5-脱氧杂氮胞苷诱导肝癌细胞株p16基因高表达
作者：刘丽华 肖文华 刘为纹
单位：刘丽华 肖文华(第三军医大学附属西南医院肿瘤科 重庆 400038)；刘为纹(第三军医大学附属西南医院消化内科 重庆 400038)
关键词：肝癌细胞株；p16基因；甲基化；5-脱氧杂氮胞苷
第三军医大学学报001105
提 要：目的 研究5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株p16基因表达的影响及其机制。方法 肝癌细胞株SMMC-7221、HePG2用5-脱氧杂氮胞苷处理，处理前后采用RT-PCR和免疫组织化学染色法观察和分析其mRNA和蛋白表达变化。结果 经5-脱氧杂氮胞苷处理的肝癌细胞株mRNA和蛋白表达均明显增强。结论 5-脱氧杂氮胞苷可使p16基因在转录水平和翻译水平表达增高，其机制可能是通过去甲基化使p16基因表达恢复。
, 百拇医药
中图法分类号：R394.2;R735.702 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1033-03
Over-expression of p16 gene induced by 5-Aza-cdR in hepatocellular carcinoma cell lines
LIU Li-hua,XIAO Wen-hua,LIU Wei-wen
(Department of Oncology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To study the effect and mechanism of 5-Aza-cdR on p16 expression in hepatocellular carcinoma cell lines.Methods The expressions of p16 mRNA and protein in hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721 and HePG2 before and after the treatment of 5-Aza-cdR were analyzed with reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical methods.Results The expressions of p16 mRNA and protein after 5-Aza-cdR treatment were increased distinctively.Conclusion 5-Aza-cdR can elevate the transcription and translation levels of p16 gene probably by its demethylation restoring p16 expression.
, 百拇医药
Key words：hepatocellular carcinoma cell line;p16 gene;methylation;5-Aza-2'-deoxycytidine
肝细胞癌是人类肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，尽管其发生的确切机制尚不明确，但与其相关的一系列基因改变正逐渐被人们所认识[1]，其中，细胞周期调控基因p16抑癌基因与肝癌的发生发展密切相关[2]。p16基因失活的一重要原因是其启动子区域异常甲基化[2，3]，目前在人类许多肿瘤中都存在p16基因高甲基化而致表达缺失或下降[3，4]。但是，到目前为止，就p16基因甲基化与肝细胞癌相关性的报道甚少，且存在分歧。本实验用甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-cdR)处理肝癌细胞株，对比分析处理前后其mRNA、蛋白的表达变化，以初步了解肝癌细胞株中p16基因甲基化情况。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721、HePG2来源于本院消化内科实验室，培养于含10%小牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，培养条件为37 ℃，饱和湿度，5%CO2。
1.2 5-脱氧杂氮胞苷处理
两细胞株按3×105个/瓶接种，24 h后，用5×10-7mol/L的5-脱氧杂氮胞苷(Sigma公司)处理，24 h后弃去药液，换新鲜培养液，继续培养9 d，然后用Tripure提取液(Bochringer Mannheim公司)提取RNA。未用药物处理的细胞做为对照。
1.3 RT-PCR
, 百拇医药
RT-PCR采用一步一管法(Acces RT-PCR system，Promega公司)。p16引物用于扩增位于外显子2基因片段，引物(上海生物工程公司合成，PAG纯化)为P1：5′-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3′，P2：5′-CTGCCCATCATCATGACCTGGA-3′；扩增片段长度为428 bp。反应体系为：总体积25 μl,dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各1mmol/L，MgSO4 1 mmol/L，AMV逆转录酶0.1 U/ml，Tf1DNA聚合酶0.1 U/ml，10×反应缓冲液2.5 μl，RNA模板100 ng，扩增条件为94 ℃，2 min→94 ℃，30 s;60 ℃，45 s，68 ℃，90 s；40 cycles→68 ℃，7 min。取3 μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。
