应用发根农杆菌Ri T-DNA建立菘蓝的毛状根优质株系和植株再生系统
作者：许铁峰 张汉明 张威 丁如贤 李博华
单位：许铁峰(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；张汉明(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；张威(哈尔滨医科大学生理学教研室)；丁如贤(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；李博华(第二军医大学科研部国际合作肿瘤研究所)
关键词：发根农杆菌；毛状根；菘蓝；再生植株
第二军医大学学报001003 [摘要] 目的：建立菘蓝(Isatis indig otica Fort)的毛状根离体培养系统，并诱导毛状根再生植株。方法：分别用发根农杆菌A4，R1601和ATCC15834三种菌株感染菘蓝的子叶外植体，获得毛状根， 并筛选了优质株系；测定了毛状根的生长曲线；在含不同激素的培养基上诱导毛状根再生植 株；利用高压纸电泳法对毛状根和再生植株进行T-DNA转化的检测。结果：首次利用发根农杆菌A4，R1601和ATCC15834三种菌株成功地从菘蓝中诱导出毛状根； 菘蓝毛状根在含BA的MS培养基中成功地诱导出再生植株；经高压纸电泳检测，菘蓝毛状根及 其再生植株中均含有甘露碱，表明Ri质粒的T-DNA已整合进毛状根和再生植株中。 结论：菘蓝毛状根离体培养和植株再生系统的建立，为进一步进行药用活性成 分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基础。
, 百拇医药
[中图分类号] R 282.71 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0907-03
Establishing better lines and regenerating system of hairy roots of Isatis in digotica with Ri T-DNA
XU Tie-Feng, ZHANG Han-Ming,DING Ru-Xian
(Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ZHANG Wei
, 百拇医药
(Department of Physiology, Harbin Medical University)
LI Bo-Hua
(International Joint Cancer Institute， Department of Science Research, Second Military Medical University)
[ABSTRACT] Objective: To establish the culture system of hai ry root of Isatis indigotica and to induce the regeneration plant of hairy r oot. Methods: Hairy root of Isatis indigotica was ob tained from infected cotyledon explants after infection with Agrobacterium rhi zogenes strains A4, R1601 and ATCC15834. The better lines were selected. The g rowth curve was surveyed and extrinsic factors affecting the growth of hairy roo ts were investigated. The regeneration plant was induced on MS media with differ ent hormones. The transformation of Ri T-DNA was examined through high voltage paper electrophoresis. Results: The hairy root was originally ob tained from Isatis indigotica. The regeneration plant was induced on MS medi a with BA. The result of high voltage paper electrophoresis confirmed the transf ormation of T-DNA from Ri plasmid to the hairy root and regeneration plant. Conclusion: The acquisition of hairy root of Isatis indigotica and regeneration plant of it lay a foundation for the production of active compo nent and introduction of foreign gene.
