PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒
PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒
张文清 马文煜 骆文静 姜绍谆 胡艳冰 侯悦 张进 于碧云
摘 要：目的 建立一种简便、有效的从细胞培养物中纯化PV1病毒的方法用于水病毒消毒实验. 方法 PV 1 Henan株在Hep-2细胞中增殖后用聚乙二醇(PEG)6000沉淀结合差速离心的方法纯化病毒. RT-PCR和透射电镜(TEM)鉴定提纯病毒的形态学和分子生物学特性. 结果 pH值7.5时终浓度70 g.L-1的PEG 6000沉淀病毒的感染性回收率(PFU计数)为79.2%，提纯系数(PF)为106，再经差速离心(16 000 g 30 min，100 000 g 4.5 h)浓缩病毒的感染性回性率和提纯系数分别为29.0%和168. RT-PCR和TEM最终鉴定提纯物为PV 1 Henan株. 结论 PEG 6000结合差速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离心方法易于操作，且比单独PEG沉淀有更高的纯化系数，是一种简便、有效的方法.
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关键词：脊髓灰质炎病毒；病毒分离与纯化；聚乙二醇；离心法
0 引言
影响水中病毒消毒效果的因素很多，除了病毒的生物学特性、消毒剂的性质与剂量以及环境温度外,还有水中病毒聚集性、水质酸碱度、离子强度以及病毒周围有机物等[1]. 包绕在病毒周围的有机物，尤其是蛋白类，不仅为病毒提供物理屏障，使消毒剂不易穿透至作用靶点，而且有机物中许多化学基团如巯基还可与氧化性消毒剂产生反应，导致消毒剂有效浓度大为降低. Emetson等[2]报告，臭氧灭活Hep-2. 细胞中的PV和Coxs病毒需要的消毒剂浓时积(CT值)较灭活游离于细胞外的这两种病毒高约150倍,因此在人工制备病毒污染水样时要经过反复冻融感染细胞、超声粉碎、低速离心沉淀细胞碎片以及其它特殊沉淀病毒蛋白、离心提纯病毒的过程. 我们采用反复冻融、超声粉碎、低速离心以去除细胞碎片,并进一步用PEG 6000沉淀病毒蛋白、差速离心提纯PV1病毒.
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1 材料和方法
1.1 材料 电子显微镜，JEM-2000EX型，日本电子公司；高速冷冻离心机GL-20A型，湘西仪器仪表厂；超速离心机，Centrikont-2080型，瑞士Kontron公司. 病毒株与细胞株[3]，PEG 6000，日本进口，天津天秦公司分装.
1.2 方法 细胞培养与病毒感染按我们先前的方法[3]. 接种病毒3～5 d出现严重CPE(>)后反复冻融细胞5～6次，再经超声粉碎至细胞完全裂解. 病毒原液(S0)在4℃环境经4000 r.min-1离心30 min后弃沉淀(P1)，留上清(S1)冻存备用. PEG沉淀：在S1中缓慢滴加400 g.L-1 PEG 6000溶液至PEG终浓度为70 g.L-1，并随时搅拌、调整pH至7.5. 4℃过夜后，8000 r.min-1离心30 min后弃上清(S2)，留沉淀(P2). 差速离心：用0.01 mol.L-1 pH 7.4的PBS混悬P2后4℃ 12 000 r.min-1 (16 000 g)离心30 min后弃沉淀(P3)，上清(S3)再经PBS混悬，4℃ 38 000 r.min-1 (100 000 g)超速离心4.5 h弃上清(S4)，沉淀(P4)混悬后冰浴条件下14 mm振幅超声粉碎2 min，加双抗处理后用灭菌双蒸去离子水稀释，-75℃冻存. 蛋白质浓度测定：按Lowry方法. 病毒感染性测定：采用改良的蚀斑试验[3]. RT-PCR：详见我们先前的实验[4].
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TEM鉴定：30 mL.L-1戊二醛和10 g.L-1饿酸双固定P4中病毒，按常规电镜制作程序用Epon812, DDSA, DMP-30混合液制备包埋块，超薄切片后用醋酸铀和枸橡酸铝染色，透射电镜下观察照相.
2 结果
2.1 细胞培养物处理效果 细胞冻融、粉碎后低速离心可去除绝大部分细胞碎片(P1)，由Tab 1可见，离心降低25%的蛋白，但病毒的感染性仅下降15.8%.
