羟乙膦酸钠对实验性高钙尿症的防治作用及其机制
羟乙膦酸钠对实验性高钙尿症的防治作用及其机制
赵东宝 崔若兰 袁伟杰
摘 要 目的：观察骨吸收抑制剂羟乙膦酸钠对实验性高钙尿症的防治作用，并探讨其可能机制。方法：建立大鼠实验性高钙尿症模型，观察羟乙膦酸钠治疗后2周和4周的尿钙，Ca2+/Cr，NAG/Cr，以及肾和十二指肠Ca2+-ATP酶(钙泵)的变化。结果：2周时尿钙，Ca2+/Cr，血ALP虽有所升高，但4周时尿钙，Ca2+/Cr，NAG/Cr及血ALP均显著下降(P<0.01)，24 h尿钙定量与尿NAG/Cr值呈正相关；而靶组织钙泵活性无显著改变。结论：骨吸收抑制剂具降尿钙和保肾作用，其机制不依赖钙泵活性的改变。
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关键词：高钙尿症；羟乙膦酸钠
高钙尿症尤其特发性高钙尿症(idiopathic hypercalciuria,IH)是泌尿系结石和单纯血尿常见病因[1，2]。本病病因不明，一直缺乏有效治疗方法。积极探讨IH发病机制和开发防治新药是临床之急需。最近，Weisinger等[3]研究认为骨钙吸收增加是IH发病重要机制之一，推测抑制骨钙吸收可起到降尿钙作用。本研究建立大鼠实验性高钙尿症模型，观察骨吸收抑制剂--羟乙膦酸钠对该病的防治作用，并探讨其可能机制，旨在为临床用药提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 大鼠实验性高钙尿症模型的建立 健康雄性SD大鼠(第二军医大学实验动物中心)，每天腹腔注射维生素D3 10 IU/g，共3周，分别于实验后第1,3,7,14和28天留取大鼠24 h尿量，测定尿钙和尿肌酐(UCr)，3 d后尿钙显著升高，并持续至实验结束(4周末)，证实高钙尿症模型建立。SD大鼠30只，随机分为3组：(1)A组(正常对照组，n=10)；(2)B组(高钙尿症对照组，n=10)：腹腔注射维生素D3；(3)C组(羟乙膦酸钠干预组，n=10 )：同B组，注射维生素D3后，予羟乙膦酸钠隔天灌胃，剂量每100 g体质量5 mg。分别于实验后2周和4周随机处死大鼠各5只，取血、肾和十二指肠组织标本。
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1.2 观察指标和检测方法
1.2.1 24 h尿钙定量测定 收集大鼠24 h尿液，测定尿钙和UCr含量，换算Ca2+/Cr比值和24 h尿钙定量(UCa2+)。
1.2.2 血生化指标的测定 大鼠分批于实验后2周和4周末取血，测定血钙、磷、碱性磷酸酶(ALP)等 。
1.2.3 尿N-乙酰-β-D-氨基-葡萄糖苷酶(NAG)测定 按试剂盒说明书操作，采用ELISA法测定各组大鼠尿NAG含量，计算尿NAG/Cr值。
1.2.4 肾、十二指肠匀浆ATP酶测定 分别称取肾组织1.0 g和十二指肠组织0.2 g制成组织匀浆，取组织匀浆100 μl，按ATP酶试剂盒说明书操作，测出100 μl组织匀浆在反应过程中分解的无机磷含量，再测出每100 μl组织匀浆中的蛋白含量，前者除以后者得每毫克蛋白分解ATP所产生的无机磷含量，按每小时每毫克蛋白分解ATP产生1 μmol无机磷为一个ATP酶活力单位，即μmol/(mg.h)。
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1.3 统计学处理 数据以
±s表示，采用F检验、Newman-Keuls检验和直线相关分析。
2 结 果
2.1 尿Ca2+/Cr和24 h UCa2+的变化 尿Ca2+/Cr和24 h UCa2+值见表1，可见注射维生素D3后2周和4周尿Ca2+/Cr和24 h UCa2+均显著高于正常大鼠(P<0.01)。羟乙膦酸钠治疗2周时Ca2+/Cr和24 h UCa2+虽较B组有所升高，但4周时两者均较B组显著下降(P<0.01)，提示长期应用有良好的降尿钙作用。
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表1 各组尿Ca2+/Cr和24 h尿钙定量
Tab 1 Ca2+/Cr and UCa2+ in different groups(±s,cB/μmol.L-1)
Group
n
Ca2+/Cr
UCa2+
2nd week
, 百拇医药
4th week
2nd week
4th week
A
5
0.07±0.04
0.07±0.05
4.89±2.54
5.21±1.43