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[KEY WORDS] Agrobacterium rhizogenes; hairy root; Isatis indigo tica; regeneration plant
自从发根农杆菌Ri质粒被人们发现和认识以来，它在许多领域都显示出极其广泛的应用 前景，首先它是植物基因工程理想的载体，以Ri质粒为载体可将抗虫、抗病基因或其他我们 感兴趣的基因转移到植物基因组并得到表达，从而达到改良植物性状、提高品质的目的。其 次，利用发根农杆菌转化植物产生的毛状根建立离体培养系统，实现次生代谢物质的工业化 生产以解决中药资源的短缺问题。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长快速、不 需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点 [1]。我们利用发根农杆菌Ri质粒首次成功地从菘蓝中诱导出毛状根，筛选出了各自 的、生长快速的优质株系，建立了毛状根离体培养系统，为利用毛状根进行次生代谢物质的 生产打下了基础。我们通过适当的激素诱导，获得了再生植株，为进一步引进外源基因改良 性状、提高品质奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 发根农杆菌的活化 将三种发根农杆菌菌株A4，R1601和AT CC15834 于-20℃保存在灭菌甘油中，临用前于YEB固体培养基、25℃活化3次，然后转至YEB 培养液(R1601的培养液中加入200 mg/L卡那霉素)，于黑暗、25℃,100 r/min振荡培养，1 2 h后用于感染外植体[1]。
1.2 植物材料 菘蓝种子由上海崇明新海农场提供，并经本室乔传卓教授鉴定。 取菘蓝种子用清水洗净，在75%乙醇中浸泡1 min,用清水冲净乙醇，再用0.1% HgCl2消毒1 0 min，无菌水冲洗5次，置于MS培养基上，5 d后萌发。取生长3 d左右的无菌苗的子叶作为 外植体，于MS培养基上预培养24 h后用于转化。
1.3 外植体的转化 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数生长期的发根农杆 菌A4，R1601和ATCC15834菌液中，在黑暗条件下120 r/min振摇10 min，取出，用无菌滤纸 吸干多余的菌液，置于MS培养基上共培养24 h后移至含300 mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基 上培养，25℃，光照12 h/d，光强度2 000 lx，并以未经感染的子叶作对照。
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1.4 毛状根的除菌 将感染后长出的毛状根剪下移到新的含300 mg/L头孢噻肟钠 的MS固体培养基上培养，每5 d转接1次，转接3次以后，将培养瓶放入39.5℃的恒温箱中除 菌，48 h后将毛状根取出移到不含抗生素的MS培养基上。
1.5 毛状根优质株系的筛选 将MS培养基上的毛状根逐一分开，挑取2 cm左右者 移入1/2 MS培养液中，35 ml培养液/三角锥瓶(50 ml)，每瓶1根，20 d后观察生长情况，挑 选生长迅速的进行继代培养。
1.6 毛状根生长曲线的测定 取毛状根的优质株系在1/2 MS培养液中进行测定，3 5 ml培养液/三角锥瓶(50 ml)，共30瓶,每4 d测1次鲜质量与干质量，每次测3瓶，以平均质 量为指标绘制生长曲线。鲜质量系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得，干质量系60℃烘12 h 后测得。
1.7 甘露碱的检测 取菘蓝毛状根100 mg，按Morgan等[2]的方法进行高 压纸电泳分析,以试管苗的正常根为阴性对照，甘露碱标准品(1 mg/ml)为阳性对照。
, 百拇医药
1.8 毛状根的植株再生 将菘蓝毛状根剪取长3 cm左右的根尖，置于添加有不同 配比的苄基腺嘌呤(BA)和α-萘乙酸(NAA)的MS培养基上，诱导不定芽，每个处理组20 个根尖。当不定芽长至1～2 cm时，将其剪下，移至生根培养基中生根，生根培养基是在MS 基本培养基中添加下列激素：①NAA 0.5 mg/L;②吲哚丁酸(IBA)0.5 mg/L;③NAA和IBA各0 .2 mg/L。
1.9 再生植株的甘露碱检测 取再生植株的叶片100 mg,方法同毛状根的甘露碱检 测。
2 结 果
2.1 毛状根的获得 经发根农杆菌感染，菘蓝子叶10 d后有根长出，大多数具有 典型的毛状根特征：具白色根毛，分支多，向上、贴瓶壁向上或沿培养基平长，失去向地性 (图1，见封四)。对照子叶出根率低且向下长入培养基中。20 d后统计出根率，结果见表1 ，可见A4菌株诱导率较其他两种菌株高。
, 百拇医药
表 1 3种发根农杆菌对菘蓝子叶
外植体感染的诱导率
Tab 1 Root inducing rates of Insatis indigotica
transformed by 3 kinds of A. rhizogenes
Number of
explants
Number of
rooted explants
Induction
rate (%)
, http://www.100md.com