表1 从细胞培养物中提纯PV 1病毒结果
Tab 1 The results of purification of PV 1 from cell cultures
, 百拇医药
Sample
(No)
V/mL
Protein
Virus infectivity
g.L-1
%Recovery
PFU/L
%Recovery
PFU/g
PFa
, 百拇医药 S0
1600
6.24
100.00
2.80×108
100.0
0.49×108
1.00
S1
1584
4.73
75.00
, 百拇医药
2.38×108
84.2
0.50×108
1.01
P1
Discarded
-
-
-
-
-
-
, 百拇医药
S2
Discarded
2.80
-
5.54×106
-
-
-
P2
40b
1.71
0.69
, 百拇医药
8.87×109
79.2
5.19×109
106.00
S3
38
0.87
0.33
5.02×109
42.6
5.77×109
, 百拇医药
118.00
P3
Discarded
-
-
-
-
-
-
S4
Discarded
-
-
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2.37×107
-
-
-
P4
24b
0.66
0.16
5.42×109
29.0
8.21×109
168.00
, 百拇医药
a: PF (Purify coefficient)=(S1～S4 or P1～P4 PFU/mg protein)÷(S0 PFU/mg protein); b: Volume of pellets suspended with PBS buffer.
S0: Primary virus solution. S1,S2,S3,S4: Supernate,after first,second,third,and fourth centrifugation,respectively. P1,P2,P3,P4: Precipitation,after first,second,third,and fourth centrifugation,respectively.2.2 PEG 6000沉淀病毒蛋白作用 PEG处理后的沉淀物P2能保留79.2%的病毒感染性，同时去除99.1% 非病毒蛋白，从而使提纯系数达到106 (Tab 1).
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2.3 差速离心提纯沉淀病毒的作用 经一次高速和一次超速离心后可除去P2中约50%的小分子杂蛋白，而感染性回收率分别为42.6%和29.0%，提纯系数分别为116和168 (Tab 1).
2.4 RT-PCR及TEM鉴定结果 提取物(P4)电镜检查可见密集分布的直径约30 nm、呈对称颗粒球形的病毒(Fig 1)，与文献一致，而提纯前细胞内质网中见有散在的病毒颗粒(Fig 2). RT-PCR扩增后电泳可见一个214 bp特异片断，与阳性对照相同.
图1 纯化后沉淀物PV1透射电镜鉴定结果
Fig 1 TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain after purification ×20 000
, 百拇医药
图2 纯化前感染细胞透射电镜检查结果
Fig 2 TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain in infected Hep-2 cells ×12 000
3 讨论
常用的PV提纯方法是丁醇抽提、酶处理及两次超速离心后，再经速率区带密度梯度离心[5]，有较高的感染性回收率，但费时费力，不易操作，难以用于经常性提纯使用. 而PEG沉淀法适于从含有大量宿主蛋白和磷脂的大体积(通常为数千毫克升)原始材料中选择性沉淀病毒，具有手段温和、非病毒蛋白残留量少等优点，但单独使用则感染性回收率低. 本实验通过冻融、粉碎、低速离心等预处理去除细胞碎片而降低沉淀过程中非病毒蛋白的影响，结果显示约25%的细胞蛋白被沉淀去除. 在此基础上，用PEG 6000沉淀法结合差速离心，可去除99%以上的非病毒蛋白，感染性回收率为29.0%，提纯系数(PF)168，与单独PEG沉淀(PF为66.4)[6]相比提高了近一倍；与蔗糖密度梯度离心相比，虽然感染性回收不及前者(47.0%)[7]，但相对而言，方法简便易行，适合于水中PV消毒实验人工病毒污染水样的经常性制备.
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作者简介：张文清(1965-)，男(汉族)，安徽省怀宁县人. 讲师，博士. 现工作在第一军医大学军队卫生学教研室，广州 510525. Tel. (020)7705370-48522 Email. defaultuser@domain.com
张文清(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
马文煜(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
骆文静(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
姜绍谆(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
胡艳冰(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
, 百拇医药
侯悦(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
张进(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
于碧云(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
参考文献
[1]韩 友. 消毒剂灭活病毒影响因素的研究进展[J]. 中国消毒学杂志，1993；10(3):168-171.
[2]Emerson MA， Sproul OJ, Buck CE. Ozone inactivation of cell-associated virus [J]. Appl Environ Microbiol， 1982；43(2):603-610.
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[3]张文清，姜绍谆，马文煜et al. 水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株的筛选[J]. 第四军医大学学报，1998；19(6):643-645.
[4]张文清，姜绍谆，马文煜et al. 水中脊髓灰质炎病毒感染性、抗原性及核酸指标检测方法的评价研究[J]. 第四军医大学学报，1998；19(5):498-500.
[5]戴华生. 新实验病毒学[M]. 北京:中国学术出版社，1983:595-596.
[6]黄志尚，黄祥瑞，杨佩英et al. Sindbis病毒的浓缩提纯[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，1981；1(2):101-103.
