HPLC法测定阿霉素毫微粒经肝动脉灌注后大鼠体内的早期动态分布
HPLC法测定阿霉素毫微粒经肝动脉灌注后大鼠体内的早期动态分布
陈江浩 王执民 吴道澄 徐山淡 陈海微 文爱东
摘 要：目的 检测阿霉素毫微粒(NADM)经肝动脉灌注后，在大鼠体内的药物分布，并与游离阿霉素(FADM)相比较. 方法 以α-聚氰基丙烯酸正丁酯为载体材料，制备NADM；SD纯系大鼠24只，随机分为两组，每组12只动物，经肝动脉分别注入NADM与FADM，药物剂量2 mg.kg-1，药物浓度1.0 g.L-1. 每组于给药后1, 5, 15 h各处死4只大鼠，分别提取血浆、肝、心、脾、肺、肾样品，以反相高效液相色谱荧光检测法(RP-HPLC)测定药物浓度. 结果 与FADM组相比，1, 5, 15 h时NADM组大鼠肝、脾中阿霉素浓度显著增高，而血浆、肺、肾中阿霉素浓度降低. 心脏药物浓度给药后1 h, 5 h FADM组高于NADM组，15 h时低于NADM组. 结论 NADM肝动脉给药后改变了阿霉素的体内分布特征，对肝、脾表现出明显的靶向性，而血、心、肺、肾中的药物分布减少.
, 百拇医药
关键词：阿霉素；毫微粒；药代动力学；大鼠
0 引言
药代动力学研究表明， 药物ia给药后， 其分布Ⅰ相与iv给药相比发生显著改变， 靶器官药物分布量不受血流分布的影响， 而成为全身药物分布量最大之所在[1]. 毫微粒(nanoparticles)是近些年来研究开发的一种新型纳米级药物载体， 具有无毒、 稳定、 生物相容性好、 可生物降解等特点， 并可作为异物被网状内皮系统(reticuloendothelial system， RES)吞噬从而表现出一定的被动靶向功能[2]. 然而， 目前有关毫微粒ia后的药物分布研究尚少有报道. 我们将自制的阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒(adriamycin-loaded polybutylcyanoacrylate nanoparticle， NADM)经肝动脉注射于大鼠，以反相高效液相色谱荧光检测法(reverse phase-high performance liquid chromatography with fluorescence detector，RP-HPLC)检测不同时间点体内药物分布，并与游离阿霉素(free adriamycin，FADM)进行比较.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 日本Shimadzu Lc-6A高效液相色谱仪，RF-530荧光检测器，C-R3A数据处理仪，YMG-C18H37色谱柱(300 mm×5 mm). 盐酸ADM对照品(上海医药工业研究院)，盐酸ADM(意大利爱宝药厂)，盐酸正定霉素(daunomycin，DM意大利)，氯仿、甲醇、冰醋酸、磷酸二氢铵等均采用分析纯. NADM为我科与化学教研室采用界面聚合法自行制备，平均粒径93.1 nm (Fig 1). SD纯系大白鼠24只，220～250 g，雄性，本校实验动物中心提供.
图1 阿霉素毫微粒的透射电镜照片
Fig 1 Transmission electron micrograph of adriamycin-loaded nanoparticles ×150 000
, 百拇医药
1.2 方法 将动物随机分为两组，每组12只大鼠. 动物经20 g.L-1戊巴比妥钠按40 mg.kg-1 ip麻醉后，沿腹白线切开2.5～3 cm，暴露肝脏. 手术显微镜下以自制导管经胃十二指肠动脉行肝固有动脉插管，按分组分别注射FADM和NADM，药物剂量2 mg.kg-1体质量，药物质量浓度1 g.L-1. 每组于给药后1, 5, 15 h各处死4只大鼠，从心腔抽取全血2.0 mL， 分离血浆后进行预处理: 1.0 mL血浆，加内标物DM甲醇溶液20 μL (20 mg.L-1)混匀，加氯仿-甲醇(4∶1)混合液5 mL，振摇5 min后离心(300 r.min-1)，取氯仿层以37℃氮气吹干，残渣加50 μL甲醇定容，进样40 μL供HPLC分析. 取肝、心、脾、肺、肾组织各1 g，加磷酸盐缓冲溶液2 mL，直流恒温搅拌器6000 r.min-1匀浆，加内标20 μL，再加氯仿-甲醇(4∶1)混合液5 mL，提取方法同血样，残渣以100 μL甲醇定容，进样40 μL供HPLC分析.
