乙型肝炎等 疾病[4,5]。由于贯叶金丝桃的广泛应用，导致其资源供不应求，许多国家除采挖 野生资源外，现都已开始人工栽培。为保护野生资源、为人工栽培提供优质种苗，我们开展 贯叶连翘的组织培养和快速繁殖研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料来源 贯叶连翘种子购于陕西，并经作者鉴定。
1.2 材料处理 贯叶连翘种子用70%乙醇浸泡30 s，取出水洗，然后用0.1%HgCl 2灭菌10 min，置超净台上用无菌水冲洗3，4次，接种于MS固体培养基上，发芽长苗。待 苗长至5 cm左右，具约6个茎节时，分别剪其根、带节茎段和叶作为外植体进行培养。
1.3 培养基和培养条件 利用不同的激素配比，分别设置诱导愈伤、诱导丛生芽 和诱导生根的培养基。以MS为基本培养基分别附加2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、 6-苄基 氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、玉米 素(ZT)和水解酪蛋白(CH)。每种培养基均附加3%蔗糖和0.7%琼脂，pH 5.8。培养温度(25 ±1)℃，光照每天12 h，光照度2 000 lx。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 愈伤组织诱导 结果见表1。从表1结果可以看出，2,4-D有利于促进愈伤组 织的形成，特别是加入CH后能显著提高愈伤的诱导率。6-BA的高浓度也有较强的辅助作用 。在2号配方上，10 d左右根首先在接触培养基处开始膨大并愈伤化，色泽发绿并稍红，以 后愈伤化逐渐加速扩大到整个外植体。愈伤组织连接较紧，有点粘稠。茎的愈伤开始及程度 要次于根。叶的愈伤诱导率最差，在4种激素配比中，许多外植体叶经过一段时间后都枯死 了。我们也尝试了其他生长素IAA，IBA，其愈伤诱导率都很低，有些虽开始稍愈，但经过一 段时间后则转变为丛生芽。
表 1 愈伤诱导结果
Tab 1 Results of callus induction No.
MS medium supplemented
, http://www.100md.com
with different hormones
(ρB/mg*L-1)
Root
Stem
Leaf
No. of
explants
No. of
callus
Inducing
rate (%)
, http://www.100md.com
No. of
explants
No. of
callus
Inducing
rate (%)
No. of
explants
No. of
callus
Inducing
rate (%)
, 百拇医药
1
2,4-D(0.2)+6-BA(1)
58
8
14
54
10
54
56
6
11
2
2,4-D(0.5)+6-BA(1)+CH(500)
, http://www.100md.com
56
56
100
55
52
95
58
22
38
3
2,4-D(0.1)+6-BA(2)+CH(500)
56
52
, http://www.100md.com
93
57
50
88
55
10
55
4
NAA(2)+6-BA(0.5)
60
27a
45
57
, 百拇医药
21a
37
59
5a
8
a Embryos are gradually formed after the induction of callus； Values in bra ckets are concentrations of hormones2.2 丛生芽的诱导 我们设计了6种激素配比，外植体根、茎、叶在培养基5，6号配方上丛生芽的
诱导率很高(见表2)，外植体在5号配方上一开始几不愈伤，直接长芽而且长得碧 绿很好，在6号配方上也是直接生芽，经过一段时间培养后，不仅丛生芽的数目比5号配方上 的多，芽也较小，而且接触培养基处稍有点愈伤化。从激素配比可以看出6-BA在促进生芽 方面起到较关键的作用，其他细胞分裂素KT，ZT促进芽形成的作用不明显，CH也一样；但在 培养基8，10号配方上长出的芽与同期其他培养基上的芽相比则生长得快，且叶大、茎长，Z T可能根本没有促进芽形成的作用，但可能有促进生长的作用。从根、茎、叶3种外植体比较 来看，不管在什么培养基上外植体根的芽诱导率最高，并且每个外植体根上形成芽的数目也 最多，其次是茎，再次是叶。
, 百拇医药
表 2 丛生芽的诱导结果
Tab 2 Induction results of shoots from explants directly No.