B
5
0.30±0.26**
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0.41±0.18**
7.62±1.75**
8.28±1.85**
C
5
0.48±0.38**△△
0.10±0.07△△
9.85±2.27**△△
2.18±0.99**△△
**P<0.01 vs group A; △△P<0.01 vs group B2.2 血钙、磷和ALP的变化 B组2周和4周血钙、磷均高于A组，而ALP则低于A组，符合注射维生素D3后血生化变化。C组ALP虽2周时高于B组，但4周时与B组无显著差异(P>0.05)，提示长期应用有抑制骨吸收的作用(图1)。
, 百拇医药
图1 各组血清ALP的变化
Fig 1 Serum alkaline phosphatase
at 2nd and 4th week
□: A group; □: B group; □: C group
2.3 尿NAG/Cr的变化 正常大鼠尿NAG/Cr为(1.83±0.68) IU/mmol，注射维生素D3 4周后尿NAG/Cr为(8.21±2.05) IU/mmol，羟乙膦酸钠治疗4周后NAG/Cr为(3.16±1.34) IU/mmol，3组比较差异非常显著(P<0.01)。尿NAG/Cr与24 h UCa2+呈正相关(r=0.69,n=20,P<0.01)。
2.4 肾和十二指肠组织胞液ATP酶的变化 B组2周和4周时Ca2+-ATP酶均显著高于A组(P<0.01)，C组2周和4周时Ca2+-ATP酶也显著高于A组(P<0.01)，但与B组差异不显著(P>0.05)。表2提示羟乙膦酸钠降尿钙作用不依赖肾和十二指肠Ca2+-ATP酶的变化。
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3 讨 论
IH是泌尿系结石和单纯性血尿常见病因。90%以上的泌尿系结石系钙性结石，其中约一半由IH引起；IH在形成结石前尚可引起肉眼或镜下血尿，1/4儿童单纯性血尿的病因为IH。此外，尿钙升高可引起肾钙盐沉积，导致肾小管-间质损害，表现为尿NAG及尿NAG/Cr比值等升高[4，5]。本病病因不清，缺乏有效治疗。因此探讨发病机制和开发防治新药是临床之急需。有认为IH与肠道高吸收钙及肾漏钙有关，并发现维生素D靶组织上Ca2+-ATP酶活性升高，致细胞内外钙平衡失调而引起高钙尿症[6]。Ca2+-ATP酶是钙跨膜转运的重要介质之一，其作用是借助能量ATP将细胞内钙离子泵出细胞外。对维生素D靶组织，活性维生素D促进管腔侧钙离子进入细胞内，而基底膜侧的Ca2+-ATP酶则将胞内钙转运到胞外，从而有利于钙的吸收。
表2 各组肾和十二指肠组织液Ca2+-ATP酶活性的变化
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Tab 2 Activity of Ca2+-ATPase in renal and duodenal tissue(±s,z/μmol.mg-1.h-1)
Group
n
Renal Ca2+-ATPase
Duodenal Ca2+-ATPase
2nd week
, http://www.100md.com 4th week
2nd week
4th week
A
5
4.323±0.545
4.323±0.545
20.831± 8.125
20.831± 8.125
B
5
5.693±0.472**
, 百拇医药
6.292±0.348**
40.706±14.881**
46.575±18.209**
C
5
5.861±0.413**
5.927±0.328**
42.324±15.873**
44.736±19.285**
, 百拇医药 **P<0.01 vs group A 本研究成功建立大鼠实验性高钙尿症模型。维生素D3用量为每天10 IU/g，连用3周，既无严重的维生素D3中毒表现，又达到高尿钙要求，结果3 d后尿钙明显增加，并持续到实验结束。病理对照组2周和4周血钙、磷均显著升高，而血ALP则显著下降，符合注射维生素D3后常见的血生化指标改变。在此模型上观察羟乙膦酸钠的降尿钙作用及其机制。