, 百拇医药
1.2.1 色谱条件 流动相为甲醇-0.01 mol.L-1磷酸二氢铵-冰醋酸(70∶30∶0.5)混合液， 流速1.0 mL.min-1， 激发波长450 nm， 发射波长530 nm， 室温.
1.2.2 标准曲线的制备 取空白血浆1.0 mL或组织1.0 g，加入一系列质量浓度的ADM标准液，使血浆中ADM质量浓度分别为50, 100, 200, 600, 1000 μg.mL-1，使组织中药物质量分数分别为0.4, 0.8, 1.2, 2.0, 3.6 μg.g-1，加入上述内标液20 μL，按血浆及组织中ADM检测项提取、测定. 在上述检测条件下得到不同浓度的血浆和肝组织标准色谱图. 以样品中ADM峰高与内标DM峰高的比值(hADM/hDM)为应变量(Y)，样品中ADM浓度为自变量(X)，进行回归，得到回归方程.
, 百拇医药
1.2.3 数据处理 将求出的两组数据进行组间Student's t检验，并根据下列公式计算NADM的药物靶向指数(drug targetting index，DTI)和药物选择性指数(drug selective index，DSI).
2 结果
与FADM组相比， 1, 5, 15 h时NADM组大鼠肝、 脾中阿霉素浓度显著增高， 而血浆、 肺、 肾中阿霉素质量浓度降低. 心脏药物质量浓度给药后1 h, 5 h FADM组高于NADM组，15 h时低于NADM组(Tab 1).
NADM对肝、脾表现出明显的靶向性，其给药后1 h平均药物浓度分别为13.892 μg.g-1, 7.156 μg.g-1，DTI分别为10.819, 3.592. 以血浆为非靶器官计算，DSI分别是18.824, 9.696 (Tab 1, 2).
, 百拇医药
表1 肝动脉注射FADM和NADM后1 h大鼠体内药物分布及组间差异比较
Tab 1 Body distribution of FADM and NADM at 1 h after administration into hepatic artery of rats
(n=4, X±s)
Tissue
FADM
NADM
1 h
5 h
15 h
1 h
, 百拇医药
5 h
15 h
Plasma(mg.L-1)
1.64±0.37
0.72±0.14
0.26±0.14
0.74±0.23c
0.36±0.09c
0.27±0.13a
Heart(μg.g-1)
, 百拇医药
0.54±0.21
0.44±0.21
0.11±0.06
0.15±0.04b
0.06±0.02b
0.01±0.00b
Liver(μg.g-1)
1.28±0.45
0.78±0.20
0.36±0.19
, 百拇医药
13.89±4.50c
6.73±2.34c
4.70±1.44c
Spleen(μg.g-1)
1.99±1.22
1.39±0.55
0.44±0.23
7.16±1.57c
3.96±0.87c
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1.62±0.64b
Lung(μg.g-1)
1.67±0.50
0.84±0.20
0.53±0.16
1.09±0.47a
0.69±0.24a
0.22±0.11b
Kidney(μg.g-1)
, 百拇医药
1.79±0.75
1.36±0.55
0.31±0.17
0.87±0.22a
0.45±0.14b
0.22±0.09a
FADM: free adriamycin; NADM: nanoparticle-associated adriamycin. aP>0.05, bP<0.05, cP<0.01.表2 给药后1, 5, 15 h NADM对肝、脾的DTI和DSI数据
, 百拇医药 Tab 2 DTI and DSI of liver and spleen at 1, 5, 15 h after NADM administration
(n=4)
Tissue
DTI
DSI
1 h
5 h
15 h
1 h
5 h
15 h
, 百拇医药
Liver
10.819
8.681
12.915
18.824
18.484
17.283
Spleen
3.592
2.852
3.736
9.696
10.868
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5.974
DTI: drug targetting index; DSI: drug selective index，make plasma as the non-tagetting organ. 各时间点均以NADM组肝脏药物浓度为最高，其平均药物浓度值分别为13.892, 6.728, 4.701 μg.g-1；以NADM组心脏药物浓度为最低，平均药物浓度分别为0.147, 0.059, 0.011 μg.g-1 (Tab 1).
