山莨菪碱对核因子-κB活化的抑制作用
山莨菪碱对核因子-κB活化的抑制作用
郭振辉 洪新 毛宝龄 钱桂生 陈正堂
摘 要：目的 观察山莨菪碱(654-2)和脂多糖(LPS)共同处理单核细胞(M)后对核因子-κB抑制蛋白(IκB)降解和核因子-κB(NF-κB)活化的影响。方法 分离、培养M，分为正常对照组；LPS刺激组(LPS 10 μg/ml)；654-2干预组(654-2 10 ng/ml预孵育1 h后加入LPS 10 μg/ml)。分别在刺激前(0)、刺激后0.25、0.5、1和2 h，留取M。检测M中IκBα水平和核提取物中NF-κB的活性。结果 LPS刺激组IκBα水平15 min开始降低，30 min降到最低值；NF-κB活性峰值显著高于刺激前和正常对照组(P<0.01)。654-2干预后，IκBα水平最低值，显著高于LPS组(P<0.01)而NF-κB活性虽较刺激前和正常对照组升高，但显著低于LPS组(P<0.01)。结论 LPS可诱导M的IκBα降解和NF-κB激活，而654-2能减少IκBα降解，抑制NF-κB的活化。提示654-2在全身炎症反应综合症和急性肺损伤中可能具有治疗保护作用。
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关键词：核因子-κB抑制蛋白；核因子-κB；山莨菪碱碱；急性肺损伤
急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的本质是由一系列炎症因子或介质介导的过度炎症反应和炎症损伤。
NF-κB的不适当激活是引起过度炎症反应和炎症损伤的关键因素[1]。致伤(炎)因子刺激效应细胞致NF-κB活化，NF-κB核易位后与其目的靶基因的启动子或增强子上特定的抑制蛋白(κB)序列结合，调控一系列参与炎症反应主要功能蛋白的表达而介导多种炎症性疾病的发生[2，3]。本所自80年代中期始应用山莨菪碱(654-2)于ALI防治取得良好效果[4]，但其作用机制仍不清楚。为此，本研究拟通过LPS刺激单核细胞(M)后IκBα降解，NF-κB活化的关系及654-2对它们影响的研究以探讨654-2的抗炎机制及其为ALI等的治疗提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 LPS(大肠杆菌脂多糖0111∶B4)、阿斯匹林(ASA)(Sigma)；poly(didc)，T4多核苷酸激酶(宝灵曼)；γ-32PdATP(北京亚辉)；兔抗人P65多克隆抗体，兔抗人IκBα(核因子-κB抑制蛋白α)多克隆抗体，HRP酶标抗体(Santa cruz,USA)。其它试剂为进口或国产分析纯。
含κB核心序列的双链寡核苷酸探针由上海细胞所合成，序列如下：
5′-AGCTTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3′
3′-AGTCTCCCCTGAAAGGCTCTCCAGCT-5′
1.2 主要器材
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CO2培养箱(SHELDON，USA)，垂直电泳槽、电泳仪、凝胶干燥仪，酶标分光光度计(美国BIO-RAD)。
1.3 实验方法
1.3.1M分离与培养 健康献血员肝素化全血100 ml，分离单个核细胞，通过贴壁法获得粘附M，台盼蓝染色，计数判断细胞活力。将所得M接种于96孔培养板(1×105/孔)，24孔培养板(5×106/孔)。分正常对照组(无刺激和干预因素)；LPS刺激组(LPS 10 μg/ml)；654-2干预组(654-2 10 ng/ml培养1 h后加LPS 10 μg/ml)。96孔板细胞经上述刺激后0、15、30、60、120 min预4%多聚甲醛(4%PFL)固定用以粘贴细胞ELISA测定。24孔培养板细胞经上述刺激30、60、120、240 min后留取细胞用以提取核蛋白。
1.3.2 粘贴细胞IκBα ELISA测定 本研究采用的粘贴细胞ELISA测定是利用M的粘贴特点，使其直接吸附于固相载体，而无需使用包被抗体吸附被测抗原。96孔板粘贴细胞共5个时相点，每个时相点设6孔复孔，经3%H2O2和0.3%曲拉通处理后，加兔抗人IκBα多克隆抗体(1∶200)，同时对照组设一阴性对照；其后依次加HRP酶标抗体和底物浓液，15 min后滴终止液，测定D490 nm。结果判断以待测标本Dλ值/阴性对照Dλ值1.3.1或阴性对照Dλ值加2个标准差为阳性。
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1.3.3 M核蛋白提取和κB序列的双链寡核苷酸探针的标记 参照Scheiber等[4]的方法。用碱性低渗裂解液A和B，分别裂解细胞及细胞核，低温高速离心(12 000 rpm)，含核蛋白的上清液用Bradford法定其浓度，核蛋白-70°C冻存备用。
含κB序列的双链寡核苷酸探针P1，P2。在T4多核苷酸激酶段催化下，用γ-31P-ATP标记探针5′端，纯化后测定探针的比放射性[6]。