1.4 免疫组织化学染色
药理处理前后的肝癌细胞SMMC-7721、HePG2按1×106个/孔接种于6孔培养板，接种前孔底置10 mm×10 mm盖玻片，24 h后细胞爬行，伸延，捞出玻片，4%多聚甲醛室温下固定30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min，3%过氧化氢甲醇液室温下10 min，以阻断内源性氧化物酶，正常羊血清1∶10稀释后封闭30 min，加p16小鼠抗人多克隆抗体(中山公司)(即用型)，37 ℃孵育1 h；1∶100生物素化羊抗小鼠IgG血清及1∶100 SABC试剂(中山公司)均孵育1 h，DAB显色10 min。设有阴性、阳性对照。光镜下观察p16表达的变化，同时进行图像分析。采用德国Leica MD20真彩色图像分析仪进行细胞染色强度的半定量分析。每张随机取5个视野，共分析124个细胞，求平均积分光密度(IOD)，以
±s表示。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
采用t检验。
2 结果
2.1 5-脱氧杂氮胞苷对p16 mRNA表达的影响
SMMC-7721和HePG2细胞经5-脱氧杂氮胞苷处理后p16 mRNA表达增多，见图1。
图1 5-脱氧杂氮胞苷处理前后SMMC-7721和HePG2细胞p16 mRNA表达变化
Fig 1 Alteration of p16 mRNA expression in SMMC-7721 and HePG2 cell line after treatment with 5-Azc-cdR
, http://www.100md.com
M：PCR Marker;U: Untreated;T: Treated;A: SMMC-7721;B: HePG2
2.2 5-脱氧杂氮胞苷对P16蛋白表达的影响
经药物处理的细胞，胞核显示明显的黄褐色染色，而未经药物处理的细胞则呈阴性或淡染，见图
2。
图像分析半定量结果为：
S
MMC-7721
和
H
ePG2两株肝癌细胞经5-Azc-cdR处理后，其IOD值分别为582.34±46.23和495.89±52.12，与未处理组(172.3±35.19，212.81±62.56)比较差异显著(P<0.05)。
, 百拇医药
图2 5-脱氧杂氮胞苷处理前、后HePG2 p16蛋白表达 (SABC×200)
Fig 2 Expression of p16 protein in HePG2 cell line after treated with 5-Azc-cdR (SABC×200)
A: Untreated； B: Treated
3 讨论
肝细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其发生过程与多种抑癌基因异常有关[1]。p16基因异常改变作为恶性肿瘤的一种发病机制受到愈来愈多的研究者重视，目前研究发现5′-CpG区甲基化所引起的p16基因失活是人类肿瘤中最频繁发生的基因改变。国内外对p16基因在肝癌中的表达及基因改变研究甚少。Sun等[6]发现原发性肝细胞癌和肝癌细胞系中普遍存在甲基转移酶明显增高，但未对其相关基因的甲基化状态进行分析。Wong等[7]研究发现原发性肝细胞癌中p16基因呈高甲基化。Hui等[8]在研究中发现6个肝癌细胞系中只有一个p16 mRNA未表达，在排除了突变与杂合缺后，推测与甲基化异常相关，而其余5个细胞系有不同程度的p16 mRNA表达。Heish等[9]研究进一步证实基因转录抑制与基因启动子区域CpG甲基化的密度相关，低密度的CpG岛甲基化只能使67%到90%的转录被抑制，只有CpG岛呈高度的甲基化修饰时，才表现为基因转录的完全抑制。然而，这种抑制作用是可逆的，已有大量实验研究证明甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷通过DNA去甲基化机制可以恢复多种抑癌基因的表达。
, 百拇医药
本实验中SMMC-7721、HePG2两肝癌细胞系中都存在p16 mRNA和蛋白微弱表达，但是经甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞处理后，p16 mRNA和蛋白表达水平均明显增强，说明5-Azc-cdR可明显诱导p16基因高表达。由于5-Azc-cdR的特殊作用机制-DNA去甲基化作用，本研究提示：SMMC-7721和HePG2肝癌细胞株可能存在p16基因CpG岛部分甲基化，经5-Azc-cdR处理后，p16基因进一步去甲基化，其转录和蛋白表达也明显增强。p16基因编码的P16蛋白属于细胞周期依赖性激酶的抑制蛋白，调节G1/S期细胞的转化，因此，我们认为p16的复活可能会引起这两株肝癌细胞的生长行为发生改变；5-Azc-cdR有可能在未来肝癌的治疗中发挥较大的作用。
作者简介：刘丽华(1968-)，女，甘肃省兰州市人，硕士研究生，主治医师，主要从事消化系肿瘤方面的研究。
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]肖文华，刘为纹，吕有勇，等.肝细胞癌多种抑制癌基因失活机制的研究[J].第三军医大学学报，1997，19(2)：324-327.
