Bcl-xl和Bcl-2基因在人和兔心肌细胞中的同源性研究
作者：马中富 马虹 高劲松 何建桂 叶任高 罗斌 何蕴韶
单位：马中富(中山医科大学附属第一医院急诊科，广州 510080)；马虹 高劲松 何建桂(心内科)；叶任高(肾内科)；罗斌 何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心)
关键词：Bcl-xl；Bcl-2；兔；人；同源性
中国急救医学001002 [摘要] 目的 探讨兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性。方法 用人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列来扩增兔心肌细胞的DNA，纯化其扩增产物，然后进行测序，再测定人与兔心肌细胞内Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性。结果 兔心肌细胞内Bcl-xl基因的扩增产物长度为162个碱基，与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较，在扩增的159个碱基片段中有151个碱基相同，其同源性为95.0%；而兔心肌细胞内Bcl-2基因的扩增产物长度为288个碱基，与人类Bcl-2基因mRNA的碱基序列进行比较，在扩增的199个碱基片段中有176个碱基相同，其同源性为88.4%。结论 兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl-2基因有很好的同源性，在研究兔心肌细胞这两种基因的改变时，完全可以用人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列(引物)来扩增，为今后的进一步研究提供理论基础。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 25；Q 786 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)10-0570-03
Study of Bcl-xl and Bcl-2 gene homogenous in rabbit cardiac myocytes and human karyotes
MA Zhoug-fu
(Emergency Department,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
MA Hong
(Emergency Department,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
GAO Jin-song,et al
(Emergency Department,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
[Abstract] Objective To investigate Bcl-xl and Bcl-2 gene homogeneity in rabbit cardiac myocytes and human karyotes.Methods DNA in rabbit cardiac myocytes were amplificated by using human Bcl-xl gene and Bcl-2 gene sequence.The amplificated products of DNA in rabbit myocytes were purificated before sequenced.The homogenous of Bcl-xl gene and Bcl-2 gene in rabbit myocardial cells and human karyotes were analysed.Results The length of the amplificated products of Bcl-xl gene in rabbit myocardial cells was 162 bases.The 95.0% of Bcl-xl gene in rabbit myocytes was homogeneous with human Bcl-xl gene in 159 bases sequences.And the length of the amplificated products of Bcl-2 gene in rabbit myocardial cells was 288 bases.The 88.4% of Bcl-2 gene in rabbit myocytes was homogenous with human Bcl-2 gene in 199 bases.Conclusions There were good homogeneities of Bcl-xl gene and Bcl-2 gene in between rabbit myocytes and human karyotes.Human Bcl-xl and Bcl-2 gene sequence,therefore,is completely used to amplificate both genes in rabbit cardiac myocytes when studying,which offerefore,basic theory for further study.
, 百拇医药
[Key words] Bcl-xl; Bcl-2; Rabbit; Human; Homogeneity
