两种冻存方法在肿瘤微转移检测中的运用
作者：李荔霞 王晓怀 郑文岭 王捷 林金容
单位：(广州军区广州总医院肿瘤科 510010)
关键词：冻存方法；肿瘤；微转移；逆转录PCR
广东医学001010
【摘要】目的 建立科学的外周血有核细胞的冻存方法，为肿瘤的微转移逆转录PCR检测打好基础。方法 分离15例CEA分泌性肿瘤患者外周血有核细胞，分别用两种方法冻存，设为两组。对细胞进行总RNA的抽提，测定RNA OD值并行1%琼脂糖凝胶电泳，进一步逆转录PCR反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析最终产物。结果 经两种方法冻存的细胞，其总RNA OD值差异无显著性，电泳均见竹节样带。两组逆转录PCR结果一致，阳性率均为66.7%。结论 在肿瘤的微转移逆转录PCR检测中，抽提组织或细胞总RNA是重要的环节，而对于后者来说，原始标本的冻存是很关键的。该实验中所采用的两种冻存方法都切实可行。
, 百拇医药
Two methods of freezing storage for detecting tumor micrometastases
Li Lixia,Wang Xiaohuai,Zheng Wenling,et al.
(Department of Oncology,General Hospital of Guangzhou Command of PLA,Guangzhou 510010)
【Abstract】Objective To establish scientific methods of freezing storage of nucleated cells in peripheral blood for detecting tumor micrometastases with RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) .Methods First,nucleated cells in peripheral blood from 15 patients with CEA-producing tumors were seperated.Secondly,two methods of freezing storage were used in two groups respectively.After total RNA extraction,OD value detection,agarose gels electrophoresis,RT-PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were performed.Results There was no significant difference between the two groups of RNA OD values.After running on agarose gels,intact 28S and 18S RNAs of total RNA were clearly seen.The RT-PCR results of the two groups were consistent.The CEA mRNA positive rate was 66.7%.Conclusion Isolating total RNA from nucleated cells or tissues is an important step in detecting tumor micrometastases with RT-PCR.Furthermore,how to freeze the original samples seems crucial.The above-mentioned two methods are both practical.
, 百拇医药
【Key words】Methods of freezing storage Tumor Micrometastases Reverse transcription-polymerase chain reaction
随着分子生物学的发展，RT-PCR技术已广泛运用于肿瘤的微转移研究[1]。RT-PCR过程大体包括组织和细胞的分离、总RNA的抽提、逆转录、PCR等。由于实验的分段性，常常需要将收集好的细胞先冻存起来备用。下面介绍两种保存方法。
1 资料与方法
1.1 标本来源 静脉血取自1999年1～2月在广州军区总医院住院的患者 15 例，均为CEA分泌性肿瘤患者，包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌等患者。
1.2 有核细胞的分离 用淋巴细胞分离液进行常规有核细胞的分离。在用生理盐水洗涤时，每份标本按体积一分为二，设为两组。
, 百拇医药
1.3 有核细胞的冻存 分离得到的两组细胞分别按方法1，2冻存。方法1：不加冻存液，直接将沉淀于管底的细胞冻存于超低温冰箱(-80°C)中。方法2：加入20% DMSO冻存液，用吸管吹打细胞使之分散，然后将细胞置于超低温冰箱中保存备用。
1.4 细胞总RNA的抽提 用Trizol RNA抽提液对上述两种方法保存的细胞进行总RNA的抽提。
1.5 OD值测定及RNA分析 紫外分光光度计测定两组RNA OD值，1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA。以RNA为模板，用特异的引物[2]进一步行逆转录PCR，并对扩增产物进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 OD值 两组细胞OD值详见表1。对两组数值进行比较，t=0.691,P>0.5,说明两组数值之间差异无显著性。根据RNA浓度(μg/μl)=OD 260×核酸稀释倍数×40/1 000，得到的两组RNA浓度之间差异亦无显著性。
, 百拇医药
表1 用两法冻存的细胞的RNA OD 260值 患者号
方法1
方法2
差值
患者号
方法1
方法2
差值
1
0.021
0.018
0.003
9
, http://www.100md.com
0.016
0.013
0.003
2
0.019
0.015
0.004
10
0.033
0.025
0.008
3
0.022
, http://www.100md.com
0.023
-0.001
11
0.028
0.034
-0.006
4
0.022
0.030
-0.008
12
0.015
0.020
, http://www.100md.com
-0.005
5
0.025
0.019
0.006
13
0.027
0.019
0.008
6
0.029
0.033
-0.004
, 百拇医药
14
0.032
0.020
0.012
7
0.018
0.026
-0.008
15
0.024
0.025
-0.001
8
, 百拇医药
0.020
0.014
0.006
2.2 1%琼脂糖凝胶电泳 所抽提出的RNA样品电泳后观察，28S及18S带清晰。
2.3 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳 两组结果是一致的，CEA mRNA阳性率均为66.7%。扩增出的特异条带分子量大小为131bp。
