逆转录病毒上清液瘤内注射介导体内mdrl基因转移
作者：易善红 杨唐俊 何斌 潘进勇 曾毅
单位：第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆 400037
关键词：裸鼠；逆转录病毒；基因转移；膀胱癌；多药耐药性
第三军医大学学报001117
提 要：目的 探讨逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射介导体内mdrl基因转移。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移mdrl基因，腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性，免疫组化检测肿瘤细胞P-GP的表达，RT-PCR检测肿瘤内mdrl mRNA的表达量。结果 携带mdrl基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型表现出多药耐药性，高滴度病毒上清液可达到60%细胞表达P-GP，是病毒原液基因转移率的2倍；RT-PCR表明，基因转移后肿瘤组织内mdrl mRNA的表达量明显增加。结论 逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射，可发生部分肿瘤细胞的基因转移，高滴度的病毒上清液具有较高的基因转移率。
, 百拇医药
中图法分类号：R394-33;R737.14 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1073-04
mdr1 gene transfer by intra and peri-tumor injection of retrovirus supernatant in nude mice
YI Shan-hong,YANG Tang-jun,HE Bin,PAN Jing-yong,ZENG Yi
(Department of Urology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037,China)
Abstract：Objective To study mdr1 gene transfer by subcutaneous intra-and peri-tumor injection of retroviral supernatant with mdr1 gene in nude mice.Methods The retrovirus supernatant containing mdr1 cDNA was injected into and around the tumors.Multidrug resistance of tumor models was observed by intraperitoneal injection of Adriamycin 5 mg/kg or Colchicine 500 ng/kg.The expressions of P-GP on the membrane and of mdr1 mRNA in cells were detected with immunocytochemical assay and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively.Results Multidrug resistance was showed in the administered tumor models.Comparable high level of P-GP was expressed in 60% cells with the treatment of high titer virus supernatant,which was 2 times of the cells with the low titer virus supernatant.The expression of mdrl mRNA in the tumor tissues was increased significantly in the injected group as compared with control.Conclusion Mdr1 gene transfer can be efficiently increased by the injection of retrovirus supernatant into and around the tumor.High titer retrovirus supernatant is more efficient.
, 百拇医药
Key words:nude mice;retrovirus;gene transfer;bladder cancer,multidrug resistance
体内基因转移效率偏低，是目前临床基因治疗的主要难点之一[1]。本实验旨在应用逆转录病毒上清液瘤内注射的方法将mdrl基因转移至荷瘤根裸鼠的肿瘤细胞内，以期探讨逆转录病毒介导体内基因转移的可行性，为进一步研究体内肿瘤基因转移提供实验依据；同时建立一种具有稳定耐药性的和接近临床病理变化等特点的多药耐药性肿瘤动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物 4～6周BALB/c裸鼠，15～25 g，雌雄不拘，在SPF级饲养条件下喂养。