生物体在进化过程中，存在着染色体的高度同源性，大部分基因亦存在着不同程度的同源性，来调控不同种类的生物体包括动物和人类的组织细胞生长发育、成熟、衰老、增殖和死亡[1～4]。为探讨兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性，本文应用人的Bcl-xl和Bcl-2基因来扩增兔心肌细胞的DNA，然后再进行测序，首次测定了兔与人心肌细胞内Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 取新西兰兔1只，雄性，体重2.23 kg，3%戊巴比妥(1 ml/kg)腹腔内麻醉后，固定于手术台上，常规消毒，铺巾，剪毛，切开颈部皮肤，无菌下行气管切开，插入3号气管插管，固定后接电动呼吸机，常规切开胸骨、心包，暴露出心脏，切取心脏，放于无菌的生理盐水碗中，立即取下1 mm3的左心室肌4～5块，置-70℃冰箱下冷藏用于分子生物学实验。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞DNA提取 取-70℃下冻存的兔心肌块约1 g，剪碎，加入630 μl TE溶液，液氮下磨成匀浆，收集匀浆，加入30 μl 10% SDS和70 μl蛋白酶K(终浓度为0.1 mg/ml)，充分混匀于55℃水浴下放置3h→离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→沉淀中加700 μl重蒸酚-氯仿(酚氯仿＝11)提取液，抽提DNA，摇匀后离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→取上清液，再一次加入700 μl氯仿提取液抽提DNA 1次，离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→沉淀中加70 μl氯仿混匀后离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→取上清液，加入700 μl 3 mol/L醋酸钠和700 μl无水乙醇混匀后离心(4℃，12 000 r/min)5分钟→去上清液，沉淀用70%的乙醇洗1次后，离心(4℃，12 000 r/min)5分钟→去上清液，干燥后加入TE液溶解DNA，于DNA的琼脂糖凝胶上电泳。
, 百拇医药
1.2.2 兔心肌细胞Bcl-xl、Bcl-2基因引物的设计
通过GenBank、Mediline和中国生物医学数据库光盘检索(检索词：Bcl-2、Bcl-xl和Rabbit、兔和PCR，兔)，未查到兔的Bcl-2和Bcl-xl基因的引物序列，故用人的Bcl-xl和Bcl-2基因引物，来扩增兔心肌细胞的DNA，然后将PCR产物进行纯化后测序，观察其与人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列的同源性，实验方法如下：人有核细胞Bcl-xl、Bcl-2基因引物的设计：人野生型Bcl-xl引物由中山医科大学达安基因诊断中心生物医学实验部惠赠，根据人类Bcl-xl基因DNA全序列[5](GenBank Acc.U72398)设计合成，其序列为：F 5′-CGACGAGTTTGAACTGCGGTA-3′，其位点为416～436，R 5′-TCTACGCTTTCCACGCACAGT-3′,其位点为585～601，扩增长度为185 bp，使用浓度为10 nmol/ml。人Bcl-2引物是根据人类淋巴细胞上Bcl-2 mRNA全序列[2](GenBank M14745)而设计的，序列为：F：5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3′位点为621～641，R：5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，位点为963～938，由上海生工生物工程公司合成，扩增长度为317 bp，使用浓度为10 nmol/ml。
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR 将兔心肌细胞内的DNA与人的Bcl-xl基因和Bcl-2基因引物在PCR仪(Perkin Elmer公司产Gene Amp PCR System 9600扩增仪)上进行扩增。反应体系：Bcl-xl(反应体积为30 μl)：5×PCR Reaction Buffer 6 μl,2 mmol/L dNTP 3 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶(1 U/μl)1.5 μl，模板DNA 2.5 μl，双蒸水15 μl，混匀后加入适量石蜡油离心数秒钟后扩增。Bcl-2(30 μl)：5×PCR Reaction Buffer 6 μl,2 mmol/L dNTP 3 μl,上、下游引物各1 μl，模板DNA 2.5 μl，Taq酶(1 U/μl)1.5 μl，双蒸水15 μl，混匀后加入适量石蜡油离心数秒钟后扩增。扩增条件：Bcl-xl：94℃预变性8分钟，然后按93℃45秒→56℃45秒→72℃60秒，共做30个循环，最后置72℃ 7分钟延伸。Bcl-2:94℃预变性3分钟，然后按94℃45秒→57℃45秒→72℃60秒，共做30个循环，最后置72℃5分钟延伸。取上述各反应管中PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，并观察条带，见图1，2。
, 百拇医药
1.2.4 测序 将扩增后PCR产物进行割胶纯化测序。a.用3 mol/L醋酸钠和无水乙醇沉淀PCR产物，所得沉淀溶解在20 μl水中。b.将20 μl产物进行电泳割胶，回收特异性条带，用Qiagen公司纯化试剂盒(Qiaex Ⅱ Gel,Extraction Kit)纯化样品。c.收纯化后样品进行紫外法定量，取30～90 ng样品作为测序模板。d.进行PCR循环测序反应，反应体系(20 μl)均为引物2 μl，模板PCR产物4 μl，混合反应液8 μl(达安公司产品)，H2O 6 μl。反应条件：96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 4分钟，共做25个循环。e.反应结束后用3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)及无水乙醇沉淀反应液，将所得沉淀溶解在25 μl变性剂中，95℃变性3分钟。f.在美国PE公司产的ABI 310型测序仪上进行测序，数据收集和分析得到测序结果，见图1，2。
图1 正常兔心肌细胞Bcl-xl基因扩增产物测序结果
, 百拇医药
图2 正常兔心肌细胞Bcl-2基因扩增产物测序结果
