阿齐霉素对细胞内弓形虫疗效的实验研究
作者：陆方贤 王海琦 俞淑 陈子庆 杜青 朱兰兰
单位：陆方贤(南京医科大学第一附属医院妇产科 210029)；王海琦(南京医科大学第一附属医院妇产科 210029)；俞淑(南京医科大学第一附属医院妇产科 210029)；陈子庆(中心实验室)杜青(中心实验室)；朱兰兰(中心实验室)
关键词：
江苏医药001122 作者运用MTT比色法检测弓形虫侵入的猴肾细胞在阿齐霉素作用下的增殖情况。为阻断孕妇感染弓形虫宫内垂直感染胎儿制定预防治疗措施时提供科学的实验依据。
材料与方法
一、弓形虫与细胞 弓形虫悬液107/ml(由省农科院畜牧兽医研究所提供)，0.1 ml/只腹腔注射接种18±2 g昆明种雌性小鼠，第4天断颈取腹水，1000转/分离心5分钟，使腹腔细胞沉淀，取上清液，3000转/分离心20分钟，取沉淀，将弓形虫数调整至107/ml，猴肾细胞(由省农科院畜牧兽医研究所提供)铺满培养瓶底面后，用0.25%胰蛋白酶消化1分钟后，倒去加入内含10%小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，在光镜下计数，将细胞数调整至106/ml。
, 百拇医药
二、药物及MTT液配制 称取阿齐霉素10 mg，先用95%乙醇溶解，后用pH 7.2 0.01 M磷酸盐缓冲液进一步稀释，使药物终浓度为2 mg/ml，临用前用培养液稀释至所需浓度。磺胺嘧啶针剂，用1640培养液稀释至2 mg/ml。MTT粉末为Sigma公司产品，用0.01 M磷酸盐缓冲液溶解，工作液5 mg/ml。
三、猴肾细胞增殖的测定 将传代的猴肾细胞浓度调整至106/ml，每孔100 μl，接种至96孔板，设培养液对照，药物对照，培养24小时后换液，同时加入虫体(107/ml)50 μl，培养6小时后，每列再加入阿齐霉素药液50 μl，使最终浓度分别为200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml、0.2 μg/ml、0.02 μg/ml、0.002 μg/ml，磺胺嘧啶最终浓度为200 μg/ml，每组共设3孔，置37℃、5%二氧化碳饱和湿度条件下培养24小时、48小时后，于结束前4小时加MTT工作液10 μl/孔，温育4小时，去上清液100 μl后，加入10%SDS 0.01 mol/L HCl 50 μl，破膜，再温育1小时置酶标仪，波长为570 nm处测定A值，以3孔平均值表示各组细胞生长，计算增殖率(%)＝(A值实验组-A值未加药物组-A值培养液)/(A值未加药物组-A值培养液)×100%。
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结 果
经MTT比色法测定570 nm处光密度值阿齐霉素上述六个浓度作用于受弓形虫侵袭的猴肾细胞24小时后，测得A值与未加药组相比差异有显著性，48小时后，除0.002 μg/ml浓度外其余与未加药组相比均有显著性，与磺胺嘧啶组相比，24小时组阿齐霉素200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml三个浓度差异有显著性，48小时组阿齐霉素200 μg/ml差异有显著性。以上两组药物对细胞无明显的毒性作用。
讨 论
弓形虫感染后可侵袭人体各种组织器官内的有核细胞，以中枢神经系统损害最为严重，孕妇感染后经胎盘垂直传播给胎儿，引起早产、流产、死胎等并发症。人类弓形虫病标准治疗方案，乙胺嘧啶与磺胺嘧啶配合，两者均是叶酸拮抗剂，都会出现骨髓抑制反应，故患者往往不能耐受，对孕妇来说，乙胺嘧啶还有致畸作用。因此，大环内酯类药物长期以来一直被认为是孕妇弓形虫病的首选治疗药物，阿齐霉素是大环内酯类新一代具有缓释作用的药物，具有体内排泄缓慢、半衰期较长的特点。本实验通过MTT比色法检测了不同浓度的阿齐霉素对受弓形虫侵袭的猴肾细胞增殖的影响，并以磺胺嘧啶(200 μg/ml)为对照，结果显示不同浓度的阿齐霉素以及磺胺嘧啶对受弓形虫体侵袭的猴肾细胞均有促进其增殖作用，机理是可能通过抑制细胞内的虫体增殖，而药物本身对细胞无显著影响。而且，阿齐霉素比磺胺嘧啶有更好的抗虫效应，用于妊娠期妇女更为安全。阿齐霉素应用于急性弓形虫病的小鼠模型中，口服200 μg/ml的剂量可完全保护小鼠不致其死亡。
MTT比色法是基于黄色的MTT被活细胞线粒体脱氢酶还原成蓝色甲?NFEC8?，形成量与活细胞数及功能状态呈正相关，MTT测定方法灵敏度高，操作方便，与同位素掺入法测定结果相同。, http://www.100md.com