3 讨论
实验结果表明，NADM对肝、脾表现出明显的靶向行为. 我们分析其机制在于：①采用动脉途径给药时，药物表现出明显的首过效应，其靶器官分布量显著高于静脉给药方式[1]. Fety等[3]用Fotemustine对肝转移瘤患者行ia和iv的药代动力学比较研究，发现ia时药物的肝首过提取率最高达0.9，血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)较iv减少50%; ②载药毫微粒表面的粘附性及小的粒径，增加了药物与血管壁的接触时间与接触面积； ③毫微粒有助于药物透过血管壁，增加药物的血管外分布[4]； ④毫微粒作为异物被网状内皮细胞吞噬，因此对肝、脾形成被动靶向性[2]. Chiannilkulchai等[5]用透射电镜检查发现肝脏Kupffer细胞对NADM具有强大的摄取能力，成为有效的药物贮库.
, 百拇医药
本实验中发现，毫微粒减少了肺组织中的药物浓度，与一些学者的报道相反[6]，原因可能在于：①动脉给药增加了肝脏摄药量从而使肺内药物分布相对减少；②表面修饰、粒径大小的不同；③毫微粒所携载药物对其表面电荷的影响. 也有学者发现，肺药物浓度在给药后短时间内较高但随即迅速降低[7, 8]，认为可能与聚合物降解、再分布以及尘细胞的移动有关. 其确切机制有待进一步阐明.
心脏药物浓度给药后1 h, 5 h FADM组高于NADM组，15 h时低于NADM组，提示NADM可能延长了药物的消除半衰期，国外学者也有类似报道[2, 9]. 在本实验中，因血药浓度检测的时间点有限，无法据此得出肯定的结论，尚需做进一步的药代动力学研究.
此外， NADM减少了心、 肾药物含量. Verdun等[2]对阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒iv后的药物分布研究中亦取得了相似的结果. 表明NADM可大大降低阿霉素的心脏毒性，从而增加其使用安全性.
, 百拇医药
作者简介：陈江浩(1972-)，男(汉族)，陕西省宝鸡市人.硕士生(导师王执民).Tel.(029)3577527 Email.vascular2@fmmu.edu.cn
陈江浩(第四军医大学唐都医院介入放射科,陕西 西安 710038)
王执民(第四军医大学唐都医院介入放射科,陕西 西安 710038)
吴道澄(第四军医大学：基础部化学教研室，陕西 西安 710033)
徐山淡(第四军医大学唐都医院介入放射科,陕西 西安 710038)
陈海微(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
文爱东(第四军医大学：西京医院药剂科，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
参考文献
[1]李麟荪. 临床介入治疗学[M]. 南京: 江苏科学技术出版社,1994:1-5.
[2]Verdun C, Brasseur F, Vranckx H et al. Tissue distribution of doxorubicin associated with polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles [J]. Cancer Chemother Pharmacol,1990;26(1):13-18.
[3]Fety R, Lucas C, Solere P et al. Hepatic intra-arterial infusion of fotemustine: pharmacokinetics [J]. Cancer Chemother Pharmacol,1992;31(2):118-122.
, 百拇医药
[4]Andrieu V, Fessi H, Dubrasquet M et al. Pharmacokinetic evaluation of indomethacin nanocapsules [J]. Drug Des Deliv,1989;4(4):295-302.
[5]Chiannilkulchai N, Ammoury N, Caillou B et al. Hepatic tissue distribution of doxorubicin-loaded nanoparticles after i.v. administration in reticulosarcoma M 5076 metastasis-bearing mice [J]. Cancer Chemother Pharmacol,1990;26(2):122-126.
[6]Couvreur P, Kante B, Lenaerts V et al. Tissue distribution of antitumor drugs associated with polyalkylcyanoacrylate nanoparticles [J]. J Pharm Sci, 1980;69(2):199-201.