1.2 细胞
T24为浸润性人膀胱癌细胞，北京医科大学泌尿外科研究所惠赠。质粒pHaMDR1/A为带有mdrl cDNA全序列的逆转录病毒载体，经导入细胞后表达全长的mdrl mRNA[2]。PA317、NIH3T3细胞，我校分子生物学教研室提供。
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1.3 引物
mdrl基因核酸序列引物为本科设计[3]，上游引物序列为5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物序列为5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增的片段长度为157 bp。
1.4 病毒包装、收集、浓缩及滴度测定
脂质体DoTaP介导将载体pHaMDR1/A导入PA317细胞，60 ng/ml 秋水仙素筛选。收集细胞培养上清液，0.45 μm过滤器过滤，6000 r/min低温离心12 h，以原液1%的培养液重悬沉淀；-70 ℃保存。NIH3T3法测定病毒滴度。
1.5 病毒上清液RNA的鉴定及辅助病毒检测
参照TriPureTM试剂盒(购自德国BM公司)说明提取病毒上清液RNA，RT-PCR方法见文献[3]。收集转染阳性NIH3T3细胞的培养上清液，0.45 μm微孔过滤器过滤后再次感染NIH3T3的亲代细胞，秋水仙素筛选。
, 百拇医药
1.6 裸鼠荷瘤模型的建立及基因转染
1×107/ml T24细胞悬液0.1 ml接种于裸鼠皮下，待肿瘤体积达到100 mm3以上，瘤周注射50 μl逆转录病毒上清液，8 h后瘤内再次注射50 μl。隔天注射，连续3次。实验分3组，对照组注射DMEM培养液；高、低滴度组分别注射滴度为2.4×107 CFU/ml及3.1×105 CFU/ml的逆转录病毒上清液。
1.7 肿瘤化疗
分别腹腔注射阿霉素(5 mg/kg)及秋水仙素(500 ng/kg)检测各组肿瘤动物模型的化疗效果。
1.8 肿瘤组织内P-糖蛋白(P-glyco protein,P-GP)的检测
, 百拇医药 采用S-P法免疫组化染色，P-GP单克隆抗体为Sigma公司产品。切片厚度10 μm。0.01 mol/LPBS作为漂洗液，DAB显色，苏木素轻度复染。胞膜有棕黄色颗粒状染色者为阳性。表达强度以阳性细胞所占百分率和显色强度为标准。
1.9 RT-PCR检测组织内mdrl mRNA的表达量
以TriPureTM试剂盒提取肿瘤组织内RNA。RT-PCR方法参照文献[3]。
2 结果
2.1 病毒上清液的收集、浓缩及滴度测定
经DoTaP介导将pHaMDR1/A转染PA317细胞，秋水仙素耐药性筛选得到抗性克隆，命名为PAmdrl。经过滤及离心处理将病毒上清液浓缩100倍。NIH3T3感染法测定病毒滴度，浓缩上清液的滴度为2.4×107 CFU/ml，病毒滴度提高77倍。
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2.2 病毒上清液RNA的鉴定和辅助病毒的检测
PAmdrl细胞的培养上清液RNA扩增出特异性mdrl 157 bp条带，而PA317和NIH3T3细胞未扩增出此特异条带。以转染阳性的NIH3T3细胞的培养液进一步感染亲代细胞NIH3T3，未出现抗性细胞。
2.3 裸鼠荷瘤模型的建立
注射T24细胞悬液后第3天，局部即见肿瘤形成，成瘤率为100%，1周后肿瘤直径为0.3～1.1cm不等。
2.4 肿瘤的化疗
高滴度组的肿瘤生长率为51.2%，低滴度组为34.5%，空白组为20.8%，高滴度组与空白组相差显著(P<0.01)。
2.5 免疫组化对肿瘤组织内P-GP的检测
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高滴度组染色明显较强，且阳性细胞分布面广，而低滴度组相对较弱，空白组更弱，见图1、2。各实验组肿瘤组织P-GP染色阳性细胞率，见表1。
图1 高滴度病毒注射组肿瘤组织P-GP免疫组化染色 (S-P×400)
Fig 1 Immunohischemical staining with McAb P-GP in human bladder cancer grew
in nude mice in high titer virus injection (S-P×400)
图2 对照组肿瘤组织P-GP免疫组化染色 (S-P×400)
, http://www.100md.com
Fig 2 Immunohischemical staining with McAb P-GP in human bladder cancer
grew in nude mice in control group (S-P×400)
表1 各组肿瘤组织P-GP免疫组化染色阳性细胞率
Tab 1 Positive rate of immunohischemical staining with McAb P-GP in human bladder cancer grew in nude mice Group