1.2.5 检测兔与人Bcl-xl基因与Bcl-2基因的同源性 将上述测序结果即兔心肌细胞的Bcl-xl基因和Bcl-2基因的DNA序列在Internal网GenBank中的BLAST Search上进行自动检查，测其同源性。
2 结果
2.1 兔心肌细胞内Bcl-xl基因的扩增产物长度为162个碱基，即-CGGCGGGCATTCAGCGACTGACATCC
CAGCTCCACATCACCCCAGGGACAGCATATCAGAGCTT
TGAACAAGTAGTGAACGAACTCTCCGGGATGGGGTGAA
CTGGGGCCGCATTGTGGCCTTTTTCTCCTTCGGCGGGGC
, http://www.100md.com
ACTGTGCATGGAAAGCTTAAA-。与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较，在扩增的159个碱基片段中有151个碱基相同，其同源性为95.0%，结果见表1。
2.2 兔心肌细胞内Bcl-2基因的扩增产物长度为288个碱基，即-CATCGTGCGGCTCTGTCAGACTTCTCC
TGGGTGTCTCTGAAGATTTGTTCAGCCTGGCCCTGATAG
GACGCTTGCATCACCCTCGGTGCCTACCTGGGCCACAAG
TGAAGACACCAGGCCTGCCCCCCACATGATATGCAAAC
AGTTCACGAAAGCAGGAGACATGATATGCATTGTCAGT
, 百拇医药
GCCGCCCCATGCAACGCAGCTGGCTCTGTGAAGCGAGA
GCCAGCAAGCCCCACGCGTACACAAAACAGCTTTCAGG
CAAAATGTCGAATCATCTATTTACTGCCAAA G-。与人类Bcl-2基因mRNA的碱基序列进行比较，在扩增的199(161+38)个碱基片段中有176(139+37)个碱基相同，其同源性为88.4%，结果见表2。
表1 与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较
E=Retrieve Entrek links (e.g, Medline abstracts, FASTA-formatted sequence reports); R=Retrieve Entrez links to Related sequences (neighbors); S=Retrieve SRS links (if present)。表2 与人类Bcl-2基因mRNA的碱基序列进行比较
, 百拇医药
E=Retrieve Entrek links (e.g, Medline abstracts, FASTA-formatted sequence reports); R=Retrieve Entrez links to Related sequences (neighbors); S=Retrieve SRS links (if present)。
3 讨论
Zimonjic等[1]研究发现，角质细胞生长因子(KGF)基因在人类、狒狒和猩猩的15、21号染色体上分别有5个、4个和2个相同的位点，其结构和功能完全一致。作者认为KGF基因在人类和狒狒与猩猩中有高度的同源性。Cleary等[2]发现，从人类急性淋巴细胞白血病中分离出来的Bcl-2基因所编码的蛋白质与EB病毒蛋白质BHRF1有高度的同源性。Le Goas等[3]用鼠p53引物嵌入到兔脾脏的λ ZAP 2 cDNA文库中以后，进行RT-PCR，将其产物导入到噬菌体中复制、杂交，然后再纯化噬菌体，得到兔p53的cDNA，再将之与人和鼠的p53基因碱基序列对照，发现兔p53 cDNA与人类p53 cDNA有80%的同源序列，与鼠p53基因中碱基序列有80%的同源性，这与白细胞Ⅰ型抗原(HLA-1)基因在上述种族中观察到的结果相似。作者认为兔p53基因与人类p53基因的同源性，比与鼠基因的同源性更高。Aoyagi等[4]用人p53基因cDNA探针原位杂交兔颈总动脉急性损伤后血管平滑肌细胞中的p53基因，测其表达情况，发现增厚的血管内膜层中平滑肌细胞内p53基因表达呈强阳性，人p53基因表达能反映出兔的血管平滑肌细胞中p53基因的表达情况，提示人类p53基因与兔的p53基因有较好的同源性。
, 百拇医药
本课题首次用一段人的Bcl-xl及Bcl-2基因序列(引物)来扩增免心肌细胞中的DNA，分别得到其特异性条带之后进行割胶纯化，再测其扩增片段的碱基序列，将之在GenBank中BLAST search上与人类Bcl-xl和Bcl-2基因序列进行对照，结果显示，兔心肌细胞Bcl-xl基因在扩增的159个碱基片段中，与人类Bcl-xl基因的碱基序列有95.0%的同源性；兔心肌细胞Bcl-2基因在扩增的199个碱基片段中，与人类Bcl-2基因mRNA序列有88.4%的同源性。因此在研究兔心肌细胞这两种基因的改变时，完全可以用人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列(引物)来扩增，为今后的进一步研究提供理论基础。
[基金项目] 卫生部基金资助项目(1996-1-116)
[参考文献]
[1]Zimonjic DB,Kelley MJ,Rubin JS,et al.Fluorescence in situ hybridization analysis of keratinocyte growth factor gene amplification and dispersion in evolution of great apes and humans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:11461-11465.
, http://www.100md.com
[2]Cleary ML,Smith SD,Sklar J.Cloning and structural analysis of cDNAs for bcl-2 and a hybrid bcl-2/immunoglabulin transcript resulting from the t(14,18)translocation[J].Cell，1986,47:19-28.
