L-硝基精氨酸甲酯对实验性葡萄膜炎的影响
http://www.100md.com
37c医学网
L-硝基精氨酸甲酯对实验性葡萄膜炎的影响
高洪瑞 周韵秋 周浩
摘 要 目的：观察一氧化氮 (NO)含量含量在葡萄膜炎房水及玻璃体中的变化及L-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)的治疗效果。方法：采用兔眼玻璃体内注射内毒素脂多糖 (LPS)制备葡萄膜炎模型，以检测房水蛋白浓度、细胞数目和组织病理观察判定炎症程度，同时检测房水及玻璃体中NO的变化，考察 L-NAME在不同时期使用的疗效。结果：葡萄膜炎房水及玻璃体中NO含量显著增高；即刻使用L-NAME，显著降低了NO水平，同时其蛋白浓度、细胞数目及组织炎症程度明显降低；6 h使用L-NAME，则NO浓度下降不显著，蛋白浓度、细胞数目及组织炎症程度没有明显改善。结论：NO参与了葡萄膜炎的病理过程，即刻使用L-NAME可抑制实验性葡萄膜炎的发展。
, http://www.100md.com
关键词：葡萄膜炎,实验性；L-硝基精氨酸甲酯；一氧化氮
葡萄膜炎是一种常见的眼科疾病，具体发病机制尚不完全明确。一氧化氮 ( NO )是重要的生物信号分子和效应分子，在体内广泛参与各种生理病理过程，如调节血管张力，参与神经传递，介导炎症反应和免疫反应等[1]。研究NO在葡萄膜炎中的作用对了解葡萄膜炎的发病机制和寻求新的治疗途径具有重要意义。本实验检测了内毒素脂多糖(LPS)介导的兔眼葡萄膜炎模型房水及玻璃体中NO的改变，并观察了使用结构型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase,cNOS)抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对葡萄膜炎的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 实验动物 色素兔 24只 48眼，雌雄不论，体质量(2.5±0.5) kg，第二军医大学实验动物中心提供，随机分 4 组，每组 6只 12 眼。
1.1.2 主要药剂 (1)无致热源生理盐水 (上海长征医院制剂室), (2) LPS ( Salmonella Typhimurium菌株, Sigma公司), (3) L-NAME(Sigma公司)， (4)一氧化氮酶法试剂盒(南京建成生物技术公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立及治疗 葡萄膜炎组以氯胺酮 30 mg/kg兔耳缘静脉注射麻醉， 由睫状体平坦部向玻璃体注射含 10 ng LPS的生理盐水 20 μl； 正常对照组注射相同容量的生理盐水；即刻(0 h)治疗组在玻璃体注射的同时耳缘静脉注射200 mg/kg的 L-NAME，6 h治疗组在玻璃体注射后 6 h耳缘静脉注射200 mg/kg的L-NAME。
, http://www.100md.com
1.2.2 样本的留取及检测 术后24 h处死动物，每组 6只取一侧眼球抽去房水约0.2 ml后，即取1 μl房水均匀涂布在载玻片上，空心干燥后行Wright染色；然后摘除眼球，去除眼前节，吸取玻璃体约 1 ml ,剪除表面的视网膜组织。房水及玻璃体3 000 r/min离心后取上清液待测，对侧眼球完整摘除，浸泡于4%中性甲醛液中。
1.2.3 房水内细胞计数 载玻片分别由两个熟练的检验人员显微镜下计数，结果取其平均值。
1.2.4 房水蛋白浓度 正常对照组取房水10 μl,其余组取 1 μl ,分别稀释 5倍和 50倍至 50 μl ,采用考马斯亮蓝比色法，按试剂盒说明步骤操作。
1.2.5 房水及玻璃体内NO含量测定 取房水0.05 ml加入双蒸水 0.05 ml稀释至 0.1 ml，玻璃体取上清0.1 ml，以NO的最终代谢产物NO2-/NO3-的浓度代表NO水平，按NO(硝酸酶还原法)试剂盒说明书步骤进行。
, 百拇医药
1.2.6 组织病理检查 眼球火棉胶包埋，制通过视神经的矢状面切片，苏木精-伊红(H-E)染色，光镜检查，组织炎症程度按Tilton等[2]文献的标准分级。
1.3 统计学处理 采用 EXCEL软件，计量资料结果采用方差分析，等级资料采用秩和检验，组间比较为葡萄膜炎与正常对照组比较，各治疗组与葡萄膜炎组相比较。
2 结 果
2.1 房水内细胞计数 葡萄膜炎组房水内的渗出细胞数目较对照组大幅度地升高，L-NAME 即刻 (0 h)使用能显著减少炎性细胞的渗出(P<0.05), 而 6 h治疗组则没有显著差异(表1)。
2.2 房水蛋白浓度 葡萄膜炎有大量的蛋白渗出于前房，L-NAME即刻(0 h)治疗明显降低了蛋白浓度，与葡萄膜炎组间差异有显著性(P<0.05)，而6 h治疗组没有显著差异(表1)。
, 百拇医药
2.3 房水及玻璃体NO含量的改变 在正常对照组，仅有较低水平的NO，葡萄膜炎时明显升高，即刻(0 h)治疗显著降低NO的含量，6 h治疗组NO含量改变与葡萄膜炎组没有明显差异(表1)。