传统观念认为持续性尿钙丢失，致负钙平衡，可引起骨矿化减少，出现骨质疏松。1996年Weisinger等[3]总结其他作者研究成果并结合他们的一系列研究，提出了与传统观念截然相反的观点：认为骨钙吸收增加是IH发病的又一重要机制，正是由于骨动员增加，血钙升高后才导致尿钙排泄增加。根据这一理论，他们认为限钙治疗对IH患者是不足取的，因为限钙后可进一步促进骨钙吸收，加重尿钙排泄[7]。受到上述研究的启发，本实验应用骨吸收抑制剂--羟乙膦酸钠，以观察其对高钙尿症的疗效。该药系二磷酸盐类药物，目前主要用于骨质疏松的治疗。它对磷酸钙有很强的亲和性，可抑制羟磷灰石结晶及其结晶前物质的形成和生长，低剂量时足以抑制破骨细胞介导的骨吸收，防止骨量丢失。其抑制骨吸收的机制可能有以下3种方式：(1)干扰成熟破骨细胞的功能。(2)影响破骨细胞最初阶段的活性。(3)改变骨基质的性质，抑制破骨细胞活性。本研究发现羟乙膦酸钠治疗组尿Ca2+/Cr及UCa2+在用药2周时轻度升高，但4周时则呈明显的降尿钙作用。从血钙、磷和ALP变化分析，ALP早期升高，4周时回落，是否表示该药早期有一定的骨吸收作用，值得进一步研究。但长期应用成骨作用大于破骨活性，可显著降低尿钙含量，对高钙尿症有一定的疗效。令人感兴趣的是，羟乙膦酸钠治疗后尿NAG/Cr比值也显著下降，且与尿钙定量呈正相关，而尿NAG/Cr值是反映肾小管损伤的敏感指标之一，说明羟乙膦酸钠不仅有降尿钙作用，而且可减少高尿钙对肾小管-间质的损害，起到保肾的作用。进一步研究发现羟乙膦酸钠治疗组，肾和十二指肠钙泵活性与病理对照组无显著差异，提示其降尿钙作用不依赖钙泵活性的变化。羟乙膦酸钠可治疗高钙尿症从另一方面又恰恰证实Weisinger 等的观点，即骨钙吸收是IH的病因，而不是结果。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270345)
作者简介：赵东宝(1965-)，男(汉族)，博士，主治医师，讲师
赵东宝(第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433)
崔若兰(第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433)
袁伟杰(第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433)
参考文献
[1] Garcia NV, Ferrandez C, Monge M, et al. Bone mineral density in pediatric patients with idiopathic hypercalciuria[J]. Pediatr Nephrol, 1997, 11(5): 578-584.
, 百拇医药
[2] Ghazali A, Fuentes V, Desaint C, et al. Low bone mineral density and peripheral blood monocyte activation profile in calcium stone formers with idiopathic hypercalciuria[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1997, 82(1):32-38.
[3] Weisinger JR. New insights into the pathogenesis of idiopathic hypercalciuria: the role of bone[J]. Kidney Int, 1996, 49(5):1507-1518.
[4] Tekin N, Kural N,Torun M . Renal function in children with hypercalciuria[J]. Truk J Pediatr, 1997,39(3):335-340.
, 百拇医药
[5] Turkmen M, Kavukcu S, Islekl H,et al. Urinary N-acetyl-beta-D-glucosamindase activity in rabbit with experimental hypercalciuria[J]. Pediatr Nephrol,1997,11(4):481-485.
[6] Vezzoli G, Reina MC, Zerbi S, et al. (Ca2+,Mg2+)ATPase and calcium influx in erythrocytes of patients with idiopathic hypercalciuria[J]. Biochem Biophys Res Commun，1995, 217(3):1099-1105.