Strong positive
Weak positive
Negative
, http://www.100md.com
High titer virus group
0.60±0.02* #
0.32±0.03
0.08±0.02
Low titer virus group
0.30±0.01
0.50±0.02
0.20±0.01
Control
0.08±0.01
0.55±0.03
, 百拇医药
0.37±0.03
*：P<0.05 vs low titer;#: P<0.01 vs control
2.6 RT-PCR对瘤组织内mdrl mRNA的检测
3组β-actin的扩增条带基本相同(587 bp)，而mdrl 157 bp的扩增条带出现明显差异，以高滴度组的扩增条带最明显，低滴度组条带次之，空白组最弱，见图3。
图3 RT-PCR检测肿瘤组织内mdr1 mRNA量(2%琼脂糖凝胶)
Fig 3 Confirmation of mdr1 mRNA by RT-PCR in human bladder cancer grew in nude mice (run on a 2% agarose gel and stained by ethidium bromide)
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1：pGEM-7zf(+)+HaeⅡ marker； 2: Control;3: Low titer virus group;4: High titer virus group
3 讨论
多药耐药性是肿瘤化疗失败的主要原因之一。目前很多的药物逆转剂，在细胞培养状态下能很好的逆转肿瘤对化疗药物的抵抗性，如维拉帕米、喹啉、环孢素A等。但是这些逆转剂的应用浓度非常高，人体毒性大，几乎没有临床应用的可能。其他如P-GP单克隆抗体[4]、mdrl核酶[3]多种逆转MDR的方法，也都需要经过动物实验的探讨与证明。
目前认为，多药耐药性主要是由于细胞内mdrl基因过表达，P-GP增加而产生的。本研究利用已经克隆出mdrl基因[2]，采用逆转录病毒注射法向动物肿瘤细胞模型内转移并表达此基因，进而建立耐药性动物肿瘤模型。我们首先制备裸鼠的荷瘤模型，而后将mdrl逆转录病毒上清液注射至荷瘤裸鼠的瘤内和瘤周。我们观察到在应用阿霉素、秋水仙素腹腔注射(2次/周，共3周)后该荷瘤模型肿瘤生长依然旺盛，而对照组肿瘤的生长较慢，证明注射病毒可使肿瘤对化疗药物的耐受性增加。免疫组化染色结果表明，高滴度逆转录病毒介导的强阳性细胞率可达到60%，低滴度组强阳性细胞率也可达到30%。RT-PCR结果也说明基因转移后，肿瘤组织的mdrl mRNA表达量明显增加。以上结果均表明，病毒注射法建立的MDR膀胱癌动物模型具有较高的耐药性表型，可用于研究MDR机制和逆转方法。
, 百拇医药
实体瘤的体内基因转移作为肿瘤基因治疗的重要环节之一，已逐渐成为当前研究的热点[5]。尽管体内基因转移尚存在一定的局限性，如基因转移的效果尚不令人满意，转移方法可能对机体产生的不良影响等，但因其具有符合临床应用要求、异质性强和方法简便等优点，因此体内基因转移技术具有十分广阔的应用前景[6]。
本研究以DoTaP介导将携带mdrl基因的重组逆转录病毒载体pHaMDR1/A导入PA317包装细胞，获得的逆转录病毒原液滴度为3.1×105 CFU/ml。文献认为，PA317细胞包装产生的病毒颗粒滴度较低(一般仅为104～105 CFU/ml)，严重影响了转基因的效率[7]。本研究也表明，逆转录病毒原液的基因转移效率确实较低，限制了其在体内的应用。进而我们采用过滤及低温离心法浓缩逆转录病毒原液，使病毒滴度提高近80倍，实验证实该方法对病毒颗粒的感染能力无任何影响。由于NIH3T3细胞的培养上清液中未能扩增出mdrl的特异性的条带，且再感染实验无细胞克隆形成，表明mdrl逆转录病毒上清液仅具有一次性的感染能力，即无辅助病毒产生。以上结果表明，此逆转录病毒上清液不仅含有mdrl基因，而且能安全、有效地应用于实验研究。
, 百拇医药
现有研究结果表明，目的基因在肿瘤内部转移并表达的多少直接影响着肿瘤基因治疗的效果。Smiley等[8]采用逆转录病毒上清液瘤内注射法，以实现裸鼠黑色素瘤HIV-TK基因转移，结果表明该方法可使36%的细胞表达外援基因，在应用GCV后可得到较好的抑瘤效果。本研究将mdrl基因病毒上清液注射到荷瘤裸鼠的瘤周及瘤内，能使60%的肿瘤细胞发生基因转移，从而肿瘤获得较强的多药耐药性，同时也表明浓缩的病毒上清液具有较好的体内基因转移效率。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670824)
作者简介：易善红(1970-)，男，河南省息县人，硕士，主治医师，讲师，主要从事膀胱癌多药耐药性方面的研究。
参考文献：
[1]Cusack J C,Spitz F R,Nguyen d,et al.High levels of gene transduction in human lung tumors following intralesional injection of recombinant adenorirus[J].Cancer Gene Ther,1996,3(4):245-249.