1.3.4 M核提取物中NF-κB活性及特异性的检测 参照Shemkar等[7]的方法，用凝胶电泳迁移率改变(EMSA)法检测。①对照组，LPS刺激组，654-2干预组核提取物3 μg与标记探针2 μl(1 ngDNA)；②LPS刺激核提取物3 μg然后分别加入100倍和200倍的未标记探针；③LPS刺激核提取物3 μg加兔抗人多克隆抗体14°C下预孵育1 h后，加入标记探针2 μl。上述混和物在结合缓冲液中充分结合后，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳毕将凝胶置干燥仪中烤胶，-70°C放射自显影3 h。
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1.4 统计学分析
实验数据以
±s表示，对有关数据进行方差分析。
2 结果
2.1 M的分离、培养
每100 m 全血分离M总数约9 .5 × 1 07，台盼蓝染色96%为活细胞。
2.2 各组LPS刺激前、后M核中NF-κB活性变化 L PS 刺 激组刺激后 0 .5 ～ 4 h NF- κ B 的 活性显著增高 ( P<0.01)，峰值在刺激后1～2 h；654-2干预组NF-κB的活性显著低于单纯LSP刺激(P<0.01)，于刺激后1 h达峰值，见表1、图1。特异性抑制试验，未标记探针的浓度达标记探针的100倍时，竞争结合反应明显，表现为电泳滞后带变淡。达200倍时，滞后带逐渐消失，见图1；抗体超迁移试验，加入0.4 μg抗P50多克隆抗体后，电泳滞后带变谈且更为滞后，见图1。
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表1 LPS刺激及654-2干预后M中NF-κB活性改变
Tab 1 Alberation of NF-κB activity in mononuclear cells
with LPS stimulated and 654-2 pretreatment
A
B
C
D
NF-κB activity
53.4±1.3
32.4±0.9* *
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49.4±1.1
36.1±0.9* *
A，C：1 h,2 h after LPS stimulation;B,D: 1 h,2 h after LPS+654-2 treatment; * *：P<0.01 vs LPS stimulation
图1 NF-κB的特异竞争结合，LPS和654-2对NF-κB活性的影响
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Fig 1 Specific combination of NF-κB, effects of LPS and 654-2 on the activity of NF-κB
A：LPS stimulation for 1 hour;B:LPS stimulation for 1 hour with addition of 100 times unmarked probe；C:LPS stimulation for 1 hour with addition of 200 times unmarked probe;D:NF-κB probe with addition of anti-p65 antibody；E：control group;F:LPS stimulation for 1 hour;G:LPS stimulation for 2 hours;I:LPS stimulation for 2 hours and 654-2 pretreatment
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2.3 各组LPS刺激前、后不同时相点MIκBα相对含量的变化
因被测抗原含量与所测Dλ值的反对数值成正比，故本研究采用Dλ值的反对数值表示M的IκBα相对含量。正常对照组各时相点IκBα Dλ值差异不显著；LPS刺激前各组差异不显著；LPS刺激组刺激后15 min显著降低(P<0.01)，最低值在刺激后30 min为(0.93±0.13)ng/ml；刺激后30 min LPS刺激组、654-2干预组均显著低于正常对照组(P<0.01)，但654-2预处理组均显著高于LPS刺激组(P<0.01)，见表2。
表2 各组LPS刺激654-2预处理前、后不同时相点M IκBα相对含量的变化比较(n=6)
Tab 2 Comparison of the contents of IκBα befor and at different time points of LPS stimulation and 654-2 pretreatment(n=6)
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Groups
Pretreatment
15 min
30 min
60 min
120 min
Control
1.84±0.31
1.82±0.06
1.84±0.06
1.84±0.08
1.81±0.05
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LPS-stimulated
1.87±0.11
1.42±0.03* #