[7] Weisinger JR, Alonzo E, Bellorin FE, et al. Possible role of cytokines on the bone mineral loss in idiopathic hypercalciuria[J]. Kidney Int, 1996, 49(1):244-250., 百拇医药
赵东宝 崔若兰 袁伟杰
摘 要 目的：观察骨吸收抑制剂羟乙膦酸钠对实验性高钙尿症的防治作用，并探讨其可能机制。方法：建立大鼠实验性高钙尿症模型，观察羟乙膦酸钠治疗后2周和4周的尿钙，Ca2+/Cr，NAG/Cr，以及肾和十二指肠Ca2+-ATP酶(钙泵)的变化。结果：2周时尿钙，Ca2+/Cr，血ALP虽有所升高，但4周时尿钙，Ca2+/Cr，NAG/Cr及血ALP均显著下降(P<0.01)，24 h尿钙定量与尿NAG/Cr值呈正相关；而靶组织钙泵活性无显著改变。结论：骨吸收抑制剂具降尿钙和保肾作用，其机制不依赖钙泵活性的改变。
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关键词：高钙尿症；羟乙膦酸钠
高钙尿症尤其特发性高钙尿症(idiopathic hypercalciuria,IH)是泌尿系结石和单纯血尿常见病因[1，2]。本病病因不明，一直缺乏有效治疗方法。积极探讨IH发病机制和开发防治新药是临床之急需。最近，Weisinger等[3]研究认为骨钙吸收增加是IH发病重要机制之一，推测抑制骨钙吸收可起到降尿钙作用。本研究建立大鼠实验性高钙尿症模型，观察骨吸收抑制剂--羟乙膦酸钠对该病的防治作用，并探讨其可能机制，旨在为临床用药提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 大鼠实验性高钙尿症模型的建立 健康雄性SD大鼠(第二军医大学实验动物中心)，每天腹腔注射维生素D3 10 IU/g，共3周，分别于实验后第1,3,7,14和28天留取大鼠24 h尿量，测定尿钙和尿肌酐(UCr)，3 d后尿钙显著升高，并持续至实验结束(4周末)，证实高钙尿症模型建立。SD大鼠30只，随机分为3组：(1)A组(正常对照组，n=10)；(2)B组(高钙尿症对照组，n=10)：腹腔注射维生素D3；(3)C组(羟乙膦酸钠干预组，n=10 )：同B组，注射维生素D3后，予羟乙膦酸钠隔天灌胃，剂量每100 g体质量5 mg。分别于实验后2周和4周随机处死大鼠各5只，取血、肾和十二指肠组织标本。
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1.2 观察指标和检测方法
1.2.1 24 h尿钙定量测定 收集大鼠24 h尿液，测定尿钙和UCr含量，换算Ca2+/Cr比值和24 h尿钙定量(UCa2+)。
1.2.2 血生化指标的测定 大鼠分批于实验后2周和4周末取血，测定血钙、磷、碱性磷酸酶(ALP)等 。
1.2.3 尿N-乙酰-β-D-氨基-葡萄糖苷酶(NAG)测定 按试剂盒说明书操作，采用ELISA法测定各组大鼠尿NAG含量，计算尿NAG/Cr值。
1.2.4 肾、十二指肠匀浆ATP酶测定 分别称取肾组织1.0 g和十二指肠组织0.2 g制成组织匀浆，取组织匀浆100 μl，按ATP酶试剂盒说明书操作，测出100 μl组织匀浆在反应过程中分解的无机磷含量，再测出每100 μl组织匀浆中的蛋白含量，前者除以后者得每毫克蛋白分解ATP所产生的无机磷含量，按每小时每毫克蛋白分解ATP产生1 μmol无机磷为一个ATP酶活力单位，即μmol/(mg.h)。
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1.3 统计学处理 数据以
±s表示，采用F检验、Newman-Keuls检验和直线相关分析。2 结 果
2.1 尿Ca2+/Cr和24 h UCa2+的变化 尿Ca2+/Cr和24 h UCa2+值见表1，可见注射维生素D3后2周和4周尿Ca2+/Cr和24 h UCa2+均显著高于正常大鼠(P<0.01)。羟乙膦酸钠治疗2周时Ca2+/Cr和24 h UCa2+虽较B组有所升高，但4周时两者均较B组显著下降(P<0.01)，提示长期应用有良好的降尿钙作用。
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表1 各组尿Ca2+/Cr和24 h尿钙定量
Tab 1 Ca2+/Cr and UCa2+ in different groups(
±s,cB/μmol.L-1)Group
n
Ca2+/Cr
UCa2+
2nd week
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4th week
2nd week
4th week
A
5
0.07±0.04
0.07±0.05