[3]Le Goas F,May P,Ronco P,et al.cDNA cloning and immunological characterization of rabbit p53[J]. Gene,1997,185:169-173.
[4]Aoyagi M,Yamamoto M,Azuma H,et al.Expression of p53 protein and p53 gene transcripts in rabbit carotid arteries after ballon denudation[J]. Histochem Cell Biol,1997,107:365-370.
[5]Aitschui,Stephen F,Madden TL,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Res,1997,25:3389-3402.
[收稿：2000-08-02], 百拇医药
单位：马中富(中山医科大学附属第一医院急诊科，广州 510080)；马虹 高劲松 何建桂(心内科)；叶任高(肾内科)；罗斌 何蕴韶(中山医科大学达安基因诊断中心)
关键词：Bcl-xl；Bcl-2；兔；人；同源性
中国急救医学001002 [摘要] 目的 探讨兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性。方法 用人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列来扩增兔心肌细胞的DNA，纯化其扩增产物，然后进行测序，再测定人与兔心肌细胞内Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性。结果 兔心肌细胞内Bcl-xl基因的扩增产物长度为162个碱基，与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较，在扩增的159个碱基片段中有151个碱基相同，其同源性为95.0%；而兔心肌细胞内Bcl-2基因的扩增产物长度为288个碱基，与人类Bcl-2基因mRNA的碱基序列进行比较，在扩增的199个碱基片段中有176个碱基相同，其同源性为88.4%。结论 兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl-2基因有很好的同源性，在研究兔心肌细胞这两种基因的改变时，完全可以用人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列(引物)来扩增，为今后的进一步研究提供理论基础。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 25；Q 786 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)10-0570-03
Study of Bcl-xl and Bcl-2 gene homogenous in rabbit cardiac myocytes and human karyotes
MA Zhoug-fu
(Emergency Department,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
MA Hong
(Emergency Department,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
, 百拇医药
GAO Jin-song,et al
(Emergency Department,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China)
[Abstract] Objective To investigate Bcl-xl and Bcl-2 gene homogeneity in rabbit cardiac myocytes and human karyotes.Methods DNA in rabbit cardiac myocytes were amplificated by using human Bcl-xl gene and Bcl-2 gene sequence.The amplificated products of DNA in rabbit myocytes were purificated before sequenced.The homogenous of Bcl-xl gene and Bcl-2 gene in rabbit myocardial cells and human karyotes were analysed.Results The length of the amplificated products of Bcl-xl gene in rabbit myocardial cells was 162 bases.The 95.0% of Bcl-xl gene in rabbit myocytes was homogeneous with human Bcl-xl gene in 159 bases sequences.And the length of the amplificated products of Bcl-2 gene in rabbit myocardial cells was 288 bases.The 88.4% of Bcl-2 gene in rabbit myocytes was homogenous with human Bcl-2 gene in 199 bases.Conclusions There were good homogeneities of Bcl-xl gene and Bcl-2 gene in between rabbit myocytes and human karyotes.Human Bcl-xl and Bcl-2 gene sequence,therefore,is completely used to amplificate both genes in rabbit cardiac myocytes when studying,which offerefore,basic theory for further study.