, 百拇医药
[7]Simon BH, Ando HY, Gupta PK et al. Circulation time and body distribution of 14C-labeled amino-modified polystyrene nanoparticles in mice [J]. J Pharm Sci,1995;84(10):1249-1253.
[8]Borchardt G, Brandriss S, Kreuter J et al. Body distribution of 75 Se-radiolabeled silica nanoparticles covalently coated with omega-functionalized surfactants after intravenous injection in rats [J]. J Drug Target,1994;2(1):61-77.
[9]Leroux JC, Cozens R, Roesel JL et al. Pharmacokinetics of a novel HIV-1 protease inhibitor incorporated into biodegradable or enteric nanoparticles following intravenous and oral administration to mice [J]. J Pharm Sci,1995;84(12):1387-1391., 百拇医药
陈江浩 王执民 吴道澄 徐山淡 陈海微 文爱东
摘 要：目的 检测阿霉素毫微粒(NADM)经肝动脉灌注后，在大鼠体内的药物分布，并与游离阿霉素(FADM)相比较. 方法 以α-聚氰基丙烯酸正丁酯为载体材料，制备NADM；SD纯系大鼠24只，随机分为两组，每组12只动物，经肝动脉分别注入NADM与FADM，药物剂量2 mg.kg-1，药物浓度1.0 g.L-1. 每组于给药后1, 5, 15 h各处死4只大鼠，分别提取血浆、肝、心、脾、肺、肾样品，以反相高效液相色谱荧光检测法(RP-HPLC)测定药物浓度. 结果 与FADM组相比，1, 5, 15 h时NADM组大鼠肝、脾中阿霉素浓度显著增高，而血浆、肺、肾中阿霉素浓度降低. 心脏药物浓度给药后1 h, 5 h FADM组高于NADM组，15 h时低于NADM组. 结论 NADM肝动脉给药后改变了阿霉素的体内分布特征，对肝、脾表现出明显的靶向性，而血、心、肺、肾中的药物分布减少.
, 百拇医药
关键词：阿霉素；毫微粒；药代动力学；大鼠
0 引言
药代动力学研究表明， 药物ia给药后， 其分布Ⅰ相与iv给药相比发生显著改变， 靶器官药物分布量不受血流分布的影响， 而成为全身药物分布量最大之所在[1]. 毫微粒(nanoparticles)是近些年来研究开发的一种新型纳米级药物载体， 具有无毒、 稳定、 生物相容性好、 可生物降解等特点， 并可作为异物被网状内皮系统(reticuloendothelial system， RES)吞噬从而表现出一定的被动靶向功能[2]. 然而， 目前有关毫微粒ia后的药物分布研究尚少有报道. 我们将自制的阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒(adriamycin-loaded polybutylcyanoacrylate nanoparticle， NADM)经肝动脉注射于大鼠，以反相高效液相色谱荧光检测法(reverse phase-high performance liquid chromatography with fluorescence detector，RP-HPLC)检测不同时间点体内药物分布，并与游离阿霉素(free adriamycin，FADM)进行比较.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 日本Shimadzu Lc-6A高效液相色谱仪，RF-530荧光检测器，C-R3A数据处理仪，YMG-C18H37色谱柱(300 mm×5 mm). 盐酸ADM对照品(上海医药工业研究院)，盐酸ADM(意大利爱宝药厂)，盐酸正定霉素(daunomycin，DM意大利)，氯仿、甲醇、冰醋酸、磷酸二氢铵等均采用分析纯. NADM为我科与化学教研室采用界面聚合法自行制备，平均粒径93.1 nm (Fig 1). SD纯系大白鼠24只，220～250 g，雄性，本校实验动物中心提供.