A4
30
17
56.7
R1601
30
5
16.7
ATCC15834
30
9
30.0
Control
, 百拇医药
30
4
13.3
2.2 毛状根快速生长的优质株系的筛选 在1/2 MS培养液中培养20 d后，观察各 瓶中毛状根生长状况，选出分枝多、生长快速的毛状根的优质株系： IR5株，来源于A4菌株 。
2.3 毛状根生长速率测定 结果见表2，表明菘蓝毛状根的质量随时间的延长而快 速增加，24 d时质量达到最大, 增长20倍,以后逐步下降。表 2 菘蓝毛状根生长速率测定
Tab 2 Growth rate of the hairy
root of Isatis indigotica(x±s) Time(t/d)
, 百拇医药 Fresh(m/g)
Dry (m/g)
Increasedmu ltiples
0
0.18±0.03
0.019±0.004
0
4
0.30±0.02
0.035±0.004
1.84
8
, 百拇医药
0.64±0.04
0.074±0.003
3.89
12
1.08±0.13
0.128±0.008
6.73
16
1.79±0.23
0.191±0.010
10.05
20
, http://www.100md.com
2.71±0.22
0.273±0.018
14.37
24
3.65±0.20
0.386±0.018
20.32
28
3.28±0.13
0.342±0.022
18.00
2.4 毛状根诱导植株再生 BA对诱导毛状根的植株再生效果最好，单独使用或与N AA配合使用均能诱导再生不定芽；NAA对毛状根的愈伤组织诱导效果较好，结果见表3。菘蓝 毛状根在含BA的培养基上培养，20 d后开始有毛状根变绿、变粗，1个月后转变成不定芽， 没有经过愈伤组织阶段。将不定芽移到生根培养基上培养，获得再生植株，再生植株同正常 植株相比，根系普遍生长迅速、多根毛、多分枝、缺乏向地性、大部分根着生在培养基平面 以上，其余部分同正常植株无明显差别(图2，见封四)。
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2.5 毛状根中甘露碱的检测结果 高压纸电泳检测结果表明菘蓝毛状根中含有甘 露碱，说明毛状根中确已含有农杆菌Ri质粒转入的T-DNA(图3，见封四)。对照正常根的 高压纸电泳图谱无甘露碱斑点。
表 3 不同的激素对菘蓝毛状根不定
芽和愈伤组织诱导的影响
Tab 3 Effect of different hormones on the differentiation
of hairy root of Isatis indigotica Auxins(ρB/mg*L-1)
Growth state
of buds
, http://www.100md.com
Growth state
of callus
BA (0.2)
+
-
BA (0.5)
++
-
BA (1.0)
+++
-
BA (2.0)
+++
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-
NAA(0.2)
-
++
NAA(0.5)
-
++
NAA(1.0)
+
+++
NAA(2.0)
-
++
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BA(1.0)+NAA(0.2)
+++
++
Control
+
-
-: No growth; +: Growth; ++: Obvious growth;
+++: Extremely obvious growth
3 讨 论
农杆菌诱导获得的毛状根中共生有大量农杆菌，必须除去农杆菌以使毛状根大量、快速 生长。除去农杆菌的方法一般是采用抗生素除菌培养，但因为抗生素对毛状根的生长有影响 ，有时还会导致愈伤组织化，所以有人采用温度除菌法[3]。本研究经过反复摸索 条件，认为采用抗生素除菌和温度法相结合，除菌效果较好，即将共生有农杆菌的毛状根在 含300 mg/L头孢噻肟钠的MS培养基上经过3次继代培养，农杆菌的生长受到了抑 制，而毛状根的生长状态较为良好，这时将培养瓶置39.5℃的恒温箱中除菌48 h。该方法简 单有效，对毛状根影响不大。
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有研究认为，发根农杆菌的转化只发生在细胞分裂的S期(即DNA合成期)，因此幼嫩的 、生长旺盛的组织对农杆菌更敏感，这也是我们选择无菌幼苗的子叶作为外植体的原因。 由于一条毛状根起源于一个细胞[4]，所以我们把获得的毛状根逐一分开，作为 单克隆进行培养。这样的培养物性能稳定，有利于提供稳定的次生代谢产物。
通常认为转化植株具有侧根高度发达且失去向地性、叶片皱缩、节间缩短等异常表型 [5]。本研究获得的菘蓝转化植株的根系具有多根毛、多分枝、失去向地性等异常表 型，但未观察到叶片皱缩、节间缩短等异常表型，这同董金兰等[6]在甘草毛状根 的再生植株，卜学贤等[7]在毛白杨毛状根的再生植株中观察到的结果相一致。
植物激素在毛状根的植株再生过程中起着关键的作用。本研究结果表明，BA对菘蓝毛状 根的植株再生的作用最为重要，这与何玉科[8]在甘蓝毛状根植株再生中观察到的 结果相一致。 [基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39870919).