1.11±0.04* * # #
1.42±0.05* #
1.86±0.03
654-2 treatment
1.81±0.02
1.48±0.06
1.29±0.06* * # # ★
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1.5 ±0.09
1.79±0.02
*:P<0.05,* *：P<0.01 vs pretreatment;#：P<0.05,# #：P<0.01 vs control;★：P<0.05 vs LPS-stimulation
3 讨论
既往研究表明：654-2具有的M受体拮抗作用，同时具有拮抗钙内流和抗氧化作用[8]。晚近作者应用654-2干预LPS致伤ALI大鼠发现，654-2可显著抑制LPS致伤时ALI肺组织TNFα、IL-8 mRNA和蛋白表达，提示654-2通过抑制促炎细胞因子TNFα、IL-8等表达而减轻肺组织的过度炎症反应和炎症损伤。由于促炎细胞因子等炎症效应蛋白表达主要受NF-κB调控，因而推测654-2可能通过抑制NF-κB活化而发挥抗炎效应。本实验中，采用654-2 10 ng/ml与LPS共同孵育，M核蛋白中NF-κB活性显著低于单纯LPS刺激组，结果表明治疗剂量的654-2可部分抑制LPS刺激M等炎症效应细胞所致的NF-κB活化，减少NF-κB与炎症反应的目的基因启动子κB序列结合，从而在基因转录水平抑制相应的基因表达。有关654-2抑制NF-κB活性下调相关基因表达的特异性有待进一步探讨。
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LPS刺激靶细胞通过细胞内信号转导，激活IκB激酶(IKK)，使IκB磷酸化。IκB的降解，导致NF-κB活化，从而在基因转录水平启动一系列细胞因子和炎症介质的基因表达。本实验中用654-2与LPS共同处理M，IκB的降解显著低于LPS刺激组，提示654-2通过干扰靶细胞内信号转导途径，抑制IκB的磷酸化，阻断或延迟IκB的降解，从而抑制NF-κB的活化。研究发现[8]，654-2具有抗氧化剂特性，而氧化剂参与细胞内信号转导。因此，654-2的抗氧化作用可能是其抑制IκB的降解重要环节。
NF-κB二聚体的核易位并与特异性κB序列结合是其发挥调控作用的前提[9]。本实验中采用γ-32P-ATP 5′端标记通用κB系列(5′……TGGAATTCC……-3′)，作为与NF-κB结合的探针。实验中的竞争抑制结果显示，随着未标记κB系列探针浓度增加，其滞后电泳带变淡乃至几近消失，说明浓度远大于标记探针的未标记探针与NF-κB竞争结合，由此证明NF-κB与κB系列结合的特异性。常规的ELISA方法是先将特异抗体包被在酶联板上，之后将采集的样品按一定的容量加入酶联板中(抗原)再加入酶标抗体显色后比色其吸光度值的大小，并设标准品进行定量分析。本实验由于M的粘贴特点，使其直接吸附于固相载体，而无需预先使用包被抗体吸附被测抗原。该方法对常规的ELISA进行了较大的修改，但原理是相同的[10]。
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综上所述，654-2可通过其固有的M受体拮抗作用及拮抗钙内流和抗氧化作用发挥ALI的防治作用。同时，654-2抑制致病因子刺激炎症效应细胞所致的IκB的降解，从而抑制NF-κB活化，在基因转录水平抑制NF-κB介导一系列细胞因子和炎症介质的基因表达，阻断细胞因子和炎症介质的失控性释放，对SIRS/ALI等炎症反应发挥一定的治疗作用。
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39730210)
作者简介：郭振辉(1962-)，男，福建省晋江市人，博士，主治医师，主要从事急性肺损伤方面的研究，发表论文10篇，现在广州军区总医院呼吸内科，广州 510010。电话：(020)86699556
郭振辉(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
洪新(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
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毛宝龄(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
陈正堂(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
参考文献：
[1] Baldwin A S Jr. The NF-κB and IκB protein: new discoveries and insights[J]. Annu Rev immunol,1996,14:649-683.
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[3] Rahman I, MacNee W. Role of transription factors in inflammatory lung diseases[J]. Thorax,1998,53(7):601-612.