, 百拇医药
[Key words] Bcl-xl; Bcl-2; Rabbit; Human; Homogeneity
生物体在进化过程中，存在着染色体的高度同源性，大部分基因亦存在着不同程度的同源性，来调控不同种类的生物体包括动物和人类的组织细胞生长发育、成熟、衰老、增殖和死亡[1～4]。为探讨兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性，本文应用人的Bcl-xl和Bcl-2基因来扩增兔心肌细胞的DNA，然后再进行测序，首次测定了兔与人心肌细胞内Bcl-xl和Bcl-2基因的同源性，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 取新西兰兔1只，雄性，体重2.23 kg，3%戊巴比妥(1 ml/kg)腹腔内麻醉后，固定于手术台上，常规消毒，铺巾，剪毛，切开颈部皮肤，无菌下行气管切开，插入3号气管插管，固定后接电动呼吸机，常规切开胸骨、心包，暴露出心脏，切取心脏，放于无菌的生理盐水碗中，立即取下1 mm3的左心室肌4～5块，置-70℃冰箱下冷藏用于分子生物学实验。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞DNA提取 取-70℃下冻存的兔心肌块约1 g，剪碎，加入630 μl TE溶液，液氮下磨成匀浆，收集匀浆，加入30 μl 10% SDS和70 μl蛋白酶K(终浓度为0.1 mg/ml)，充分混匀于55℃水浴下放置3h→离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→沉淀中加700 μl重蒸酚-氯仿(酚氯仿＝11)提取液，抽提DNA，摇匀后离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→取上清液，再一次加入700 μl氯仿提取液抽提DNA 1次，离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→沉淀中加70 μl氯仿混匀后离心(4℃，10 000 r/min)5分钟→取上清液，加入700 μl 3 mol/L醋酸钠和700 μl无水乙醇混匀后离心(4℃，12 000 r/min)5分钟→去上清液，沉淀用70%的乙醇洗1次后，离心(4℃，12 000 r/min)5分钟→去上清液，干燥后加入TE液溶解DNA，于DNA的琼脂糖凝胶上电泳。
, 百拇医药
1.2.2 兔心肌细胞Bcl-xl、Bcl-2基因引物的设计
通过GenBank、Mediline和中国生物医学数据库光盘检索(检索词：Bcl-2、Bcl-xl和Rabbit、兔和PCR，兔)，未查到兔的Bcl-2和Bcl-xl基因的引物序列，故用人的Bcl-xl和Bcl-2基因引物，来扩增兔心肌细胞的DNA，然后将PCR产物进行纯化后测序，观察其与人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列的同源性，实验方法如下：人有核细胞Bcl-xl、Bcl-2基因引物的设计：人野生型Bcl-xl引物由中山医科大学达安基因诊断中心生物医学实验部惠赠，根据人类Bcl-xl基因DNA全序列[5](GenBank Acc.U72398)设计合成，其序列为：F 5′-CGACGAGTTTGAACTGCGGTA-3′，其位点为416～436，R 5′-TCTACGCTTTCCACGCACAGT-3′,其位点为585～601，扩增长度为185 bp，使用浓度为10 nmol/ml。人Bcl-2引物是根据人类淋巴细胞上Bcl-2 mRNA全序列[2](GenBank M14745)而设计的，序列为：F：5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3′位点为621～641，R：5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，位点为963～938，由上海生工生物工程公司合成，扩增长度为317 bp，使用浓度为10 nmol/ml。