2.4 组织病理检查 葡萄膜炎组的前房有大量细胞渗出和蛋白凝聚成块，虹膜血管扩张充血，虹膜基质层和睫状体有大量的炎细胞浸润。L-NAME 即刻(0 h)治疗组，虹膜充血水肿，表面有少量纤维蛋白及中性粒细胞聚集，虹膜基质及睫状体的炎性细胞浸润明显减轻，L-NAME 6 h治疗组没有明显的改善。
表1 房水内细胞数目、蛋白浓度，房水与玻璃体内NO浓度及组织炎症程度结果
Tab 1 The results of leukocyte number and protein concentration in aqueous humor, nitric oxide concentration
, 百拇医药
in aqueous and vitreous humors and histopathologic examination(n=12,
±s)
Group
Leukocyte
in AH (×109/L)
Protein
in AH (ρB/g.L-1)
NO in AH
, 百拇医药
(cB/μmol.L-1)
NO in VH
(cB/μmol.L-1)
The degree of
inflammation
Control
0.002±0.001
0.462±0.276
34.362± 6.483
27.642± 6.163
, 百拇医药
0
Uveitis
9.048±1.685*
25.359±5.435*
238.624±40.536*
215.367±38.716*
3.85±0.15*
Treatment (0 h)
1.839±1.027△△
5.417±1.541△△
, 百拇医药
61.687± 8.275△△
55.683± 7.475△△
1.50±0.47△△
Treatment (6 h)
9.672±1.966
19.593±4.847
216.362±25.138
186.392±23.162
3.63±0.36
*P<0.05 vs control; △△P<0.01 vs uveitis; AH: Aqueous humors; VH: Vitreous humors
, 百拇医药
3 讨 论
葡萄膜炎的发生发展是有多种炎症介质和细胞因子参与的过程。近来研究表明NO作为重要的信号分子和效应分子，参与炎症反应和免疫反应：(1) NO可作为信使分子激动cGMP，引起血管平滑肌舒张，血管通透性增加，白细胞和蛋白向血管外的渗出增加[3]。(2) NO能诱导被脂多糖激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生 TNFα和 IL等炎症因子，促进炎症反应[4]。(3) NO可激活环氧化酶，使前列腺素的合成增加[5]。(4) NO可与炎症反应中产生的O2-相互作用形成过氧化硝基阴离子 ( ONOO-)，它不仅本身是一种强氧化剂，还可分解为多种毒性产物，一方面能引起细胞正常代谢通路和膜功能的破坏，导致血-房水屏障的结构完整性被破坏；另一方面能损伤 SOD和谷胱甘肽过氧化物酶等体内重要的抗氧化体系，加重了组织的损伤[6]。本研究结果显示葡萄膜炎房水及玻璃体中NO浓度明显升高，0 h使用L-NAME降低NO浓度的同时，房水内蛋白浓度、渗出细胞数目及组织炎症浸润程度等各项炎症指标明显减轻，说明NO能促进葡萄膜炎的发展。
, 百拇医药
NO是以 L-精氨酸为底物在一氧化氮合酶 (NOS)的催化下合成的， NOS主要分为cNOS和iNOS (inducibe NOS)，前者催化合成少量的NO，后者催化合成大量的NO[1]，L-NAME主要抑制 cNOS，比抑制 iNOS强100倍[7]。 iNOS活性在LPS注射后9 h达到高峰[8]。本实验结果显示 6 h使用L-NAME没有明显降低NO含量，没能阻止葡萄膜炎的发展，可能与其对iNOS的抑制力较差有关。0 h使用L-NAME能抑制葡萄膜炎的发展，此时由iNOS催化合成大量NO的过程还没有开始，提示由cNOS催化合成的少量NO参与了早期葡萄膜炎的始动过程。总之，NO在葡萄膜炎中的作用机制可以推测为：由cNOS催化合成的少量NO使血管扩张，炎细胞渗出，渗出的中性粒细胞和单核巨噬细胞在LPS的刺激下，iNOS mRNA表达增强，iNOS活性升高并合成大量的NO，NO反过来刺激诱发中性粒细胞和单核巨噬细胞产生 TNFα和白介素等炎症因子[4]，并促进前列腺素等炎症介质的合成[5]，他们共同作用形成以后的炎症高峰。
, 百拇医药
葡萄膜炎的发生发展是多因素作用的复杂病理过程，本研究显示0 h使用L-NAME减轻了葡萄膜炎，但仍未恢复到对照组水平，说明其抑制了葡萄膜炎病理过程的某些方面，而不是所有环节。■
作者简介：高洪瑞(1968-)，男(汉族)，硕士，主治医师
周韵秋(第二军医大学长征医院眼科，上海 200003)
周浩(第二军医大学长征医院眼科，上海 200003)
高洪瑞(济南军区总医院眼科，济南 250031)
参考文献
[1] Moncada S, Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway[J]. N Engl J Med, 1993,329(27):2002-2012.