单位：陆方贤(南京医科大学第一附属医院妇产科 210029)；王海琦(南京医科大学第一附属医院妇产科 210029)；俞淑(南京医科大学第一附属医院妇产科 210029)；陈子庆(中心实验室)杜青(中心实验室)；朱兰兰(中心实验室)
关键词：
江苏医药001122 作者运用MTT比色法检测弓形虫侵入的猴肾细胞在阿齐霉素作用下的增殖情况。为阻断孕妇感染弓形虫宫内垂直感染胎儿制定预防治疗措施时提供科学的实验依据。
材料与方法
一、弓形虫与细胞 弓形虫悬液107/ml(由省农科院畜牧兽医研究所提供)，0.1 ml/只腹腔注射接种18±2 g昆明种雌性小鼠，第4天断颈取腹水，1000转/分离心5分钟，使腹腔细胞沉淀，取上清液，3000转/分离心20分钟，取沉淀，将弓形虫数调整至107/ml，猴肾细胞(由省农科院畜牧兽医研究所提供)铺满培养瓶底面后，用0.25%胰蛋白酶消化1分钟后，倒去加入内含10%小牛血清的1640培养液吹打瓶壁，在光镜下计数，将细胞数调整至106/ml。
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二、药物及MTT液配制 称取阿齐霉素10 mg，先用95%乙醇溶解，后用pH 7.2 0.01 M磷酸盐缓冲液进一步稀释，使药物终浓度为2 mg/ml，临用前用培养液稀释至所需浓度。磺胺嘧啶针剂，用1640培养液稀释至2 mg/ml。MTT粉末为Sigma公司产品，用0.01 M磷酸盐缓冲液溶解，工作液5 mg/ml。
三、猴肾细胞增殖的测定 将传代的猴肾细胞浓度调整至106/ml，每孔100 μl，接种至96孔板，设培养液对照，药物对照，培养24小时后换液，同时加入虫体(107/ml)50 μl，培养6小时后，每列再加入阿齐霉素药液50 μl，使最终浓度分别为200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml、0.2 μg/ml、0.02 μg/ml、0.002 μg/ml，磺胺嘧啶最终浓度为200 μg/ml，每组共设3孔，置37℃、5%二氧化碳饱和湿度条件下培养24小时、48小时后，于结束前4小时加MTT工作液10 μl/孔，温育4小时，去上清液100 μl后，加入10%SDS 0.01 mol/L HCl 50 μl，破膜，再温育1小时置酶标仪，波长为570 nm处测定A值，以3孔平均值表示各组细胞生长，计算增殖率(%)＝(A值实验组-A值未加药物组-A值培养液)/(A值未加药物组-A值培养液)×100%。
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结 果
经MTT比色法测定570 nm处光密度值阿齐霉素上述六个浓度作用于受弓形虫侵袭的猴肾细胞24小时后，测得A值与未加药组相比差异有显著性，48小时后，除0.002 μg/ml浓度外其余与未加药组相比均有显著性，与磺胺嘧啶组相比，24小时组阿齐霉素200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml三个浓度差异有显著性，48小时组阿齐霉素200 μg/ml差异有显著性。以上两组药物对细胞无明显的毒性作用。
讨 论
弓形虫感染后可侵袭人体各种组织器官内的有核细胞，以中枢神经系统损害最为严重，孕妇感染后经胎盘垂直传播给胎儿，引起早产、流产、死胎等并发症。人类弓形虫病标准治疗方案，乙胺嘧啶与磺胺嘧啶配合，两者均是叶酸拮抗剂，都会出现骨髓抑制反应，故患者往往不能耐受，对孕妇来说，乙胺嘧啶还有致畸作用。因此，大环内酯类药物长期以来一直被认为是孕妇弓形虫病的首选治疗药物，阿齐霉素是大环内酯类新一代具有缓释作用的药物，具有体内排泄缓慢、半衰期较长的特点。本实验通过MTT比色法检测了不同浓度的阿齐霉素对受弓形虫侵袭的猴肾细胞增殖的影响，并以磺胺嘧啶(200 μg/ml)为对照，结果显示不同浓度的阿齐霉素以及磺胺嘧啶对受弓形虫体侵袭的猴肾细胞均有促进其增殖作用，机理是可能通过抑制细胞内的虫体增殖，而药物本身对细胞无显著影响。而且，阿齐霉素比磺胺嘧啶有更好的抗虫效应，用于妊娠期妇女更为安全。阿齐霉素应用于急性弓形虫病的小鼠模型中，口服200 μg/ml的剂量可完全保护小鼠不致其死亡。
MTT比色法是基于黄色的MTT被活细胞线粒体脱氢酶还原成蓝色甲?NFEC8?，形成量与活细胞数及功能状态呈正相关，MTT测定方法灵敏度高，操作方便，与同位素掺入法测定结果相同。, http://www.100md.com