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR 将兔心肌细胞内的DNA与人的Bcl-xl基因和Bcl-2基因引物在PCR仪(Perkin Elmer公司产Gene Amp PCR System 9600扩增仪)上进行扩增。反应体系：Bcl-xl(反应体积为30 μl)：5×PCR Reaction Buffer 6 μl,2 mmol/L dNTP 3 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶(1 U/μl)1.5 μl，模板DNA 2.5 μl，双蒸水15 μl，混匀后加入适量石蜡油离心数秒钟后扩增。Bcl-2(30 μl)：5×PCR Reaction Buffer 6 μl,2 mmol/L dNTP 3 μl,上、下游引物各1 μl，模板DNA 2.5 μl，Taq酶(1 U/μl)1.5 μl，双蒸水15 μl，混匀后加入适量石蜡油离心数秒钟后扩增。扩增条件：Bcl-xl：94℃预变性8分钟，然后按93℃45秒→56℃45秒→72℃60秒，共做30个循环，最后置72℃ 7分钟延伸。Bcl-2:94℃预变性3分钟，然后按94℃45秒→57℃45秒→72℃60秒，共做30个循环，最后置72℃5分钟延伸。取上述各反应管中PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，并观察条带，见图1，2。
, 百拇医药
1.2.4 测序 将扩增后PCR产物进行割胶纯化测序。a.用3 mol/L醋酸钠和无水乙醇沉淀PCR产物，所得沉淀溶解在20 μl水中。b.将20 μl产物进行电泳割胶，回收特异性条带，用Qiagen公司纯化试剂盒(Qiaex Ⅱ Gel,Extraction Kit)纯化样品。c.收纯化后样品进行紫外法定量，取30～90 ng样品作为测序模板。d.进行PCR循环测序反应，反应体系(20 μl)均为引物2 μl，模板PCR产物4 μl，混合反应液8 μl(达安公司产品)，H2O 6 μl。反应条件：96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 4分钟，共做25个循环。e.反应结束后用3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)及无水乙醇沉淀反应液，将所得沉淀溶解在25 μl变性剂中，95℃变性3分钟。f.在美国PE公司产的ABI 310型测序仪上进行测序，数据收集和分析得到测序结果，见图1，2。
图1 正常兔心肌细胞Bcl-xl基因扩增产物测序结果
, 百拇医药
图2 正常兔心肌细胞Bcl-2基因扩增产物测序结果
1.2.5 检测兔与人Bcl-xl基因与Bcl-2基因的同源性 将上述测序结果即兔心肌细胞的Bcl-xl基因和Bcl-2基因的DNA序列在Internal网GenBank中的BLAST Search上进行自动检查，测其同源性。
2 结果
2.1 兔心肌细胞内Bcl-xl基因的扩增产物长度为162个碱基，即-CGGCGGGCATTCAGCGACTGACATCC
CAGCTCCACATCACCCCAGGGACAGCATATCAGAGCTT
TGAACAAGTAGTGAACGAACTCTCCGGGATGGGGTGAA
CTGGGGCCGCATTGTGGCCTTTTTCTCCTTCGGCGGGGC
, http://www.100md.com
ACTGTGCATGGAAAGCTTAAA-。与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较，在扩增的159个碱基片段中有151个碱基相同，其同源性为95.0%，结果见表1。
2.2 兔心肌细胞内Bcl-2基因的扩增产物长度为288个碱基，即-CATCGTGCGGCTCTGTCAGACTTCTCC
TGGGTGTCTCTGAAGATTTGTTCAGCCTGGCCCTGATAG
GACGCTTGCATCACCCTCGGTGCCTACCTGGGCCACAAG
TGAAGACACCAGGCCTGCCCCCCACATGATATGCAAAC
AGTTCACGAAAGCAGGAGACATGATATGCATTGTCAGT
, 百拇医药
GCCGCCCCATGCAACGCAGCTGGCTCTGTGAAGCGAGA
GCCAGCAAGCCCCACGCGTACACAAAACAGCTTTCAGG
CAAAATGTCGAATCATCTATTTACTGCCAAA G-。与人类Bcl-2基因mRNA的碱基序列进行比较，在扩增的199(161+38)个碱基片段中有176(139+37)个碱基相同，其同源性为88.4%，结果见表2。
表1 与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较
E=Retrieve Entrek links (e.g, Medline abstracts, FASTA-formatted sequence reports); R=Retrieve Entrez links to Related sequences (neighbors); S=Retrieve SRS links (if present)。表2 与人类Bcl-2基因mRNA的碱基序列进行比较