, 百拇医药
[2]Pastan I,Gottesman M M,Ueta K,et al.A retrovirus carrying an MDRl cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells[J].Proc Natl Acad USA,1988,85(12):4 486-4 490.
[3]何 斌，杨唐俊，金锡御，等.核酶对MDRl基因的体外切割活性[J].中华泌尿外科杂志，1998，19(4)：1-3.
[4]Pearson J W,Fogler W E,Volker K,et al.Reversal of drug resistance in a human colon cancer xenograft expressing MDRl complementary DNA by in vivo administration of MRK-16 monoclonal antibody[J].J Natl Cancer Inst,1991,83(19):1 386-1 391.
, http://www.100md.com
[5]Bonnekoh B,Greenhalgh D A,Bundman D S,et al.Inhibition of melanoma growth by adenoviral mediated HSV-TK gene transfer in vivo[J].J Invest Dermatol,1995,104(3):313-317.
[6]Fujiwara T,Cai D W,Georges R N,et al.Therapeutic effect of a retroviral wild-type p53 expression vectors in an orthotopic lung cancer model[J].J Natl Cancer Inst,1994,86(19):1 458-1 462.
[7]Jolly D.Viral vector systems for gene therapy[J].Cancer gene therapy,1994,1(1):51-64.
[8]Smiley W R,Laubert B,Bradley D,et al.Establishment of parameters for optimal transduction efficiency and antitumor effects with HSV-TK retroviral vector in established solid tumor[J].Human Gene Therapy,1997,8(5):965-977.
收稿日期：2000-01-17
修回日期：2000-09-15, 百拇医药
单位：第三军医大学附属新桥医院泌尿外科，重庆 400037
关键词：裸鼠；逆转录病毒；基因转移；膀胱癌；多药耐药性
第三军医大学学报001117
提 要：目的 探讨逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射介导体内mdrl基因转移。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移mdrl基因，腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性，免疫组化检测肿瘤细胞P-GP的表达，RT-PCR检测肿瘤内mdrl mRNA的表达量。结果 携带mdrl基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型表现出多药耐药性，高滴度病毒上清液可达到60%细胞表达P-GP，是病毒原液基因转移率的2倍；RT-PCR表明，基因转移后肿瘤组织内mdrl mRNA的表达量明显增加。结论 逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射，可发生部分肿瘤细胞的基因转移，高滴度的病毒上清液具有较高的基因转移率。
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中图法分类号：R394-33;R737.14 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1073-04
mdr1 gene transfer by intra and peri-tumor injection of retrovirus supernatant in nude mice
YI Shan-hong,YANG Tang-jun,HE Bin,PAN Jing-yong,ZENG Yi
(Department of Urology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037,China)
Abstract：Objective To study mdr1 gene transfer by subcutaneous intra-and peri-tumor injection of retroviral supernatant with mdr1 gene in nude mice.Methods The retrovirus supernatant containing mdr1 cDNA was injected into and around the tumors.Multidrug resistance of tumor models was observed by intraperitoneal injection of Adriamycin 5 mg/kg or Colchicine 500 ng/kg.The expressions of P-GP on the membrane and of mdr1 mRNA in cells were detected with immunocytochemical assay and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively.Results Multidrug resistance was showed in the administered tumor models.Comparable high level of P-GP was expressed in 60% cells with the treatment of high titer virus supernatant,which was 2 times of the cells with the low titer virus supernatant.The expression of mdrl mRNA in the tumor tissues was increased significantly in the injected group as compared with control.Conclusion Mdr1 gene transfer can be efficiently increased by the injection of retrovirus supernatant into and around the tumor.High titer retrovirus supernatant is more efficient.