, 百拇医药
[2] Tilton RG, Chang K, Corbett JA, et al. Endotoxin-induced uveitis in the rat is attenuated by inhibition of nitric oxide production[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35(8):3278-3288.
[3] Kubes P, Granger DN. Nitric oxide modulates microvascular permeability[J]. Am J Physiol, 1992,262(2 Pt2):H611-H615.
[4] Liew FY. Interactions between cytokine and nitric oxide[J]. Adv Neuroimmunol, 1995,5(2):201-209.
, http://www.100md.com
[5] Salvemini D, Misko TP, Masferrer JL, et al. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(15):7240-7244.
[6] Halliwell B. Oxygen radicals, nitric oxide and human inflammatory joint disease[J]. Ann Rheum Dis, 1995,54(3):505-510.
[7] Furfine ES, Harmon MF, Paith JE, et al. Selective inhibition of constitutive nitric oxide synthase by NG-nitro-L-arginine[J]. Biochemistry, 1993,32(33):8512-8517.
[8] Mandai M, Yoshimura MN, Yoshida M, et al. The role of nitric oxide synthase in endotoxin-induced uveitis:effect of NG-nitro-L-arginine[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35(10):3673-3680., http://www.100md.com
高洪瑞 周韵秋 周浩
摘 要 目的：观察一氧化氮 (NO)含量含量在葡萄膜炎房水及玻璃体中的变化及L-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)的治疗效果。方法：采用兔眼玻璃体内注射内毒素脂多糖 (LPS)制备葡萄膜炎模型，以检测房水蛋白浓度、细胞数目和组织病理观察判定炎症程度，同时检测房水及玻璃体中NO的变化，考察 L-NAME在不同时期使用的疗效。结果：葡萄膜炎房水及玻璃体中NO含量显著增高；即刻使用L-NAME，显著降低了NO水平，同时其蛋白浓度、细胞数目及组织炎症程度明显降低；6 h使用L-NAME，则NO浓度下降不显著，蛋白浓度、细胞数目及组织炎症程度没有明显改善。结论：NO参与了葡萄膜炎的病理过程，即刻使用L-NAME可抑制实验性葡萄膜炎的发展。
, http://www.100md.com
关键词：葡萄膜炎,实验性；L-硝基精氨酸甲酯；一氧化氮
葡萄膜炎是一种常见的眼科疾病，具体发病机制尚不完全明确。一氧化氮 ( NO )是重要的生物信号分子和效应分子，在体内广泛参与各种生理病理过程，如调节血管张力，参与神经传递，介导炎症反应和免疫反应等[1]。研究NO在葡萄膜炎中的作用对了解葡萄膜炎的发病机制和寻求新的治疗途径具有重要意义。本实验检测了内毒素脂多糖(LPS)介导的兔眼葡萄膜炎模型房水及玻璃体中NO的改变，并观察了使用结构型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase,cNOS)抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对葡萄膜炎的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 实验动物 色素兔 24只 48眼，雌雄不论，体质量(2.5±0.5) kg，第二军医大学实验动物中心提供，随机分 4 组，每组 6只 12 眼。
1.1.2 主要药剂 (1)无致热源生理盐水 (上海长征医院制剂室), (2) LPS ( Salmonella Typhimurium菌株, Sigma公司), (3) L-NAME(Sigma公司)， (4)一氧化氮酶法试剂盒(南京建成生物技术公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立及治疗 葡萄膜炎组以氯胺酮 30 mg/kg兔耳缘静脉注射麻醉， 由睫状体平坦部向玻璃体注射含 10 ng LPS的生理盐水 20 μl； 正常对照组注射相同容量的生理盐水；即刻(0 h)治疗组在玻璃体注射的同时耳缘静脉注射200 mg/kg的 L-NAME，6 h治疗组在玻璃体注射后 6 h耳缘静脉注射200 mg/kg的L-NAME。