, 百拇医药
E=Retrieve Entrek links (e.g, Medline abstracts, FASTA-formatted sequence reports); R=Retrieve Entrez links to Related sequences (neighbors); S=Retrieve SRS links (if present)。
3 讨论
Zimonjic等[1]研究发现，角质细胞生长因子(KGF)基因在人类、狒狒和猩猩的15、21号染色体上分别有5个、4个和2个相同的位点，其结构和功能完全一致。作者认为KGF基因在人类和狒狒与猩猩中有高度的同源性。Cleary等[2]发现，从人类急性淋巴细胞白血病中分离出来的Bcl-2基因所编码的蛋白质与EB病毒蛋白质BHRF1有高度的同源性。Le Goas等[3]用鼠p53引物嵌入到兔脾脏的λ ZAP 2 cDNA文库中以后，进行RT-PCR，将其产物导入到噬菌体中复制、杂交，然后再纯化噬菌体，得到兔p53的cDNA，再将之与人和鼠的p53基因碱基序列对照，发现兔p53 cDNA与人类p53 cDNA有80%的同源序列，与鼠p53基因中碱基序列有80%的同源性，这与白细胞Ⅰ型抗原(HLA-1)基因在上述种族中观察到的结果相似。作者认为兔p53基因与人类p53基因的同源性，比与鼠基因的同源性更高。Aoyagi等[4]用人p53基因cDNA探针原位杂交兔颈总动脉急性损伤后血管平滑肌细胞中的p53基因，测其表达情况，发现增厚的血管内膜层中平滑肌细胞内p53基因表达呈强阳性，人p53基因表达能反映出兔的血管平滑肌细胞中p53基因的表达情况，提示人类p53基因与兔的p53基因有较好的同源性。
, 百拇医药
本课题首次用一段人的Bcl-xl及Bcl-2基因序列(引物)来扩增免心肌细胞中的DNA，分别得到其特异性条带之后进行割胶纯化，再测其扩增片段的碱基序列，将之在GenBank中BLAST search上与人类Bcl-xl和Bcl-2基因序列进行对照，结果显示，兔心肌细胞Bcl-xl基因在扩增的159个碱基片段中，与人类Bcl-xl基因的碱基序列有95.0%的同源性；兔心肌细胞Bcl-2基因在扩增的199个碱基片段中，与人类Bcl-2基因mRNA序列有88.4%的同源性。因此在研究兔心肌细胞这两种基因的改变时，完全可以用人的Bcl-xl和Bcl-2基因序列(引物)来扩增，为今后的进一步研究提供理论基础。
[基金项目] 卫生部基金资助项目(1996-1-116)
[参考文献]
[1]Zimonjic DB,Kelley MJ,Rubin JS,et al.Fluorescence in situ hybridization analysis of keratinocyte growth factor gene amplification and dispersion in evolution of great apes and humans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:11461-11465.
, http://www.100md.com
[2]Cleary ML,Smith SD,Sklar J.Cloning and structural analysis of cDNAs for bcl-2 and a hybrid bcl-2/immunoglabulin transcript resulting from the t(14,18)translocation[J].Cell，1986,47:19-28.
[3]Le Goas F,May P,Ronco P,et al.cDNA cloning and immunological characterization of rabbit p53[J]. Gene,1997,185:169-173.
[4]Aoyagi M,Yamamoto M,Azuma H,et al.Expression of p53 protein and p53 gene transcripts in rabbit carotid arteries after ballon denudation[J]. Histochem Cell Biol,1997,107:365-370.
[5]Aitschui,Stephen F,Madden TL,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Res,1997,25:3389-3402.
[收稿：2000-08-02], 百拇医药