MS medium supplemented
with different hormones
(ρB/mg*L-1)
Root
Stem
Leaf
No. of
explants
, 百拇医药
No. of
shoots
Inducing
rate (%)
No. of
explants
No. of
shoots
Inducing
rate (%)
No. of
explants
, http://www.100md.com
No. of
shoots
Inducing
rate (%)
5
NAA(1)+6-BA(0.5)
45
45
100
46
46
100
43
, 百拇医药
43
100
6
IBA(0.5)+6-BA(2)
42
42
100
44
44
100
45
45
100
, 百拇医药
7
NAA(1)+KT(1)
43
25
58
45
5
11
42
4
10
8
ZT(2)+NAA(0.1)+CH(500)
, 百拇医药
43
12
28
44
12
27
44
5
11
9
KT(2)+IAA(0.1)+CH(500)
44
22
, 百拇医药
50
45
27
60
47
8
17
10
ZT(1)+IAA(0.2)+CH(500)
42
6
14
43
, 百拇医药
16
37
43
3
7
Values in brackets are concentrations of hormones
2.3 诱导生根 将诱导芽培养基上诱导的芽小心分开移至生根培养基上，这些小 芽能在培养基上继续生长。20 d左右时，11号配方上的小苗可以看到有根长出，数目较少， 而且根较细，随后根逐渐长长，颜色有点发黑，结果是根数目少，但较长。12号配方上根形 成较晚，效果较差，13号配方则更次之，但苗长得较旺盛，可能是由于6-BA浓度较高，NAA 浓度相对较低的结果(表3)。
表 3 诱导生根结果
, 百拇医药
Tab 3 Induction results of root formation No.
MS medium supplemented
with different hormones
(ρB/mg*L-1)
No. of
explants
No. of
roots
Inducing
rate (%)
, 百拇医药
11
NAA(1)+6-BA(0.2)
64
45
70
12
NAA(2)+6-BA(0.5)
67
37
55
13
NAA(1)+6-BA(1)
66
, http://www.100md.com
23
35
Values in brackets are concentrations of hormones2.4 试管苗的移栽 将培养有试管苗的三角锥瓶打开，在室温中炼苗3 d，然后取 出，洗去根部的琼脂，移至盛有蛭石与泥炭(1∶1)的花钵中，每天浇含MS大量元素的稀释 培养液，移栽成活率64%。
3 讨 论
从实验结果来看，贯叶连翘愈伤组织的形成较容易，特别是根与茎在含2,4-D的培养基上基 本都能形成，生长速度也较快，继代培养后速度更快。不定芽可由外植体直接产生，也可由 愈伤组织形成胚状体，再分化成芽，两种类型的繁殖系数都很高。贯叶连翘的组织培养曾有 报道[6]。本研究发现，其丛生芽的快速诱导以外植体根最为合适。因此贯叶连翘 的快速繁殖可以设计为：外植体根置于诱导芽培养基，再转移至生根培养基，这样可以在短 时期内获得大量所需种苗。此研究为解决药用植物贯叶连翘资源短缺及实验室生产金丝桃素 提供了理论依据。
, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39870919).
[作者简介] 丁如贤(1963-), 男(汉族),硕士,讲师.
[参 考 文 献]
[1] 江苏新医学院 编. 中药大辞典(上册)[M]. 上海：上海人民出版社 ，1977. 1488-1489.
[2] Tang J, Colacino JM, Larsen SH, et al. Virucidal activity of hype ricin against enveloped and non-enveloped DNA and RNA viruses[J]. Antiviral Res, 1990,13(6):313-325.
[3] 第一次国际贯叶金丝桃会议介绍[J]. 国外医药*植物药分册，1999，14(4 )：161-164.
, 百拇医药
[4] Miller AL. St.John′s Wort (Hypericum perforatum): clinical effec ts on depression and other conditions[J]. Altern Med Rev, 1998,3(1):18-26.
[5] Chatterjee SS, Bhattacharya SK, Wonnemann M, et al. Hyperforin as a possible antidepressant component of hypericum extracts[J]. Life Sci, 1998 ,63(6): 499-510.
[6] 徐元红，李发荣，王之. 贯叶连翘组织培养及植株再生研究[J]. 中草药,1 999,30(2):132-134.
[收稿日期] 2000-04-24
[修回日期] 2000-07-17, 百拇医药