, 百拇医药
Key words:nude mice;retrovirus;gene transfer;bladder cancer,multidrug resistance
体内基因转移效率偏低，是目前临床基因治疗的主要难点之一[1]。本实验旨在应用逆转录病毒上清液瘤内注射的方法将mdrl基因转移至荷瘤根裸鼠的肿瘤细胞内，以期探讨逆转录病毒介导体内基因转移的可行性，为进一步研究体内肿瘤基因转移提供实验依据；同时建立一种具有稳定耐药性的和接近临床病理变化等特点的多药耐药性肿瘤动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物 4～6周BALB/c裸鼠，15～25 g，雌雄不拘，在SPF级饲养条件下喂养。
1.2 细胞
T24为浸润性人膀胱癌细胞，北京医科大学泌尿外科研究所惠赠。质粒pHaMDR1/A为带有mdrl cDNA全序列的逆转录病毒载体，经导入细胞后表达全长的mdrl mRNA[2]。PA317、NIH3T3细胞，我校分子生物学教研室提供。
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1.3 引物
mdrl基因核酸序列引物为本科设计[3]，上游引物序列为5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物序列为5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增的片段长度为157 bp。
1.4 病毒包装、收集、浓缩及滴度测定
脂质体DoTaP介导将载体pHaMDR1/A导入PA317细胞，60 ng/ml 秋水仙素筛选。收集细胞培养上清液，0.45 μm过滤器过滤，6000 r/min低温离心12 h，以原液1%的培养液重悬沉淀；-70 ℃保存。NIH3T3法测定病毒滴度。
1.5 病毒上清液RNA的鉴定及辅助病毒检测
参照TriPureTM试剂盒(购自德国BM公司)说明提取病毒上清液RNA，RT-PCR方法见文献[3]。收集转染阳性NIH3T3细胞的培养上清液，0.45 μm微孔过滤器过滤后再次感染NIH3T3的亲代细胞，秋水仙素筛选。
, 百拇医药
1.6 裸鼠荷瘤模型的建立及基因转染
1×107/ml T24细胞悬液0.1 ml接种于裸鼠皮下，待肿瘤体积达到100 mm3以上，瘤周注射50 μl逆转录病毒上清液，8 h后瘤内再次注射50 μl。隔天注射，连续3次。实验分3组，对照组注射DMEM培养液；高、低滴度组分别注射滴度为2.4×107 CFU/ml及3.1×105 CFU/ml的逆转录病毒上清液。
1.7 肿瘤化疗
分别腹腔注射阿霉素(5 mg/kg)及秋水仙素(500 ng/kg)检测各组肿瘤动物模型的化疗效果。
1.8 肿瘤组织内P-糖蛋白(P-glyco protein,P-GP)的检测
, 百拇医药 采用S-P法免疫组化染色，P-GP单克隆抗体为Sigma公司产品。切片厚度10 μm。0.01 mol/LPBS作为漂洗液，DAB显色，苏木素轻度复染。胞膜有棕黄色颗粒状染色者为阳性。表达强度以阳性细胞所占百分率和显色强度为标准。
1.9 RT-PCR检测组织内mdrl mRNA的表达量
以TriPureTM试剂盒提取肿瘤组织内RNA。RT-PCR方法参照文献[3]。
2 结果
2.1 病毒上清液的收集、浓缩及滴度测定
经DoTaP介导将pHaMDR1/A转染PA317细胞，秋水仙素耐药性筛选得到抗性克隆，命名为PAmdrl。经过滤及离心处理将病毒上清液浓缩100倍。NIH3T3感染法测定病毒滴度，浓缩上清液的滴度为2.4×107 CFU/ml，病毒滴度提高77倍。
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2.2 病毒上清液RNA的鉴定和辅助病毒的检测
PAmdrl细胞的培养上清液RNA扩增出特异性mdrl 157 bp条带，而PA317和NIH3T3细胞未扩增出此特异条带。以转染阳性的NIH3T3细胞的培养液进一步感染亲代细胞NIH3T3，未出现抗性细胞。
2.3 裸鼠荷瘤模型的建立
注射T24细胞悬液后第3天，局部即见肿瘤形成，成瘤率为100%，1周后肿瘤直径为0.3～1.1cm不等。
2.4 肿瘤的化疗