, 百拇医药
[作者简介] 许铁峰(1971-)，男(汉族)，博士生.
[参 考 文 献]
[1] 王关林. 发根农杆菌Ri质粒载体转化. 见:王关林,方宏筠 主编. 植物 基因工程原理与技术[M]. 北京:科学出版社, 1998. 237-238.
[2] Morgan AJ, Cox PN, Turner DA, et al. Transformation of tomato usi ng an Ri plasmid vector[J]. Plant Sci,1987,49(1):37-44.
[3] 张荫麟,周新华,杨 岚,等. 甘草的发状根培养[J]. 中草药, 1990,21(12): 23-26.
[4] 戴均贵,朱蔚华. 发根培养技术在植物次生代谢产物生产中的应用[J]. 植物 生理学通讯,1999,35(1):69-75.
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[5] 张荫麟,宋经元,祁建军,等. 农杆菌转化后植株再生[J]. 中国中药杂志,199 7,22(5):274-275.
[6] 董金兰,李洪泉,李红卫. Ri质粒介导的DNA转移及诱发甘草毛状根植株再生[J ]. 生物技术,1991,1(1):21-28.
[7] 卜学贤,林忠平,陈维伦. 农杆菌对毛白杨的转化及完整转化植株的获得[J] . 植物学报,1991,33(3):206-212.
[8] 何玉科. 甘蓝Ri T-DNA转化根的植株再生[J]. 生物工程学报, 1990,6(2): 120-125.
[收稿日期] 2000-06-09
[修回日期] 2000-07-20, 百拇医药
单位：许铁峰(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；张汉明(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；张威(哈尔滨医科大学生理学教研室)；丁如贤(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；李博华(第二军医大学科研部国际合作肿瘤研究所)
关键词：发根农杆菌；毛状根；菘蓝；再生植株
第二军医大学学报001003 [摘要] 目的：建立菘蓝(Isatis indig otica Fort)的毛状根离体培养系统，并诱导毛状根再生植株。方法：分别用发根农杆菌A4，R1601和ATCC15834三种菌株感染菘蓝的子叶外植体，获得毛状根， 并筛选了优质株系；测定了毛状根的生长曲线；在含不同激素的培养基上诱导毛状根再生植 株；利用高压纸电泳法对毛状根和再生植株进行T-DNA转化的检测。结果：首次利用发根农杆菌A4，R1601和ATCC15834三种菌株成功地从菘蓝中诱导出毛状根； 菘蓝毛状根在含BA的MS培养基中成功地诱导出再生植株；经高压纸电泳检测，菘蓝毛状根及 其再生植株中均含有甘露碱，表明Ri质粒的T-DNA已整合进毛状根和再生植株中。 结论：菘蓝毛状根离体培养和植株再生系统的建立，为进一步进行药用活性成 分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基础。
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[中图分类号] R 282.71 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0907-03
Establishing better lines and regenerating system of hairy roots of Isatis in digotica with Ri T-DNA
XU Tie-Feng, ZHANG Han-Ming,DING Ru-Xian
(Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
ZHANG Wei
, 百拇医药
(Department of Physiology, Harbin Medical University)
LI Bo-Hua
(International Joint Cancer Institute， Department of Science Research, Second Military Medical University)
[ABSTRACT] Objective: To establish the culture system of hai ry root of Isatis indigotica and to induce the regeneration plant of hairy r oot. Methods: Hairy root of Isatis indigotica was ob tained from infected cotyledon explants after infection with Agrobacterium rhi zogenes strains A4, R1601 and ATCC15834. The better lines were selected. The g rowth curve was surveyed and extrinsic factors affecting the growth of hairy roo ts were investigated. The regeneration plant was induced on MS media with differ ent hormones. The transformation of Ri T-DNA was examined through high voltage paper electrophoresis. Results: The hairy root was originally ob tained from Isatis indigotica. The regeneration plant was induced on MS medi a with BA. The result of high voltage paper electrophoresis confirmed the transf ormation of T-DNA from Ri plasmid to the hairy root and regeneration plant. Conclusion: The acquisition of hairy root of Isatis indigotica and regeneration plant of it lay a foundation for the production of active compo nent and introduction of foreign gene.