[2]Chaubert P,Gayer R,Zimmermann A,et al.Germ-line mutation of the p16INK4(MTSI) gene occur in a subset of patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1997,25(3):1 376-1 381.
[3]Liew C T,Li H M,Lo K W,et al.High frequency of p16INK4 gene alteration in hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,1999,18(2):789-795.
, 百拇医药
[4]Costello J F,Berger M S,Huang H T,et al.Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation[J].Cancer Res,1996,56(4):2405-2410.
[5]Herman J G.Merlo A,Mao L,et al.Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrent DNA methylation in all common human cancers[J].Cancer Res,1995,55(1):4 525-4 530.
[6]Sun L,Yae A M H,Sakamoto K M,et al.Increased DNA methyltransferase expression is associated with an early stage of human hepatocarcinogenesis[J].Jpn J Cancer Res,1997,88(3):1 165-1 170.
, http://www.100md.com
[7]Wong I H,Lo Y M,Zhang J,et al.Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients[J].Cancer Res,1999,59(1):71-73.
[8]Hui A M,Sakamoto M,Kanai Y,et al.Inactivation of p16 INK4 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1996,24(2):575-579.
[9]Heish C L.Dependence of transcriptional repression on CpG methy-lation density[J].Mol Cell Biol,1994,14(7):5 487-5 494.
[10]Bachman K E,Herman J G,Corn P G,et al.Methylation-associated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 gene suggests a suppressor role in kidney,brain,and other human cancers[J].Cancer Res,1999,59(2):798-802.
收稿日期：2000-02-10
修回日期：2000-07-18, 百拇医药
单位：刘丽华 肖文华(第三军医大学附属西南医院肿瘤科 重庆 400038)；刘为纹(第三军医大学附属西南医院消化内科 重庆 400038)
关键词：肝癌细胞株；p16基因；甲基化；5-脱氧杂氮胞苷
第三军医大学学报001105
提 要：目的 研究5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株p16基因表达的影响及其机制。方法 肝癌细胞株SMMC-7221、HePG2用5-脱氧杂氮胞苷处理，处理前后采用RT-PCR和免疫组织化学染色法观察和分析其mRNA和蛋白表达变化。结果 经5-脱氧杂氮胞苷处理的肝癌细胞株mRNA和蛋白表达均明显增强。结论 5-脱氧杂氮胞苷可使p16基因在转录水平和翻译水平表达增高，其机制可能是通过去甲基化使p16基因表达恢复。
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中图法分类号：R394.2;R735.702 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)11-1033-03
Over-expression of p16 gene induced by 5-Aza-cdR in hepatocellular carcinoma cell lines
LIU Li-hua,XIAO Wen-hua,LIU Wei-wen
(Department of Oncology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To study the effect and mechanism of 5-Aza-cdR on p16 expression in hepatocellular carcinoma cell lines.Methods The expressions of p16 mRNA and protein in hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721 and HePG2 before and after the treatment of 5-Aza-cdR were analyzed with reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical methods.Results The expressions of p16 mRNA and protein after 5-Aza-cdR treatment were increased distinctively.Conclusion 5-Aza-cdR can elevate the transcription and translation levels of p16 gene probably by its demethylation restoring p16 expression.