3 讨论
在肿瘤的微转移RT-PCR检测中，抽提组织或细胞总RNA是重要的环节。对于后者来说，原始标本的冻存是关键的一步。冻存质量的好坏将影响抽提的效果。原始标本可以是细胞或组织。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作，细胞冻存可以减少人力、经费、减少污染及减少细胞生物学特性变化。细胞冻存一般要加低温保护剂，如不加，将导致细胞内一系列物理和化学的变化，最终导致细胞死亡。但从细胞中抽提RNA，目的是为了获得RNA，而不需要完整的、活的细胞，故冻存的方法又有其特殊性。RNA是一种很不稳定的物质，容易被RNA酶降解，而RNA酶广泛存在。当细胞裂解时，细胞内的RNA 及RNA酶都释放出来。在低温(如-80°C)状态下，酶的活性几乎无，从而保证了RNA不被降解。鉴于上述原因，我们在实验中采取了加与不加冻存液两种方法来冻存细胞，并对结果进行比较分析。国外学者采用的方法相对复杂些，比如在细胞中加入细胞裂解液(一种强变性剂)后，置于-80°C保存[3]。RNA酶在强变性剂存在的情况下没有活性，因此可以保存RNA。有的学者将细胞或术中切除的组织先在液氮中速冻，然后置于-70°C保存[4]。这种方法也是利用酶在低温下无活性这个特点。
, http://www.100md.com
从表1可以看出，经两种方法冻存后抽提出的细胞总RNA，其OD值一致，进而得到的两组RNA浓度之间差异无显著性。RNA电泳结果均见清晰的28S及18S条带。随后我们又对冻存了3个月和6个月的标本进行了上述研究，得到的两组细胞总RNA浓度之间差异仍无显著性，RT-PCR结果相符。这说明两种冻存方法是正确的，不对RNA的完整性造成影响。由此可见两种冻存方法切实可行，值得推广。
本课题受广东省自然科学基金(编号：960667)及广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”基金资助
参考文献
1，Ghossein RA,Rosai J.Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells.Cancer,1996,78(1):10
, http://www.100md.com
2，Gerhard M,Juhl H,Kalthoff H,et al.Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction.J Clin Oncol,1994,12(4):725
3，Nakanishi H,Kodera Y,Torii A,et al.Detection of carcinoembryonic antigen-expressing free tumor cells in peritoneal washs from patients with gastric carcinoma by polymerase chain reaction.Jpn J Cancer Res,1997,88(7):687
4，Jonas S,Windeatt S,Boateng AO,et al.Identification of carcinoembryonic antigen-producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction.Gut,1996,39:717
(收稿日期：2000-03-20), 百拇医药
单位：(广州军区广州总医院肿瘤科 510010)
关键词：冻存方法；肿瘤；微转移；逆转录PCR
广东医学001010
【摘要】目的 建立科学的外周血有核细胞的冻存方法，为肿瘤的微转移逆转录PCR检测打好基础。方法 分离15例CEA分泌性肿瘤患者外周血有核细胞，分别用两种方法冻存，设为两组。对细胞进行总RNA的抽提，测定RNA OD值并行1%琼脂糖凝胶电泳，进一步逆转录PCR反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析最终产物。结果 经两种方法冻存的细胞，其总RNA OD值差异无显著性，电泳均见竹节样带。两组逆转录PCR结果一致，阳性率均为66.7%。结论 在肿瘤的微转移逆转录PCR检测中，抽提组织或细胞总RNA是重要的环节，而对于后者来说，原始标本的冻存是很关键的。该实验中所采用的两种冻存方法都切实可行。
, 百拇医药
Two methods of freezing storage for detecting tumor micrometastases
Li Lixia,Wang Xiaohuai,Zheng Wenling,et al.
(Department of Oncology,General Hospital of Guangzhou Command of PLA,Guangzhou 510010)
【Abstract】Objective To establish scientific methods of freezing storage of nucleated cells in peripheral blood for detecting tumor micrometastases with RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) .Methods First,nucleated cells in peripheral blood from 15 patients with CEA-producing tumors were seperated.Secondly,two methods of freezing storage were used in two groups respectively.After total RNA extraction,OD value detection,agarose gels electrophoresis,RT-PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were performed.Results There was no significant difference between the two groups of RNA OD values.After running on agarose gels,intact 28S and 18S RNAs of total RNA were clearly seen.The RT-PCR results of the two groups were consistent.The CEA mRNA positive rate was 66.7%.Conclusion Isolating total RNA from nucleated cells or tissues is an important step in detecting tumor micrometastases with RT-PCR.Furthermore,how to freeze the original samples seems crucial.The above-mentioned two methods are both practical.