[4] 古国贤，郭先健，毛宝龄，等.犬注射油酸后的综合实验观察[J].中华结核和呼吸杂志，1985，8(1)：1-6.
[5] Schreiber E, Matthias P, Miller M M, et al. Rapid detection of octamer binding proteins with “mini-extracts” prepared from a small number of cells[J]. Nucleic Acids Res,1989,17(15):6 419.
[6] 金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆—实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1996.16-27.
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[10] 毕爱华 主编.医学免疫学[M].北京：人民军医出版社，1995.291-292., 百拇医药
郭振辉 洪新 毛宝龄 钱桂生 陈正堂
摘 要：目的 观察山莨菪碱(654-2)和脂多糖(LPS)共同处理单核细胞(M)后对核因子-κB抑制蛋白(IκB)降解和核因子-κB(NF-κB)活化的影响。方法 分离、培养M，分为正常对照组；LPS刺激组(LPS 10 μg/ml)；654-2干预组(654-2 10 ng/ml预孵育1 h后加入LPS 10 μg/ml)。分别在刺激前(0)、刺激后0.25、0.5、1和2 h，留取M。检测M中IκBα水平和核提取物中NF-κB的活性。结果 LPS刺激组IκBα水平15 min开始降低，30 min降到最低值；NF-κB活性峰值显著高于刺激前和正常对照组(P<0.01)。654-2干预后，IκBα水平最低值，显著高于LPS组(P<0.01)而NF-κB活性虽较刺激前和正常对照组升高，但显著低于LPS组(P<0.01)。结论 LPS可诱导M的IκBα降解和NF-κB激活，而654-2能减少IκBα降解，抑制NF-κB的活化。提示654-2在全身炎症反应综合症和急性肺损伤中可能具有治疗保护作用。
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关键词：核因子-κB抑制蛋白；核因子-κB；山莨菪碱碱；急性肺损伤
急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的本质是由一系列炎症因子或介质介导的过度炎症反应和炎症损伤。
NF-κB的不适当激活是引起过度炎症反应和炎症损伤的关键因素[1]。致伤(炎)因子刺激效应细胞致NF-κB活化，NF-κB核易位后与其目的靶基因的启动子或增强子上特定的抑制蛋白(κB)序列结合，调控一系列参与炎症反应主要功能蛋白的表达而介导多种炎症性疾病的发生[2，3]。本所自80年代中期始应用山莨菪碱(654-2)于ALI防治取得良好效果[4]，但其作用机制仍不清楚。为此，本研究拟通过LPS刺激单核细胞(M)后IκBα降解，NF-κB活化的关系及654-2对它们影响的研究以探讨654-2的抗炎机制及其为ALI等的治疗提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 LPS(大肠杆菌脂多糖0111∶B4)、阿斯匹林(ASA)(Sigma)；poly(didc)，T4多核苷酸激酶(宝灵曼)；γ-32PdATP(北京亚辉)；兔抗人P65多克隆抗体，兔抗人IκBα(核因子-κB抑制蛋白α)多克隆抗体，HRP酶标抗体(Santa cruz,USA)。其它试剂为进口或国产分析纯。
含κB核心序列的双链寡核苷酸探针由上海细胞所合成，序列如下：
5′-AGCTTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3′
3′-AGTCTCCCCTGAAAGGCTCTCCAGCT-5′
1.2 主要器材
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CO2培养箱(SHELDON，USA)，垂直电泳槽、电泳仪、凝胶干燥仪，酶标分光光度计(美国BIO-RAD)。
1.3 实验方法
1.3.1M分离与培养 健康献血员肝素化全血100 ml，分离单个核细胞，通过贴壁法获得粘附M，台盼蓝染色，计数判断细胞活力。将所得M接种于96孔培养板(1×105/孔)，24孔培养板(5×106/孔)。分正常对照组(无刺激和干预因素)；LPS刺激组(LPS 10 μg/ml)；654-2干预组(654-2 10 ng/ml培养1 h后加LPS 10 μg/ml)。96孔板细胞经上述刺激后0、15、30、60、120 min预4%多聚甲醛(4%PFL)固定用以粘贴细胞ELISA测定。24孔培养板细胞经上述刺激30、60、120、240 min后留取细胞用以提取核蛋白。
1.3.2 粘贴细胞IκBα ELISA测定 本研究采用的粘贴细胞ELISA测定是利用M的粘贴特点，使其直接吸附于固相载体，而无需使用包被抗体吸附被测抗原。96孔板粘贴细胞共5个时相点，每个时相点设6孔复孔，经3%H2O2和0.3%曲拉通处理后，加兔抗人IκBα多克隆抗体(1∶200)，同时对照组设一阴性对照；其后依次加HRP酶标抗体和底物浓液，15 min后滴终止液，测定D490 nm。结果判断以待测标本Dλ值/阴性对照Dλ值1.3.1或阴性对照Dλ值加2个标准差为阳性。