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Key words：hepatocellular carcinoma cell line;p16 gene;methylation;5-Aza-2'-deoxycytidine
肝细胞癌是人类肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，尽管其发生的确切机制尚不明确，但与其相关的一系列基因改变正逐渐被人们所认识[1]，其中，细胞周期调控基因p16抑癌基因与肝癌的发生发展密切相关[2]。p16基因失活的一重要原因是其启动子区域异常甲基化[2，3]，目前在人类许多肿瘤中都存在p16基因高甲基化而致表达缺失或下降[3，4]。但是，到目前为止，就p16基因甲基化与肝细胞癌相关性的报道甚少，且存在分歧。本实验用甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-cdR)处理肝癌细胞株，对比分析处理前后其mRNA、蛋白的表达变化，以初步了解肝癌细胞株中p16基因甲基化情况。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721、HePG2来源于本院消化内科实验室，培养于含10%小牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，培养条件为37 ℃，饱和湿度，5%CO2。
1.2 5-脱氧杂氮胞苷处理
两细胞株按3×105个/瓶接种，24 h后，用5×10-7mol/L的5-脱氧杂氮胞苷(Sigma公司)处理，24 h后弃去药液，换新鲜培养液，继续培养9 d，然后用Tripure提取液(Bochringer Mannheim公司)提取RNA。未用药物处理的细胞做为对照。
1.3 RT-PCR
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RT-PCR采用一步一管法(Acces RT-PCR system，Promega公司)。p16引物用于扩增位于外显子2基因片段，引物(上海生物工程公司合成，PAG纯化)为P1：5′-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3′，P2：5′-CTGCCCATCATCATGACCTGGA-3′；扩增片段长度为428 bp。反应体系为：总体积25 μl,dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各1mmol/L，MgSO4 1 mmol/L，AMV逆转录酶0.1 U/ml，Tf1DNA聚合酶0.1 U/ml，10×反应缓冲液2.5 μl，RNA模板100 ng，扩增条件为94 ℃，2 min→94 ℃，30 s;60 ℃，45 s，68 ℃，90 s；40 cycles→68 ℃，7 min。取3 μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。
1.4 免疫组织化学染色
药理处理前后的肝癌细胞SMMC-7721、HePG2按1×106个/孔接种于6孔培养板，接种前孔底置10 mm×10 mm盖玻片，24 h后细胞爬行，伸延，捞出玻片，4%多聚甲醛室温下固定30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min，3%过氧化氢甲醇液室温下10 min，以阻断内源性氧化物酶，正常羊血清1∶10稀释后封闭30 min，加p16小鼠抗人多克隆抗体(中山公司)(即用型)，37 ℃孵育1 h；1∶100生物素化羊抗小鼠IgG血清及1∶100 SABC试剂(中山公司)均孵育1 h，DAB显色10 min。设有阴性、阳性对照。光镜下观察p16表达的变化，同时进行图像分析。采用德国Leica MD20真彩色图像分析仪进行细胞染色强度的半定量分析。每张随机取5个视野，共分析124个细胞，求平均积分光密度(IOD)，以
±s表示。, 百拇医药
1.5 统计学处理
采用t检验。
2 结果
2.1 5-脱氧杂氮胞苷对p16 mRNA表达的影响
SMMC-7721和HePG2细胞经5-脱氧杂氮胞苷处理后p16 mRNA表达增多，见图1。
图1 5-脱氧杂氮胞苷处理前后SMMC-7721和HePG2细胞p16 mRNA表达变化
Fig 1 Alteration of p16 mRNA expression in SMMC-7721 and HePG2 cell line after treatment with 5-Azc-cdR
, http://www.100md.com
M：PCR Marker;U: Untreated;T: Treated;A: SMMC-7721;B: HePG2
2.2 5-脱氧杂氮胞苷对P16蛋白表达的影响
经药物处理的细胞，胞核显示明显的黄褐色染色，而未经药物处理的细胞则呈阴性或淡染，见图
2。
图像分析半定量结果为：
S
MMC-7721
和
H
ePG2两株肝癌细胞经5-Azc-cdR处理后，其IOD值分别为582.34±46.23和495.89±52.12，与未处理组(172.3±35.19，212.81±62.56)比较差异显著(P<0.05)。
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图2 5-脱氧杂氮胞苷处理前、后HePG2 p16蛋白表达 (SABC×200)
Fig 2 Expression of p16 protein in HePG2 cell line after treated with 5-Azc-cdR (SABC×200)
A: Untreated； B: Treated
3 讨论