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[KEY WORDS] Agrobacterium rhizogenes; hairy root; Isatis indigo tica; regeneration plant
自从发根农杆菌Ri质粒被人们发现和认识以来，它在许多领域都显示出极其广泛的应用 前景，首先它是植物基因工程理想的载体，以Ri质粒为载体可将抗虫、抗病基因或其他我们 感兴趣的基因转移到植物基因组并得到表达，从而达到改良植物性状、提高品质的目的。其 次，利用发根农杆菌转化植物产生的毛状根建立离体培养系统，实现次生代谢物质的工业化 生产以解决中药资源的短缺问题。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长快速、不 需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点 [1]。我们利用发根农杆菌Ri质粒首次成功地从菘蓝中诱导出毛状根，筛选出了各自 的、生长快速的优质株系，建立了毛状根离体培养系统，为利用毛状根进行次生代谢物质的 生产打下了基础。我们通过适当的激素诱导，获得了再生植株，为进一步引进外源基因改良 性状、提高品质奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 发根农杆菌的活化 将三种发根农杆菌菌株A4，R1601和AT CC15834 于-20℃保存在灭菌甘油中，临用前于YEB固体培养基、25℃活化3次，然后转至YEB 培养液(R1601的培养液中加入200 mg/L卡那霉素)，于黑暗、25℃,100 r/min振荡培养，1 2 h后用于感染外植体[1]。
1.2 植物材料 菘蓝种子由上海崇明新海农场提供，并经本室乔传卓教授鉴定。 取菘蓝种子用清水洗净，在75%乙醇中浸泡1 min,用清水冲净乙醇，再用0.1% HgCl2消毒1 0 min，无菌水冲洗5次，置于MS培养基上，5 d后萌发。取生长3 d左右的无菌苗的子叶作为 外植体，于MS培养基上预培养24 h后用于转化。
1.3 外植体的转化 将上述预培养的外植体分别浸入处于对数生长期的发根农杆 菌A4，R1601和ATCC15834菌液中，在黑暗条件下120 r/min振摇10 min，取出，用无菌滤纸 吸干多余的菌液，置于MS培养基上共培养24 h后移至含300 mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基 上培养，25℃，光照12 h/d，光强度2 000 lx，并以未经感染的子叶作对照。
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1.4 毛状根的除菌 将感染后长出的毛状根剪下移到新的含300 mg/L头孢噻肟钠 的MS固体培养基上培养，每5 d转接1次，转接3次以后，将培养瓶放入39.5℃的恒温箱中除 菌，48 h后将毛状根取出移到不含抗生素的MS培养基上。
1.5 毛状根优质株系的筛选 将MS培养基上的毛状根逐一分开，挑取2 cm左右者 移入1/2 MS培养液中，35 ml培养液/三角锥瓶(50 ml)，每瓶1根，20 d后观察生长情况，挑 选生长迅速的进行继代培养。
1.6 毛状根生长曲线的测定 取毛状根的优质株系在1/2 MS培养液中进行测定，3 5 ml培养液/三角锥瓶(50 ml)，共30瓶,每4 d测1次鲜质量与干质量，每次测3瓶，以平均质 量为指标绘制生长曲线。鲜质量系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得，干质量系60℃烘12 h 后测得。
1.7 甘露碱的检测 取菘蓝毛状根100 mg，按Morgan等[2]的方法进行高 压纸电泳分析,以试管苗的正常根为阴性对照，甘露碱标准品(1 mg/ml)为阳性对照。
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1.8 毛状根的植株再生 将菘蓝毛状根剪取长3 cm左右的根尖，置于添加有不同 配比的苄基腺嘌呤(BA)和α-萘乙酸(NAA)的MS培养基上，诱导不定芽，每个处理组20 个根尖。当不定芽长至1～2 cm时，将其剪下，移至生根培养基中生根，生根培养基是在MS 基本培养基中添加下列激素：①NAA 0.5 mg/L;②吲哚丁酸(IBA)0.5 mg/L;③NAA和IBA各0 .2 mg/L。