[7]马文煜，于碧云，姜绍谆et al. 从感染鼠脑浓缩提纯流行性乙型脑炎病毒的研究[J].第四军医大学学报，1984；5(4):251-254., 百拇医药
张文清 马文煜 骆文静 姜绍谆 胡艳冰 侯悦 张进 于碧云
摘 要：目的 建立一种简便、有效的从细胞培养物中纯化PV1病毒的方法用于水病毒消毒实验. 方法 PV 1 Henan株在Hep-2细胞中增殖后用聚乙二醇(PEG)6000沉淀结合差速离心的方法纯化病毒. RT-PCR和透射电镜(TEM)鉴定提纯病毒的形态学和分子生物学特性. 结果 pH值7.5时终浓度70 g.L-1的PEG 6000沉淀病毒的感染性回收率(PFU计数)为79.2%，提纯系数(PF)为106，再经差速离心(16 000 g 30 min，100 000 g 4.5 h)浓缩病毒的感染性回性率和提纯系数分别为29.0%和168. RT-PCR和TEM最终鉴定提纯物为PV 1 Henan株. 结论 PEG 6000结合差速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离心方法易于操作，且比单独PEG沉淀有更高的纯化系数，是一种简便、有效的方法.
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关键词：脊髓灰质炎病毒；病毒分离与纯化；聚乙二醇；离心法
0 引言
影响水中病毒消毒效果的因素很多，除了病毒的生物学特性、消毒剂的性质与剂量以及环境温度外,还有水中病毒聚集性、水质酸碱度、离子强度以及病毒周围有机物等[1]. 包绕在病毒周围的有机物，尤其是蛋白类，不仅为病毒提供物理屏障，使消毒剂不易穿透至作用靶点，而且有机物中许多化学基团如巯基还可与氧化性消毒剂产生反应，导致消毒剂有效浓度大为降低. Emetson等[2]报告，臭氧灭活Hep-2. 细胞中的PV和Coxs病毒需要的消毒剂浓时积(CT值)较灭活游离于细胞外的这两种病毒高约150倍,因此在人工制备病毒污染水样时要经过反复冻融感染细胞、超声粉碎、低速离心沉淀细胞碎片以及其它特殊沉淀病毒蛋白、离心提纯病毒的过程. 我们采用反复冻融、超声粉碎、低速离心以去除细胞碎片,并进一步用PEG 6000沉淀病毒蛋白、差速离心提纯PV1病毒.
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1 材料和方法
1.1 材料 电子显微镜，JEM-2000EX型，日本电子公司；高速冷冻离心机GL-20A型，湘西仪器仪表厂；超速离心机，Centrikont-2080型，瑞士Kontron公司. 病毒株与细胞株[3]，PEG 6000，日本进口，天津天秦公司分装.
1.2 方法 细胞培养与病毒感染按我们先前的方法[3]. 接种病毒3～5 d出现严重CPE(>)后反复冻融细胞5～6次，再经超声粉碎至细胞完全裂解. 病毒原液(S0)在4℃环境经4000 r.min-1离心30 min后弃沉淀(P1)，留上清(S1)冻存备用. PEG沉淀：在S1中缓慢滴加400 g.L-1 PEG 6000溶液至PEG终浓度为70 g.L-1，并随时搅拌、调整pH至7.5. 4℃过夜后，8000 r.min-1离心30 min后弃上清(S2)，留沉淀(P2). 差速离心：用0.01 mol.L-1 pH 7.4的PBS混悬P2后4℃ 12 000 r.min-1 (16 000 g)离心30 min后弃沉淀(P3)，上清(S3)再经PBS混悬，4℃ 38 000 r.min-1 (100 000 g)超速离心4.5 h弃上清(S4)，沉淀(P4)混悬后冰浴条件下14 mm振幅超声粉碎2 min，加双抗处理后用灭菌双蒸去离子水稀释，-75℃冻存. 蛋白质浓度测定：按Lowry方法. 病毒感染性测定：采用改良的蚀斑试验[3]. RT-PCR：详见我们先前的实验[4].
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TEM鉴定：30 mL.L-1戊二醛和10 g.L-1饿酸双固定P4中病毒，按常规电镜制作程序用Epon812, DDSA, DMP-30混合液制备包埋块，超薄切片后用醋酸铀和枸橡酸铝染色，透射电镜下观察照相.
2 结果
2.1 细胞培养物处理效果 细胞冻融、粉碎后低速离心可去除绝大部分细胞碎片(P1)，由Tab 1可见，离心降低25%的蛋白，但病毒的感染性仅下降15.8%.