高滴度组的肿瘤生长率为51.2%，低滴度组为34.5%，空白组为20.8%，高滴度组与空白组相差显著(P<0.01)。
2.5 免疫组化对肿瘤组织内P-GP的检测
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高滴度组染色明显较强，且阳性细胞分布面广，而低滴度组相对较弱，空白组更弱，见图1、2。各实验组肿瘤组织P-GP染色阳性细胞率，见表1。
图1 高滴度病毒注射组肿瘤组织P-GP免疫组化染色 (S-P×400)
Fig 1 Immunohischemical staining with McAb P-GP in human bladder cancer grew
in nude mice in high titer virus injection (S-P×400)
图2 对照组肿瘤组织P-GP免疫组化染色 (S-P×400)
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Fig 2 Immunohischemical staining with McAb P-GP in human bladder cancer
grew in nude mice in control group (S-P×400)
表1 各组肿瘤组织P-GP免疫组化染色阳性细胞率
Tab 1 Positive rate of immunohischemical staining with McAb P-GP in human bladder cancer grew in nude mice Group
Strong positive
Weak positive
Negative
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High titer virus group
0.60±0.02* #
0.32±0.03
0.08±0.02
Low titer virus group
0.30±0.01
0.50±0.02
0.20±0.01
Control
0.08±0.01
0.55±0.03
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0.37±0.03
*：P<0.05 vs low titer;#: P<0.01 vs control
2.6 RT-PCR对瘤组织内mdrl mRNA的检测
3组β-actin的扩增条带基本相同(587 bp)，而mdrl 157 bp的扩增条带出现明显差异，以高滴度组的扩增条带最明显，低滴度组条带次之，空白组最弱，见图3。
图3 RT-PCR检测肿瘤组织内mdr1 mRNA量(2%琼脂糖凝胶)
Fig 3 Confirmation of mdr1 mRNA by RT-PCR in human bladder cancer grew in nude mice (run on a 2% agarose gel and stained by ethidium bromide)
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1：pGEM-7zf(+)+HaeⅡ marker； 2: Control;3: Low titer virus group;4: High titer virus group
3 讨论
多药耐药性是肿瘤化疗失败的主要原因之一。目前很多的药物逆转剂，在细胞培养状态下能很好的逆转肿瘤对化疗药物的抵抗性，如维拉帕米、喹啉、环孢素A等。但是这些逆转剂的应用浓度非常高，人体毒性大，几乎没有临床应用的可能。其他如P-GP单克隆抗体[4]、mdrl核酶[3]多种逆转MDR的方法，也都需要经过动物实验的探讨与证明。
目前认为，多药耐药性主要是由于细胞内mdrl基因过表达，P-GP增加而产生的。本研究利用已经克隆出mdrl基因[2]，采用逆转录病毒注射法向动物肿瘤细胞模型内转移并表达此基因，进而建立耐药性动物肿瘤模型。我们首先制备裸鼠的荷瘤模型，而后将mdrl逆转录病毒上清液注射至荷瘤裸鼠的瘤内和瘤周。我们观察到在应用阿霉素、秋水仙素腹腔注射(2次/周，共3周)后该荷瘤模型肿瘤生长依然旺盛，而对照组肿瘤的生长较慢，证明注射病毒可使肿瘤对化疗药物的耐受性增加。免疫组化染色结果表明，高滴度逆转录病毒介导的强阳性细胞率可达到60%，低滴度组强阳性细胞率也可达到30%。RT-PCR结果也说明基因转移后，肿瘤组织的mdrl mRNA表达量明显增加。以上结果均表明，病毒注射法建立的MDR膀胱癌动物模型具有较高的耐药性表型，可用于研究MDR机制和逆转方法。