图1 阿霉素毫微粒的透射电镜照片
Fig 1 Transmission electron micrograph of adriamycin-loaded nanoparticles ×150 000
, 百拇医药
1.2 方法 将动物随机分为两组，每组12只大鼠. 动物经20 g.L-1戊巴比妥钠按40 mg.kg-1 ip麻醉后，沿腹白线切开2.5～3 cm，暴露肝脏. 手术显微镜下以自制导管经胃十二指肠动脉行肝固有动脉插管，按分组分别注射FADM和NADM，药物剂量2 mg.kg-1体质量，药物质量浓度1 g.L-1. 每组于给药后1, 5, 15 h各处死4只大鼠，从心腔抽取全血2.0 mL， 分离血浆后进行预处理: 1.0 mL血浆，加内标物DM甲醇溶液20 μL (20 mg.L-1)混匀，加氯仿-甲醇(4∶1)混合液5 mL，振摇5 min后离心(300 r.min-1)，取氯仿层以37℃氮气吹干，残渣加50 μL甲醇定容，进样40 μL供HPLC分析. 取肝、心、脾、肺、肾组织各1 g，加磷酸盐缓冲溶液2 mL，直流恒温搅拌器6000 r.min-1匀浆，加内标20 μL，再加氯仿-甲醇(4∶1)混合液5 mL，提取方法同血样，残渣以100 μL甲醇定容，进样40 μL供HPLC分析.
, 百拇医药
1.2.1 色谱条件 流动相为甲醇-0.01 mol.L-1磷酸二氢铵-冰醋酸(70∶30∶0.5)混合液， 流速1.0 mL.min-1， 激发波长450 nm， 发射波长530 nm， 室温.
1.2.2 标准曲线的制备 取空白血浆1.0 mL或组织1.0 g，加入一系列质量浓度的ADM标准液，使血浆中ADM质量浓度分别为50, 100, 200, 600, 1000 μg.mL-1，使组织中药物质量分数分别为0.4, 0.8, 1.2, 2.0, 3.6 μg.g-1，加入上述内标液20 μL，按血浆及组织中ADM检测项提取、测定. 在上述检测条件下得到不同浓度的血浆和肝组织标准色谱图. 以样品中ADM峰高与内标DM峰高的比值(hADM/hDM)为应变量(Y)，样品中ADM浓度为自变量(X)，进行回归，得到回归方程.
, 百拇医药
1.2.3 数据处理 将求出的两组数据进行组间Student's t检验，并根据下列公式计算NADM的药物靶向指数(drug targetting index，DTI)和药物选择性指数(drug selective index，DSI).
2 结果
与FADM组相比， 1, 5, 15 h时NADM组大鼠肝、 脾中阿霉素浓度显著增高， 而血浆、 肺、 肾中阿霉素质量浓度降低. 心脏药物质量浓度给药后1 h, 5 h FADM组高于NADM组，15 h时低于NADM组(Tab 1).
NADM对肝、脾表现出明显的靶向性，其给药后1 h平均药物浓度分别为13.892 μg.g-1, 7.156 μg.g-1，DTI分别为10.819, 3.592. 以血浆为非靶器官计算，DSI分别是18.824, 9.696 (Tab 1, 2).
, 百拇医药
表1 肝动脉注射FADM和NADM后1 h大鼠体内药物分布及组间差异比较
Tab 1 Body distribution of FADM and NADM at 1 h after administration into hepatic artery of rats
(n=4, X±s)
Tissue
FADM
NADM
1 h
5 h
15 h
1 h
, 百拇医药
5 h
15 h
Plasma(mg.L-1)
1.64±0.37
0.72±0.14
0.26±0.14
0.74±0.23c
0.36±0.09c
0.27±0.13a
Heart(μg.g-1)
, 百拇医药
0.54±0.21
0.44±0.21
0.11±0.06
0.15±0.04b
0.06±0.02b
0.01±0.00b
Liver(μg.g-1)
1.28±0.45
0.78±0.20
0.36±0.19
, 百拇医药
13.89±4.50c
6.73±2.34c
4.70±1.44c
Spleen(μg.g-1)
1.99±1.22
1.39±0.55
0.44±0.23
7.16±1.57c
3.96±0.87c
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1.62±0.64b
Lung(μg.g-1)
1.67±0.50
0.84±0.20
0.53±0.16
1.09±0.47a
0.69±0.24a
0.22±0.11b
Kidney(μg.g-1)
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1.79±0.75
1.36±0.55
0.31±0.17
0.87±0.22a
0.45±0.14b
0.22±0.09a
FADM: free adriamycin; NADM: nanoparticle-associated adriamycin. aP>0.05, bP<0.05, cP<0.01.表2 给药后1, 5, 15 h NADM对肝、脾的DTI和DSI数据
, 百拇医药 Tab 2 DTI and DSI of liver and spleen at 1, 5, 15 h after NADM administration
(n=4)
Tissue
DTI
DSI
1 h
5 h
15 h
1 h
5 h
15 h
, 百拇医药
Liver
10.819
8.681
12.915
18.824
18.484
17.283
Spleen
3.592
2.852
3.736
9.696
10.868
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5.974
DTI: drug targetting index; DSI: drug selective index，make plasma as the non-tagetting organ. 各时间点均以NADM组肝脏药物浓度为最高，其平均药物浓度值分别为13.892, 6.728, 4.701 μg.g-1；以NADM组心脏药物浓度为最低，平均药物浓度分别为0.147, 0.059, 0.011 μg.g-1 (Tab 1).