4.89±2.54
5.21±1.43
B
5
0.30±0.26**
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0.41±0.18**
7.62±1.75**
8.28±1.85**
C
5
0.48±0.38**△△
0.10±0.07△△
9.85±2.27**△△
2.18±0.99**△△
**P<0.01 vs group A; △△P<0.01 vs group B2.2 血钙、磷和ALP的变化 B组2周和4周血钙、磷均高于A组，而ALP则低于A组，符合注射维生素D3后血生化变化。C组ALP虽2周时高于B组，但4周时与B组无显著差异(P>0.05)，提示长期应用有抑制骨吸收的作用(图1)。
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图1 各组血清ALP的变化
Fig 1 Serum alkaline phosphatase
at 2nd and 4th week
□: A group; □: B group; □: C group
2.3 尿NAG/Cr的变化 正常大鼠尿NAG/Cr为(1.83±0.68) IU/mmol，注射维生素D3 4周后尿NAG/Cr为(8.21±2.05) IU/mmol，羟乙膦酸钠治疗4周后NAG/Cr为(3.16±1.34) IU/mmol，3组比较差异非常显著(P<0.01)。尿NAG/Cr与24 h UCa2+呈正相关(r=0.69,n=20,P<0.01)。
2.4 肾和十二指肠组织胞液ATP酶的变化 B组2周和4周时Ca2+-ATP酶均显著高于A组(P<0.01)，C组2周和4周时Ca2+-ATP酶也显著高于A组(P<0.01)，但与B组差异不显著(P>0.05)。表2提示羟乙膦酸钠降尿钙作用不依赖肾和十二指肠Ca2+-ATP酶的变化。
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3 讨 论
IH是泌尿系结石和单纯性血尿常见病因。90%以上的泌尿系结石系钙性结石，其中约一半由IH引起；IH在形成结石前尚可引起肉眼或镜下血尿，1/4儿童单纯性血尿的病因为IH。此外，尿钙升高可引起肾钙盐沉积，导致肾小管-间质损害，表现为尿NAG及尿NAG/Cr比值等升高[4，5]。本病病因不清，缺乏有效治疗。因此探讨发病机制和开发防治新药是临床之急需。有认为IH与肠道高吸收钙及肾漏钙有关，并发现维生素D靶组织上Ca2+-ATP酶活性升高，致细胞内外钙平衡失调而引起高钙尿症[6]。Ca2+-ATP酶是钙跨膜转运的重要介质之一，其作用是借助能量ATP将细胞内钙离子泵出细胞外。对维生素D靶组织，活性维生素D促进管腔侧钙离子进入细胞内，而基底膜侧的Ca2+-ATP酶则将胞内钙转运到胞外，从而有利于钙的吸收。
表2 各组肾和十二指肠组织液Ca2+-ATP酶活性的变化
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Tab 2 Activity of Ca2+-ATPase in renal and duodenal tissue(
±s,z/μmol.mg-1.h-1)Group
n
Renal Ca2+-ATPase
Duodenal Ca2+-ATPase
2nd week
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2nd week
4th week
A
5
4.323±0.545
4.323±0.545
20.831± 8.125
20.831± 8.125
B
5
5.693±0.472**
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6.292±0.348**
40.706±14.881**
46.575±18.209**
C
5
5.861±0.413**
5.927±0.328**
42.324±15.873**
44.736±19.285**
, 百拇医药 **P<0.01 vs group A 本研究成功建立大鼠实验性高钙尿症模型。维生素D3用量为每天10 IU/g，连用3周，既无严重的维生素D3中毒表现，又达到高尿钙要求，结果3 d后尿钙明显增加，并持续到实验结束。病理对照组2周和4周血钙、磷均显著升高，而血ALP则显著下降，符合注射维生素D3后常见的血生化指标改变。在此模型上观察羟乙膦酸钠的降尿钙作用及其机制。