, http://www.100md.com
1.2.2 样本的留取及检测 术后24 h处死动物，每组 6只取一侧眼球抽去房水约0.2 ml后，即取1 μl房水均匀涂布在载玻片上，空心干燥后行Wright染色；然后摘除眼球，去除眼前节，吸取玻璃体约 1 ml ,剪除表面的视网膜组织。房水及玻璃体3 000 r/min离心后取上清液待测，对侧眼球完整摘除，浸泡于4%中性甲醛液中。
1.2.3 房水内细胞计数 载玻片分别由两个熟练的检验人员显微镜下计数，结果取其平均值。
1.2.4 房水蛋白浓度 正常对照组取房水10 μl,其余组取 1 μl ,分别稀释 5倍和 50倍至 50 μl ,采用考马斯亮蓝比色法，按试剂盒说明步骤操作。
1.2.5 房水及玻璃体内NO含量测定 取房水0.05 ml加入双蒸水 0.05 ml稀释至 0.1 ml，玻璃体取上清0.1 ml，以NO的最终代谢产物NO2-/NO3-的浓度代表NO水平，按NO(硝酸酶还原法)试剂盒说明书步骤进行。
, 百拇医药
1.2.6 组织病理检查 眼球火棉胶包埋，制通过视神经的矢状面切片，苏木精-伊红(H-E)染色，光镜检查，组织炎症程度按Tilton等[2]文献的标准分级。
1.3 统计学处理 采用 EXCEL软件，计量资料结果采用方差分析，等级资料采用秩和检验，组间比较为葡萄膜炎与正常对照组比较，各治疗组与葡萄膜炎组相比较。
2 结 果
2.1 房水内细胞计数 葡萄膜炎组房水内的渗出细胞数目较对照组大幅度地升高，L-NAME 即刻 (0 h)使用能显著减少炎性细胞的渗出(P<0.05), 而 6 h治疗组则没有显著差异(表1)。
2.2 房水蛋白浓度 葡萄膜炎有大量的蛋白渗出于前房，L-NAME即刻(0 h)治疗明显降低了蛋白浓度，与葡萄膜炎组间差异有显著性(P<0.05)，而6 h治疗组没有显著差异(表1)。
, 百拇医药
2.3 房水及玻璃体NO含量的改变 在正常对照组，仅有较低水平的NO，葡萄膜炎时明显升高，即刻(0 h)治疗显著降低NO的含量，6 h治疗组NO含量改变与葡萄膜炎组没有明显差异(表1)。
2.4 组织病理检查 葡萄膜炎组的前房有大量细胞渗出和蛋白凝聚成块，虹膜血管扩张充血，虹膜基质层和睫状体有大量的炎细胞浸润。L-NAME 即刻(0 h)治疗组，虹膜充血水肿，表面有少量纤维蛋白及中性粒细胞聚集，虹膜基质及睫状体的炎性细胞浸润明显减轻，L-NAME 6 h治疗组没有明显的改善。
表1 房水内细胞数目、蛋白浓度，房水与玻璃体内NO浓度及组织炎症程度结果
Tab 1 The results of leukocyte number and protein concentration in aqueous humor, nitric oxide concentration
, 百拇医药
in aqueous and vitreous humors and histopathologic examination(n=12,
±s)Group
Leukocyte
in AH (×109/L)
Protein
in AH (ρB/g.L-1)
NO in AH
, 百拇医药
(cB/μmol.L-1)
NO in VH
(cB/μmol.L-1)
The degree of
inflammation
Control
0.002±0.001
0.462±0.276
34.362± 6.483
27.642± 6.163
, 百拇医药
0
Uveitis
9.048±1.685*
25.359±5.435*
238.624±40.536*
215.367±38.716*
3.85±0.15*
Treatment (0 h)
1.839±1.027△△
5.417±1.541△△
, 百拇医药
61.687± 8.275△△
55.683± 7.475△△
1.50±0.47△△
Treatment (6 h)
9.672±1.966
19.593±4.847
216.362±25.138
186.392±23.162
3.63±0.36
*P<0.05 vs control; △△P<0.01 vs uveitis; AH: Aqueous humors; VH: Vitreous humors
, 百拇医药
3 讨 论