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实体瘤的体内基因转移作为肿瘤基因治疗的重要环节之一，已逐渐成为当前研究的热点[5]。尽管体内基因转移尚存在一定的局限性，如基因转移的效果尚不令人满意，转移方法可能对机体产生的不良影响等，但因其具有符合临床应用要求、异质性强和方法简便等优点，因此体内基因转移技术具有十分广阔的应用前景[6]。
本研究以DoTaP介导将携带mdrl基因的重组逆转录病毒载体pHaMDR1/A导入PA317包装细胞，获得的逆转录病毒原液滴度为3.1×105 CFU/ml。文献认为，PA317细胞包装产生的病毒颗粒滴度较低(一般仅为104～105 CFU/ml)，严重影响了转基因的效率[7]。本研究也表明，逆转录病毒原液的基因转移效率确实较低，限制了其在体内的应用。进而我们采用过滤及低温离心法浓缩逆转录病毒原液，使病毒滴度提高近80倍，实验证实该方法对病毒颗粒的感染能力无任何影响。由于NIH3T3细胞的培养上清液中未能扩增出mdrl的特异性的条带，且再感染实验无细胞克隆形成，表明mdrl逆转录病毒上清液仅具有一次性的感染能力，即无辅助病毒产生。以上结果表明，此逆转录病毒上清液不仅含有mdrl基因，而且能安全、有效地应用于实验研究。
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现有研究结果表明，目的基因在肿瘤内部转移并表达的多少直接影响着肿瘤基因治疗的效果。Smiley等[8]采用逆转录病毒上清液瘤内注射法，以实现裸鼠黑色素瘤HIV-TK基因转移，结果表明该方法可使36%的细胞表达外援基因，在应用GCV后可得到较好的抑瘤效果。本研究将mdrl基因病毒上清液注射到荷瘤裸鼠的瘤周及瘤内，能使60%的肿瘤细胞发生基因转移，从而肿瘤获得较强的多药耐药性，同时也表明浓缩的病毒上清液具有较好的体内基因转移效率。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670824)
作者简介：易善红(1970-)，男，河南省息县人，硕士，主治医师，讲师，主要从事膀胱癌多药耐药性方面的研究。
参考文献：
[1]Cusack J C,Spitz F R,Nguyen d,et al.High levels of gene transduction in human lung tumors following intralesional injection of recombinant adenorirus[J].Cancer Gene Ther,1996,3(4):245-249.
, 百拇医药
[2]Pastan I,Gottesman M M,Ueta K,et al.A retrovirus carrying an MDRl cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells[J].Proc Natl Acad USA,1988,85(12):4 486-4 490.
[3]何 斌，杨唐俊，金锡御，等.核酶对MDRl基因的体外切割活性[J].中华泌尿外科杂志，1998，19(4)：1-3.
[4]Pearson J W,Fogler W E,Volker K,et al.Reversal of drug resistance in a human colon cancer xenograft expressing MDRl complementary DNA by in vivo administration of MRK-16 monoclonal antibody[J].J Natl Cancer Inst,1991,83(19):1 386-1 391.
, http://www.100md.com
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收稿日期：2000-01-17
修回日期：2000-09-15, 百拇医药