, 百拇医药
【Key words】Methods of freezing storage Tumor Micrometastases Reverse transcription-polymerase chain reaction
随着分子生物学的发展，RT-PCR技术已广泛运用于肿瘤的微转移研究[1]。RT-PCR过程大体包括组织和细胞的分离、总RNA的抽提、逆转录、PCR等。由于实验的分段性，常常需要将收集好的细胞先冻存起来备用。下面介绍两种保存方法。
1 资料与方法
1.1 标本来源 静脉血取自1999年1～2月在广州军区总医院住院的患者 15 例，均为CEA分泌性肿瘤患者，包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌等患者。
1.2 有核细胞的分离 用淋巴细胞分离液进行常规有核细胞的分离。在用生理盐水洗涤时，每份标本按体积一分为二，设为两组。
, 百拇医药
1.3 有核细胞的冻存 分离得到的两组细胞分别按方法1，2冻存。方法1：不加冻存液，直接将沉淀于管底的细胞冻存于超低温冰箱(-80°C)中。方法2：加入20% DMSO冻存液，用吸管吹打细胞使之分散，然后将细胞置于超低温冰箱中保存备用。
1.4 细胞总RNA的抽提 用Trizol RNA抽提液对上述两种方法保存的细胞进行总RNA的抽提。
1.5 OD值测定及RNA分析 紫外分光光度计测定两组RNA OD值，1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA。以RNA为模板，用特异的引物[2]进一步行逆转录PCR，并对扩增产物进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 OD值 两组细胞OD值详见表1。对两组数值进行比较，t=0.691,P>0.5,说明两组数值之间差异无显著性。根据RNA浓度(μg/μl)=OD 260×核酸稀释倍数×40/1 000，得到的两组RNA浓度之间差异亦无显著性。
, 百拇医药
表1 用两法冻存的细胞的RNA OD 260值 患者号
方法1
方法2
差值
患者号
方法1
方法2
差值
1
0.021
0.018
0.003
9
, http://www.100md.com
0.016
0.013
0.003
2
0.019
0.015
0.004
10
0.033
0.025
0.008
3
0.022
, http://www.100md.com
0.023
-0.001
11
0.028
0.034
-0.006
4
0.022
0.030
-0.008
12
0.015
0.020
, http://www.100md.com
-0.005
5
0.025
0.019
0.006
13
0.027
0.019
0.008
6
0.029
0.033
-0.004
, 百拇医药
14
0.032
0.020
0.012
7
0.018
0.026
-0.008
15
0.024
0.025
-0.001
8
, 百拇医药
0.020
0.014
0.006
2.2 1%琼脂糖凝胶电泳 所抽提出的RNA样品电泳后观察，28S及18S带清晰。
2.3 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳 两组结果是一致的，CEA mRNA阳性率均为66.7%。扩增出的特异条带分子量大小为131bp。
3 讨论
在肿瘤的微转移RT-PCR检测中，抽提组织或细胞总RNA是重要的环节。对于后者来说，原始标本的冻存是关键的一步。冻存质量的好坏将影响抽提的效果。原始标本可以是细胞或组织。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作，细胞冻存可以减少人力、经费、减少污染及减少细胞生物学特性变化。细胞冻存一般要加低温保护剂，如不加，将导致细胞内一系列物理和化学的变化，最终导致细胞死亡。但从细胞中抽提RNA，目的是为了获得RNA，而不需要完整的、活的细胞，故冻存的方法又有其特殊性。RNA是一种很不稳定的物质，容易被RNA酶降解，而RNA酶广泛存在。当细胞裂解时，细胞内的RNA 及RNA酶都释放出来。在低温(如-80°C)状态下，酶的活性几乎无，从而保证了RNA不被降解。鉴于上述原因，我们在实验中采取了加与不加冻存液两种方法来冻存细胞，并对结果进行比较分析。国外学者采用的方法相对复杂些，比如在细胞中加入细胞裂解液(一种强变性剂)后，置于-80°C保存[3]。RNA酶在强变性剂存在的情况下没有活性，因此可以保存RNA。有的学者将细胞或术中切除的组织先在液氮中速冻，然后置于-70°C保存[4]。这种方法也是利用酶在低温下无活性这个特点。
, http://www.100md.com
从表1可以看出，经两种方法冻存后抽提出的细胞总RNA，其OD值一致，进而得到的两组RNA浓度之间差异无显著性。RNA电泳结果均见清晰的28S及18S条带。随后我们又对冻存了3个月和6个月的标本进行了上述研究，得到的两组细胞总RNA浓度之间差异仍无显著性，RT-PCR结果相符。这说明两种冻存方法是正确的，不对RNA的完整性造成影响。由此可见两种冻存方法切实可行，值得推广。
本课题受广东省自然科学基金(编号：960667)及广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”基金资助
参考文献
1，Ghossein RA,Rosai J.Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells.Cancer,1996,78(1):10
, http://www.100md.com
2，Gerhard M,Juhl H,Kalthoff H,et al.Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction.J Clin Oncol,1994,12(4):725
3，Nakanishi H,Kodera Y,Torii A,et al.Detection of carcinoembryonic antigen-expressing free tumor cells in peritoneal washs from patients with gastric carcinoma by polymerase chain reaction.Jpn J Cancer Res,1997,88(7):687
4，Jonas S,Windeatt S,Boateng AO,et al.Identification of carcinoembryonic antigen-producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction.Gut,1996,39:717
(收稿日期：2000-03-20), 百拇医药