传统观念认为持续性尿钙丢失，致负钙平衡，可引起骨矿化减少，出现骨质疏松。1996年Weisinger等[3]总结其他作者研究成果并结合他们的一系列研究，提出了与传统观念截然相反的观点：认为骨钙吸收增加是IH发病的又一重要机制，正是由于骨动员增加，血钙升高后才导致尿钙排泄增加。根据这一理论，他们认为限钙治疗对IH患者是不足取的，因为限钙后可进一步促进骨钙吸收，加重尿钙排泄[7]。受到上述研究的启发，本实验应用骨吸收抑制剂--羟乙膦酸钠，以观察其对高钙尿症的疗效。该药系二磷酸盐类药物，目前主要用于骨质疏松的治疗。它对磷酸钙有很强的亲和性，可抑制羟磷灰石结晶及其结晶前物质的形成和生长，低剂量时足以抑制破骨细胞介导的骨吸收，防止骨量丢失。其抑制骨吸收的机制可能有以下3种方式：(1)干扰成熟破骨细胞的功能。(2)影响破骨细胞最初阶段的活性。(3)改变骨基质的性质，抑制破骨细胞活性。本研究发现羟乙膦酸钠治疗组尿Ca2+/Cr及UCa2+在用药2周时轻度升高，但4周时则呈明显的降尿钙作用。从血钙、磷和ALP变化分析，ALP早期升高，4周时回落，是否表示该药早期有一定的骨吸收作用，值得进一步研究。但长期应用成骨作用大于破骨活性，可显著降低尿钙含量，对高钙尿症有一定的疗效。令人感兴趣的是，羟乙膦酸钠治疗后尿NAG/Cr比值也显著下降，且与尿钙定量呈正相关，而尿NAG/Cr值是反映肾小管损伤的敏感指标之一，说明羟乙膦酸钠不仅有降尿钙作用，而且可减少高尿钙对肾小管-间质的损害，起到保肾的作用。进一步研究发现羟乙膦酸钠治疗组，肾和十二指肠钙泵活性与病理对照组无显著差异，提示其降尿钙作用不依赖钙泵活性的变化。羟乙膦酸钠可治疗高钙尿症从另一方面又恰恰证实Weisinger 等的观点，即骨钙吸收是IH的病因，而不是结果。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270345)
作者简介：赵东宝(1965-)，男(汉族)，博士，主治医师，讲师
赵东宝(第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433)
崔若兰(第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433)
袁伟杰(第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433)
参考文献
[1] Garcia NV, Ferrandez C, Monge M, et al. Bone mineral density in pediatric patients with idiopathic hypercalciuria[J]. Pediatr Nephrol, 1997, 11(5): 578-584.
, 百拇医药
[2] Ghazali A, Fuentes V, Desaint C, et al. Low bone mineral density and peripheral blood monocyte activation profile in calcium stone formers with idiopathic hypercalciuria[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1997, 82(1):32-38.
[3] Weisinger JR. New insights into the pathogenesis of idiopathic hypercalciuria: the role of bone[J]. Kidney Int, 1996, 49(5):1507-1518.
[4] Tekin N, Kural N,Torun M . Renal function in children with hypercalciuria[J]. Truk J Pediatr, 1997,39(3):335-340.
, 百拇医药
[5] Turkmen M, Kavukcu S, Islekl H,et al. Urinary N-acetyl-beta-D-glucosamindase activity in rabbit with experimental hypercalciuria[J]. Pediatr Nephrol,1997,11(4):481-485.
[6] Vezzoli G, Reina MC, Zerbi S, et al. (Ca2+,Mg2+)ATPase and calcium influx in erythrocytes of patients with idiopathic hypercalciuria[J]. Biochem Biophys Res Commun，1995, 217(3):1099-1105.
[7] Weisinger JR, Alonzo E, Bellorin FE, et al. Possible role of cytokines on the bone mineral loss in idiopathic hypercalciuria[J]. Kidney Int, 1996, 49(1):244-250., 百拇医药