肝细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其发生过程与多种抑癌基因异常有关[1]。p16基因异常改变作为恶性肿瘤的一种发病机制受到愈来愈多的研究者重视，目前研究发现5′-CpG区甲基化所引起的p16基因失活是人类肿瘤中最频繁发生的基因改变。国内外对p16基因在肝癌中的表达及基因改变研究甚少。Sun等[6]发现原发性肝细胞癌和肝癌细胞系中普遍存在甲基转移酶明显增高，但未对其相关基因的甲基化状态进行分析。Wong等[7]研究发现原发性肝细胞癌中p16基因呈高甲基化。Hui等[8]在研究中发现6个肝癌细胞系中只有一个p16 mRNA未表达，在排除了突变与杂合缺后，推测与甲基化异常相关，而其余5个细胞系有不同程度的p16 mRNA表达。Heish等[9]研究进一步证实基因转录抑制与基因启动子区域CpG甲基化的密度相关，低密度的CpG岛甲基化只能使67%到90%的转录被抑制，只有CpG岛呈高度的甲基化修饰时，才表现为基因转录的完全抑制。然而，这种抑制作用是可逆的，已有大量实验研究证明甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷通过DNA去甲基化机制可以恢复多种抑癌基因的表达。
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本实验中SMMC-7721、HePG2两肝癌细胞系中都存在p16 mRNA和蛋白微弱表达，但是经甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞处理后，p16 mRNA和蛋白表达水平均明显增强，说明5-Azc-cdR可明显诱导p16基因高表达。由于5-Azc-cdR的特殊作用机制-DNA去甲基化作用，本研究提示：SMMC-7721和HePG2肝癌细胞株可能存在p16基因CpG岛部分甲基化，经5-Azc-cdR处理后，p16基因进一步去甲基化，其转录和蛋白表达也明显增强。p16基因编码的P16蛋白属于细胞周期依赖性激酶的抑制蛋白，调节G1/S期细胞的转化，因此，我们认为p16的复活可能会引起这两株肝癌细胞的生长行为发生改变；5-Azc-cdR有可能在未来肝癌的治疗中发挥较大的作用。
作者简介：刘丽华(1968-)，女，甘肃省兰州市人，硕士研究生，主治医师，主要从事消化系肿瘤方面的研究。
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]肖文华，刘为纹，吕有勇，等.肝细胞癌多种抑制癌基因失活机制的研究[J].第三军医大学学报，1997，19(2)：324-327.
[2]Chaubert P,Gayer R,Zimmermann A,et al.Germ-line mutation of the p16INK4(MTSI) gene occur in a subset of patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1997,25(3):1 376-1 381.
[3]Liew C T,Li H M,Lo K W,et al.High frequency of p16INK4 gene alteration in hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,1999,18(2):789-795.
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[4]Costello J F,Berger M S,Huang H T,et al.Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation[J].Cancer Res,1996,56(4):2405-2410.
[5]Herman J G.Merlo A,Mao L,et al.Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrent DNA methylation in all common human cancers[J].Cancer Res,1995,55(1):4 525-4 530.
[6]Sun L,Yae A M H,Sakamoto K M,et al.Increased DNA methyltransferase expression is associated with an early stage of human hepatocarcinogenesis[J].Jpn J Cancer Res,1997,88(3):1 165-1 170.
, http://www.100md.com
[7]Wong I H,Lo Y M,Zhang J,et al.Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients[J].Cancer Res,1999,59(1):71-73.
[8]Hui A M,Sakamoto M,Kanai Y,et al.Inactivation of p16 INK4 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1996,24(2):575-579.
[9]Heish C L.Dependence of transcriptional repression on CpG methy-lation density[J].Mol Cell Biol,1994,14(7):5 487-5 494.
[10]Bachman K E,Herman J G,Corn P G,et al.Methylation-associated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 gene suggests a suppressor role in kidney,brain,and other human cancers[J].Cancer Res,1999,59(2):798-802.
收稿日期：2000-02-10
修回日期：2000-07-18, 百拇医药