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1.3.3 M核蛋白提取和κB序列的双链寡核苷酸探针的标记 参照Scheiber等[4]的方法。用碱性低渗裂解液A和B，分别裂解细胞及细胞核，低温高速离心(12 000 rpm)，含核蛋白的上清液用Bradford法定其浓度，核蛋白-70°C冻存备用。
含κB序列的双链寡核苷酸探针P1，P2。在T4多核苷酸激酶段催化下，用γ-31P-ATP标记探针5′端，纯化后测定探针的比放射性[6]。
1.3.4 M核提取物中NF-κB活性及特异性的检测 参照Shemkar等[7]的方法，用凝胶电泳迁移率改变(EMSA)法检测。①对照组，LPS刺激组，654-2干预组核提取物3 μg与标记探针2 μl(1 ngDNA)；②LPS刺激核提取物3 μg然后分别加入100倍和200倍的未标记探针；③LPS刺激核提取物3 μg加兔抗人多克隆抗体14°C下预孵育1 h后，加入标记探针2 μl。上述混和物在结合缓冲液中充分结合后，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳毕将凝胶置干燥仪中烤胶，-70°C放射自显影3 h。
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1.4 统计学分析
实验数据以
±s表示，对有关数据进行方差分析。2 结果
2.1 M的分离、培养
每100 m 全血分离M总数约9 .5 × 1 07，台盼蓝染色96%为活细胞。
2.2 各组LPS刺激前、后M核中NF-κB活性变化 L PS 刺 激组刺激后 0 .5 ～ 4 h NF- κ B 的 活性显著增高 ( P<0.01)，峰值在刺激后1～2 h；654-2干预组NF-κB的活性显著低于单纯LSP刺激(P<0.01)，于刺激后1 h达峰值，见表1、图1。特异性抑制试验，未标记探针的浓度达标记探针的100倍时，竞争结合反应明显，表现为电泳滞后带变淡。达200倍时，滞后带逐渐消失，见图1；抗体超迁移试验，加入0.4 μg抗P50多克隆抗体后，电泳滞后带变谈且更为滞后，见图1。
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表1 LPS刺激及654-2干预后M中NF-κB活性改变
Tab 1 Alberation of NF-κB activity in mononuclear cells
with LPS stimulated and 654-2 pretreatment
A
B
C
D
NF-κB activity
53.4±1.3
32.4±0.9* *
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49.4±1.1
36.1±0.9* *
A，C：1 h,2 h after LPS stimulation;B,D: 1 h,2 h after LPS+654-2 treatment; * *：P<0.01 vs LPS stimulation
图1 NF-κB的特异竞争结合，LPS和654-2对NF-κB活性的影响
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Fig 1 Specific combination of NF-κB, effects of LPS and 654-2 on the activity of NF-κB
A：LPS stimulation for 1 hour;B:LPS stimulation for 1 hour with addition of 100 times unmarked probe；C:LPS stimulation for 1 hour with addition of 200 times unmarked probe;D:NF-κB probe with addition of anti-p65 antibody；E：control group;F:LPS stimulation for 1 hour;G:LPS stimulation for 2 hours;I:LPS stimulation for 2 hours and 654-2 pretreatment
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2.3 各组LPS刺激前、后不同时相点MIκBα相对含量的变化
因被测抗原含量与所测Dλ值的反对数值成正比，故本研究采用Dλ值的反对数值表示M的IκBα相对含量。正常对照组各时相点IκBα Dλ值差异不显著；LPS刺激前各组差异不显著；LPS刺激组刺激后15 min显著降低(P<0.01)，最低值在刺激后30 min为(0.93±0.13)ng/ml；刺激后30 min LPS刺激组、654-2干预组均显著低于正常对照组(P<0.01)，但654-2预处理组均显著高于LPS刺激组(P<0.01)，见表2。
表2 各组LPS刺激654-2预处理前、后不同时相点M IκBα相对含量的变化比较(n=6)
Tab 2 Comparison of the contents of IκBα befor and at different time points of LPS stimulation and 654-2 pretreatment(n=6)