葡萄膜炎的发生发展是有多种炎症介质和细胞因子参与的过程。近来研究表明NO作为重要的信号分子和效应分子，参与炎症反应和免疫反应：(1) NO可作为信使分子激动cGMP，引起血管平滑肌舒张，血管通透性增加，白细胞和蛋白向血管外的渗出增加[3]。(2) NO能诱导被脂多糖激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生 TNFα和 IL等炎症因子，促进炎症反应[4]。(3) NO可激活环氧化酶，使前列腺素的合成增加[5]。(4) NO可与炎症反应中产生的O2-相互作用形成过氧化硝基阴离子 ( ONOO-)，它不仅本身是一种强氧化剂，还可分解为多种毒性产物，一方面能引起细胞正常代谢通路和膜功能的破坏，导致血-房水屏障的结构完整性被破坏；另一方面能损伤 SOD和谷胱甘肽过氧化物酶等体内重要的抗氧化体系，加重了组织的损伤[6]。本研究结果显示葡萄膜炎房水及玻璃体中NO浓度明显升高，0 h使用L-NAME降低NO浓度的同时，房水内蛋白浓度、渗出细胞数目及组织炎症浸润程度等各项炎症指标明显减轻，说明NO能促进葡萄膜炎的发展。
, 百拇医药
NO是以 L-精氨酸为底物在一氧化氮合酶 (NOS)的催化下合成的， NOS主要分为cNOS和iNOS (inducibe NOS)，前者催化合成少量的NO，后者催化合成大量的NO[1]，L-NAME主要抑制 cNOS，比抑制 iNOS强100倍[7]。 iNOS活性在LPS注射后9 h达到高峰[8]。本实验结果显示 6 h使用L-NAME没有明显降低NO含量，没能阻止葡萄膜炎的发展，可能与其对iNOS的抑制力较差有关。0 h使用L-NAME能抑制葡萄膜炎的发展，此时由iNOS催化合成大量NO的过程还没有开始，提示由cNOS催化合成的少量NO参与了早期葡萄膜炎的始动过程。总之，NO在葡萄膜炎中的作用机制可以推测为：由cNOS催化合成的少量NO使血管扩张，炎细胞渗出，渗出的中性粒细胞和单核巨噬细胞在LPS的刺激下，iNOS mRNA表达增强，iNOS活性升高并合成大量的NO，NO反过来刺激诱发中性粒细胞和单核巨噬细胞产生 TNFα和白介素等炎症因子[4]，并促进前列腺素等炎症介质的合成[5]，他们共同作用形成以后的炎症高峰。
, 百拇医药
葡萄膜炎的发生发展是多因素作用的复杂病理过程，本研究显示0 h使用L-NAME减轻了葡萄膜炎，但仍未恢复到对照组水平，说明其抑制了葡萄膜炎病理过程的某些方面，而不是所有环节。■
作者简介：高洪瑞(1968-)，男(汉族)，硕士，主治医师
周韵秋(第二军医大学长征医院眼科，上海 200003)
周浩(第二军医大学长征医院眼科，上海 200003)
高洪瑞(济南军区总医院眼科，济南 250031)
参考文献
[1] Moncada S, Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway[J]. N Engl J Med, 1993,329(27):2002-2012.
, 百拇医药
[2] Tilton RG, Chang K, Corbett JA, et al. Endotoxin-induced uveitis in the rat is attenuated by inhibition of nitric oxide production[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35(8):3278-3288.
[3] Kubes P, Granger DN. Nitric oxide modulates microvascular permeability[J]. Am J Physiol, 1992,262(2 Pt2):H611-H615.
[4] Liew FY. Interactions between cytokine and nitric oxide[J]. Adv Neuroimmunol, 1995,5(2):201-209.
, http://www.100md.com
[5] Salvemini D, Misko TP, Masferrer JL, et al. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(15):7240-7244.
[6] Halliwell B. Oxygen radicals, nitric oxide and human inflammatory joint disease[J]. Ann Rheum Dis, 1995,54(3):505-510.
[7] Furfine ES, Harmon MF, Paith JE, et al. Selective inhibition of constitutive nitric oxide synthase by NG-nitro-L-arginine[J]. Biochemistry, 1993,32(33):8512-8517.
[8] Mandai M, Yoshimura MN, Yoshida M, et al. The role of nitric oxide synthase in endotoxin-induced uveitis:effect of NG-nitro-L-arginine[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35(10):3673-3680., http://www.100md.com