1.9 再生植株的甘露碱检测 取再生植株的叶片100 mg,方法同毛状根的甘露碱检 测。
2 结 果
2.1 毛状根的获得 经发根农杆菌感染，菘蓝子叶10 d后有根长出，大多数具有 典型的毛状根特征：具白色根毛，分支多，向上、贴瓶壁向上或沿培养基平长，失去向地性 (图1，见封四)。对照子叶出根率低且向下长入培养基中。20 d后统计出根率，结果见表1 ，可见A4菌株诱导率较其他两种菌株高。
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表 1 3种发根农杆菌对菘蓝子叶
外植体感染的诱导率
Tab 1 Root inducing rates of Insatis indigotica
transformed by 3 kinds of A. rhizogenes
Number of
explants
Number of
rooted explants
Induction
rate (%)
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A4
30
17
56.7
R1601
30
5
16.7
ATCC15834
30
9
30.0
Control
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30
4
13.3
2.2 毛状根快速生长的优质株系的筛选 在1/2 MS培养液中培养20 d后，观察各 瓶中毛状根生长状况，选出分枝多、生长快速的毛状根的优质株系： IR5株，来源于A4菌株 。
2.3 毛状根生长速率测定 结果见表2，表明菘蓝毛状根的质量随时间的延长而快 速增加，24 d时质量达到最大, 增长20倍,以后逐步下降。表 2 菘蓝毛状根生长速率测定
Tab 2 Growth rate of the hairy
root of Isatis indigotica(x±s) Time(t/d)
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Dry (m/g)
Increasedmu ltiples
0
0.18±0.03
0.019±0.004
0
4
0.30±0.02
0.035±0.004
1.84
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0.64±0.04
0.074±0.003
3.89
12
1.08±0.13
0.128±0.008
6.73
16
1.79±0.23
0.191±0.010
10.05
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2.71±0.22
0.273±0.018
14.37
24
3.65±0.20
0.386±0.018
20.32
28
3.28±0.13
0.342±0.022
18.00
2.4 毛状根诱导植株再生 BA对诱导毛状根的植株再生效果最好，单独使用或与N AA配合使用均能诱导再生不定芽；NAA对毛状根的愈伤组织诱导效果较好，结果见表3。菘蓝 毛状根在含BA的培养基上培养，20 d后开始有毛状根变绿、变粗，1个月后转变成不定芽， 没有经过愈伤组织阶段。将不定芽移到生根培养基上培养，获得再生植株，再生植株同正常 植株相比，根系普遍生长迅速、多根毛、多分枝、缺乏向地性、大部分根着生在培养基平面 以上，其余部分同正常植株无明显差别(图2，见封四)。
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2.5 毛状根中甘露碱的检测结果 高压纸电泳检测结果表明菘蓝毛状根中含有甘 露碱，说明毛状根中确已含有农杆菌Ri质粒转入的T-DNA(图3，见封四)。对照正常根的 高压纸电泳图谱无甘露碱斑点。
表 3 不同的激素对菘蓝毛状根不定
芽和愈伤组织诱导的影响
Tab 3 Effect of different hormones on the differentiation
of hairy root of Isatis indigotica Auxins(ρB/mg*L-1)