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Groups
Pretreatment
15 min
30 min
60 min
120 min
Control
1.84±0.31
1.82±0.06
1.84±0.06
1.84±0.08
1.81±0.05
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LPS-stimulated
1.87±0.11
1.42±0.03* #
1.11±0.04* * # #
1.42±0.05* #
1.86±0.03
654-2 treatment
1.81±0.02
1.48±0.06
1.29±0.06* * # # ★
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1.5 ±0.09
1.79±0.02
*:P<0.05,* *：P<0.01 vs pretreatment;#：P<0.05,# #：P<0.01 vs control;★：P<0.05 vs LPS-stimulation
3 讨论
既往研究表明：654-2具有的M受体拮抗作用，同时具有拮抗钙内流和抗氧化作用[8]。晚近作者应用654-2干预LPS致伤ALI大鼠发现，654-2可显著抑制LPS致伤时ALI肺组织TNFα、IL-8 mRNA和蛋白表达，提示654-2通过抑制促炎细胞因子TNFα、IL-8等表达而减轻肺组织的过度炎症反应和炎症损伤。由于促炎细胞因子等炎症效应蛋白表达主要受NF-κB调控，因而推测654-2可能通过抑制NF-κB活化而发挥抗炎效应。本实验中，采用654-2 10 ng/ml与LPS共同孵育，M核蛋白中NF-κB活性显著低于单纯LPS刺激组，结果表明治疗剂量的654-2可部分抑制LPS刺激M等炎症效应细胞所致的NF-κB活化，减少NF-κB与炎症反应的目的基因启动子κB序列结合，从而在基因转录水平抑制相应的基因表达。有关654-2抑制NF-κB活性下调相关基因表达的特异性有待进一步探讨。
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LPS刺激靶细胞通过细胞内信号转导，激活IκB激酶(IKK)，使IκB磷酸化。IκB的降解，导致NF-κB活化，从而在基因转录水平启动一系列细胞因子和炎症介质的基因表达。本实验中用654-2与LPS共同处理M，IκB的降解显著低于LPS刺激组，提示654-2通过干扰靶细胞内信号转导途径，抑制IκB的磷酸化，阻断或延迟IκB的降解，从而抑制NF-κB的活化。研究发现[8]，654-2具有抗氧化剂特性，而氧化剂参与细胞内信号转导。因此，654-2的抗氧化作用可能是其抑制IκB的降解重要环节。
NF-κB二聚体的核易位并与特异性κB序列结合是其发挥调控作用的前提[9]。本实验中采用γ-32P-ATP 5′端标记通用κB系列(5′……TGGAATTCC……-3′)，作为与NF-κB结合的探针。实验中的竞争抑制结果显示，随着未标记κB系列探针浓度增加，其滞后电泳带变淡乃至几近消失，说明浓度远大于标记探针的未标记探针与NF-κB竞争结合，由此证明NF-κB与κB系列结合的特异性。常规的ELISA方法是先将特异抗体包被在酶联板上，之后将采集的样品按一定的容量加入酶联板中(抗原)再加入酶标抗体显色后比色其吸光度值的大小，并设标准品进行定量分析。本实验由于M的粘贴特点，使其直接吸附于固相载体，而无需预先使用包被抗体吸附被测抗原。该方法对常规的ELISA进行了较大的修改，但原理是相同的[10]。
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综上所述，654-2可通过其固有的M受体拮抗作用及拮抗钙内流和抗氧化作用发挥ALI的防治作用。同时，654-2抑制致病因子刺激炎症效应细胞所致的IκB的降解，从而抑制NF-κB活化，在基因转录水平抑制NF-κB介导一系列细胞因子和炎症介质的基因表达，阻断细胞因子和炎症介质的失控性释放，对SIRS/ALI等炎症反应发挥一定的治疗作用。
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39730210)
作者简介：郭振辉(1962-)，男，福建省晋江市人，博士，主治医师，主要从事急性肺损伤方面的研究，发表论文10篇，现在广州军区总医院呼吸内科，广州 510010。电话：(020)86699556
郭振辉(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
洪新(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
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毛宝龄(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
陈正堂(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400038)
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