表1 从细胞培养物中提纯PV 1病毒结果
Tab 1 The results of purification of PV 1 from cell cultures
, 百拇医药
Sample
(No)
V/mL
Protein
Virus infectivity
g.L-1
%Recovery
PFU/L
%Recovery
PFU/g
PFa
, 百拇医药 S0
1600
6.24
100.00
2.80×108
100.0
0.49×108
1.00
S1
1584
4.73
75.00
, 百拇医药
2.38×108
84.2
0.50×108
1.01
P1
Discarded
-
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, 百拇医药
S2
Discarded
2.80
-
5.54×106
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P2
40b
1.71
0.69
, 百拇医药
8.87×109
79.2
5.19×109
106.00
S3
38
0.87
0.33
5.02×109
42.6
5.77×109
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118.00
P3
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2.37×107
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P4
24b
0.66
0.16
5.42×109
29.0
8.21×109
168.00
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a: PF (Purify coefficient)=(S1～S4 or P1～P4 PFU/mg protein)÷(S0 PFU/mg protein); b: Volume of pellets suspended with PBS buffer.
S0: Primary virus solution. S1,S2,S3,S4: Supernate,after first,second,third,and fourth centrifugation,respectively. P1,P2,P3,P4: Precipitation,after first,second,third,and fourth centrifugation,respectively.2.2 PEG 6000沉淀病毒蛋白作用 PEG处理后的沉淀物P2能保留79.2%的病毒感染性，同时去除99.1% 非病毒蛋白，从而使提纯系数达到106 (Tab 1).
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2.3 差速离心提纯沉淀病毒的作用 经一次高速和一次超速离心后可除去P2中约50%的小分子杂蛋白，而感染性回收率分别为42.6%和29.0%，提纯系数分别为116和168 (Tab 1).
2.4 RT-PCR及TEM鉴定结果 提取物(P4)电镜检查可见密集分布的直径约30 nm、呈对称颗粒球形的病毒(Fig 1)，与文献一致，而提纯前细胞内质网中见有散在的病毒颗粒(Fig 2). RT-PCR扩增后电泳可见一个214 bp特异片断，与阳性对照相同.
图1 纯化后沉淀物PV1透射电镜鉴定结果
Fig 1 TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain after purification ×20 000
, 百拇医药
图2 纯化前感染细胞透射电镜检查结果
Fig 2 TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain in infected Hep-2 cells ×12 000
3 讨论
常用的PV提纯方法是丁醇抽提、酶处理及两次超速离心后，再经速率区带密度梯度离心[5]，有较高的感染性回收率，但费时费力，不易操作，难以用于经常性提纯使用. 而PEG沉淀法适于从含有大量宿主蛋白和磷脂的大体积(通常为数千毫克升)原始材料中选择性沉淀病毒，具有手段温和、非病毒蛋白残留量少等优点，但单独使用则感染性回收率低. 本实验通过冻融、粉碎、低速离心等预处理去除细胞碎片而降低沉淀过程中非病毒蛋白的影响，结果显示约25%的细胞蛋白被沉淀去除. 在此基础上，用PEG 6000沉淀法结合差速离心，可去除99%以上的非病毒蛋白，感染性回收率为29.0%，提纯系数(PF)168，与单独PEG沉淀(PF为66.4)[6]相比提高了近一倍；与蔗糖密度梯度离心相比，虽然感染性回收不及前者(47.0%)[7]，但相对而言，方法简便易行，适合于水中PV消毒实验人工病毒污染水样的经常性制备.
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作者简介：张文清(1965-)，男(汉族)，安徽省怀宁县人. 讲师，博士. 现工作在第一军医大学军队卫生学教研室，广州 510525. Tel. (020)7705370-48522 Email. defaultuser@domain.com
张文清(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
马文煜(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
骆文静(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
姜绍谆(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
胡艳冰(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
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侯悦(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
张进(第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)
于碧云(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
参考文献
[1]韩 友. 消毒剂灭活病毒影响因素的研究进展[J]. 中国消毒学杂志，1993；10(3):168-171.
[2]Emerson MA， Sproul OJ, Buck CE. Ozone inactivation of cell-associated virus [J]. Appl Environ Microbiol， 1982；43(2):603-610.
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[3]张文清，姜绍谆，马文煜et al. 水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株的筛选[J]. 第四军医大学学报，1998；19(6):643-645.
[4]张文清，姜绍谆，马文煜et al. 水中脊髓灰质炎病毒感染性、抗原性及核酸指标检测方法的评价研究[J]. 第四军医大学学报，1998；19(5):498-500.
[5]戴华生. 新实验病毒学[M]. 北京:中国学术出版社，1983:595-596.
[6]黄志尚，黄祥瑞，杨佩英et al. Sindbis病毒的浓缩提纯[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，1981；1(2):101-103.
[7]马文煜，于碧云，姜绍谆et al. 从感染鼠脑浓缩提纯流行性乙型脑炎病毒的研究[J].第四军医大学学报，1984；5(4):251-254., 百拇医药