Growth state
of buds
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Growth state
of callus
BA (0.2)
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BA (0.5)
++
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BA (1.0)
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+++: Extremely obvious growth
3 讨 论
农杆菌诱导获得的毛状根中共生有大量农杆菌，必须除去农杆菌以使毛状根大量、快速 生长。除去农杆菌的方法一般是采用抗生素除菌培养，但因为抗生素对毛状根的生长有影响 ，有时还会导致愈伤组织化，所以有人采用温度除菌法[3]。本研究经过反复摸索 条件，认为采用抗生素除菌和温度法相结合，除菌效果较好，即将共生有农杆菌的毛状根在 含300 mg/L头孢噻肟钠的MS培养基上经过3次继代培养，农杆菌的生长受到了抑 制，而毛状根的生长状态较为良好，这时将培养瓶置39.5℃的恒温箱中除菌48 h。该方法简 单有效，对毛状根影响不大。
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有研究认为，发根农杆菌的转化只发生在细胞分裂的S期(即DNA合成期)，因此幼嫩的 、生长旺盛的组织对农杆菌更敏感，这也是我们选择无菌幼苗的子叶作为外植体的原因。 由于一条毛状根起源于一个细胞[4]，所以我们把获得的毛状根逐一分开，作为 单克隆进行培养。这样的培养物性能稳定，有利于提供稳定的次生代谢产物。
通常认为转化植株具有侧根高度发达且失去向地性、叶片皱缩、节间缩短等异常表型 [5]。本研究获得的菘蓝转化植株的根系具有多根毛、多分枝、失去向地性等异常表 型，但未观察到叶片皱缩、节间缩短等异常表型，这同董金兰等[6]在甘草毛状根 的再生植株，卜学贤等[7]在毛白杨毛状根的再生植株中观察到的结果相一致。
植物激素在毛状根的植株再生过程中起着关键的作用。本研究结果表明，BA对菘蓝毛状 根的植株再生的作用最为重要，这与何玉科[8]在甘蓝毛状根植株再生中观察到的 结果相一致。 [基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39870919).
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[作者简介] 许铁峰(1971-)，男(汉族)，博士生.
[参 考 文 献]
[1] 王关林. 发根农杆菌Ri质粒载体转化. 见:王关林,方宏筠 主编. 植物 基因工程原理与技术[M]. 北京:科学出版社, 1998. 237-238.
[2] Morgan AJ, Cox PN, Turner DA, et al. Transformation of tomato usi ng an Ri plasmid vector[J]. Plant Sci,1987,49(1):37-44.
[3] 张荫麟,周新华,杨 岚,等. 甘草的发状根培养[J]. 中草药, 1990,21(12): 23-26.
[4] 戴均贵,朱蔚华. 发根培养技术在植物次生代谢产物生产中的应用[J]. 植物 生理学通讯,1999,35(1):69-75.
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[5] 张荫麟,宋经元,祁建军,等. 农杆菌转化后植株再生[J]. 中国中药杂志,199 7,22(5):274-275.
[6] 董金兰,李洪泉,李红卫. Ri质粒介导的DNA转移及诱发甘草毛状根植株再生[J ]. 生物技术,1991,1(1):21-28.
[7] 卜学贤,林忠平,陈维伦. 农杆菌对毛白杨的转化及完整转化植株的获得[J] . 植物学报,1991,33(3):206-212.
[8] 何玉科. 甘蓝Ri T-DNA转化根的植株再生[J]. 生物工程学报, 1990,6(2): 120-125.
[收稿日期] 2000-06-09
[修回日期] 2000-07-20, 百拇医药