3 讨论
实验结果表明，NADM对肝、脾表现出明显的靶向行为. 我们分析其机制在于：①采用动脉途径给药时，药物表现出明显的首过效应，其靶器官分布量显著高于静脉给药方式[1]. Fety等[3]用Fotemustine对肝转移瘤患者行ia和iv的药代动力学比较研究，发现ia时药物的肝首过提取率最高达0.9，血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)较iv减少50%; ②载药毫微粒表面的粘附性及小的粒径，增加了药物与血管壁的接触时间与接触面积； ③毫微粒有助于药物透过血管壁，增加药物的血管外分布[4]； ④毫微粒作为异物被网状内皮细胞吞噬，因此对肝、脾形成被动靶向性[2]. Chiannilkulchai等[5]用透射电镜检查发现肝脏Kupffer细胞对NADM具有强大的摄取能力，成为有效的药物贮库.
, 百拇医药
本实验中发现，毫微粒减少了肺组织中的药物浓度，与一些学者的报道相反[6]，原因可能在于：①动脉给药增加了肝脏摄药量从而使肺内药物分布相对减少；②表面修饰、粒径大小的不同；③毫微粒所携载药物对其表面电荷的影响. 也有学者发现，肺药物浓度在给药后短时间内较高但随即迅速降低[7, 8]，认为可能与聚合物降解、再分布以及尘细胞的移动有关. 其确切机制有待进一步阐明.
心脏药物浓度给药后1 h, 5 h FADM组高于NADM组，15 h时低于NADM组，提示NADM可能延长了药物的消除半衰期，国外学者也有类似报道[2, 9]. 在本实验中，因血药浓度检测的时间点有限，无法据此得出肯定的结论，尚需做进一步的药代动力学研究.
此外， NADM减少了心、 肾药物含量. Verdun等[2]对阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒iv后的药物分布研究中亦取得了相似的结果. 表明NADM可大大降低阿霉素的心脏毒性，从而增加其使用安全性.
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作者简介：陈江浩(1972-)，男(汉族)，陕西省宝鸡市人.硕士生(导师王执民).Tel.(029)3577527 Email.vascular2@fmmu.edu.cn
陈江浩(第四军医大学唐都医院介入放射科,陕西 西安 710038)
王执民(第四军医大学唐都医院介入放射科,陕西 西安 710038)
吴道澄(第四军医大学：基础部化学教研室，陕西 西安 710033)
徐山淡(第四军医大学唐都医院介入放射科,陕西 西安 710038)
陈海微(第四军医大学：基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
文爱东(第四军医大学：西京医院药剂科，陕西 西安 710033)
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参考文献
[1]李麟荪. 临床介入治疗学[M]. 南京: 江苏科学技术出版社,1994:1-5.
[2]Verdun C, Brasseur F, Vranckx H et al. Tissue distribution of doxorubicin associated with polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles [J]. Cancer Chemother Pharmacol,1990;26(1):13-18.
[3]Fety R, Lucas C, Solere P et al. Hepatic intra-arterial infusion of fotemustine: pharmacokinetics [J]. Cancer Chemother Pharmacol,1992;31(2):118-122.
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