幽门螺杆菌cagA蛋白及其疫苗候选抗原对T细胞Fas Ligand介导凋亡的调节作用
作者：王继德 陈烨 赖卓胜 周殿元 林焕健
单位：广州，第一军医大学南方医院全军消化病研究所510515
关键词：螺杆菌；幽门；免疫；细胞；脱噬作用
中华医学杂志001105
【摘要】 目的 评价幽门螺杆菌(Hp)多种功能蛋白致T细胞凋亡的能力，以探求它们在Fas/FasL介导的机体T细胞耐受中的作用，为Hp疫苗研制寻求安全有效的免疫原。方法 应用JAM技术对cagA阳性Hp及同源基因突变株、重组尿素酶、粘附素HpaA及外膜蛋白Hop25、35、38致T细胞系凋亡的能力进行了比较；应用流式细胞术对上述因素特别是cagA阳性菌株诱导T细胞FasL表达的能力进行了检测；应用金属蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂分别提高和降低Hp介导的T细胞凋亡，以证实其与FasL合成的关系。结果 Hp cagA阳性株无论在提高T细胞表达FasL还是在诱导T细胞凋亡方面的作用均强于同源基因突变株。Hp抗原制品中尿素酶对T细胞无杀伤能力，而Hop38毒性最强，Hop25、Hop35和HpaA等作用较弱。金属蛋白酶抑制剂提高了cagA阳性Hp致T细胞凋亡的能力，而蛋白合成抑制剂Emetine则通过抑制T细胞FasL表达而抑制了Hp介导的T细胞凋亡。结论 cagA蛋白及Hop38能通过调节FasL表达造成T细胞耐受；尿素酶、外膜蛋白Hop25、Hop35和HpaA不会通过抑制T细胞而导致耐受机制的发生，因而可安全应用于疫苗研制。
, http://www.100md.com
The evaluation of cagA and other vaccine candidate proteins of Helicobacter pylori on T cell apoptosis mediated by Fas/Fas ligand interaction
WANG Jide CHEN Ye LAI Zhuosheng
(PLA Institute for Digestive Disease, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To evaluate the effect of several surface proteins of Helicobacter pylori (H. pylori) on inducing apoptosis of T cells through the modulation of Fas/Fas ligand (FasL) interaction and to provide information on the screen of safe and effective immunogen for H. pylori vaccine. Methods T cell apoptosis induced by cagA+ and isogenic cagA knockout strain, recombinant urease, HpaA and outer membrane proteins, Hop25, Hop35 and Hop38 was detected by JAM assay. Flow cytometry was used to evaluate the increase in FasL expression on T cells under the stimulation of these bacterial proteins. Metalloprotease inhibitor, 1, 10-Phenanthroline (PHE) and protein synthesis inhibitor, emetine, were used to change the activity of FasL to confirm the association of FasL with H. pylori mediated killing toward T cells. Results The effect of cagA+ H.pylori was stronger in both the induction of apoptosis and FasL expression of T cells than that of cagA knockout strain. H. pylori urease could not kill T cell, while Hop38 had the strongest effect among the tested H. pylori proteins on the induction of T cell apoptosis through increasing FasL expression. Metaloprotease inhibitor could increase the killing of T cells induced by H. pylori because of its ability to prevent the cleavage of membrane-bound FasL protein. On the other hand, emetine could decrease H. pylori mediated killing by inhibiting of FasL synthesis on T cells. Conclusion cagA and Hop38 protein might be involved in the negative regulation of T cell growth through upregulating FasL expression urease and other Hop proteins tested might be safe and effective to be used as the antigens for H. pylori vaccine.
, 百拇医药
【Key words】 Helicobacter pylori； Immunity, cellular； Apoptosis
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染可以引起胃炎和消化性溃疡，并能促进胃癌的发生。常用的联合药物治疗方案存在病人依从性差、毒副作用大和细菌获得性耐药等不足，因此，开展疫苗的研制十分重要。
Hp感染可导致宿主发生T细胞耐受。人们已在胃粘膜分离了Hp特异T细胞克隆[1]，并在局部和外周血中检出了抗Hp抗体，并对免疫致病和免疫耐受机制进行了研究[2，3]。认为尿素酶是最重要的定植、致病因子之一，cagA致病岛基因(Pathogenicity Island, PAI)则编码一系列与细胞物质转送有关的多肽[3]。但Hp免疫致病和免疫耐受的机制尚不明了，无法保证疫苗的效果和安全性。由于Hp能刺激T细胞产生Fas Ligand (FasL)并通过Fas/FasL相互作用而自杀或互相杀伤，这也许是Hp致宿主T细胞无反应性进而B细胞耐受的可能机制。在本研究中，我们应用体外T细胞系模型评价了Hp多种疫苗候选抗原对Fas/FasL介导T细胞凋亡的调节作用，以预测它们用于免疫保护时的可行性。
, 百拇医药
材料与方法
一、Hp菌株和T细胞系
Hp国际标准株ATCC26695及其cagA致病岛同源突变株D-1由美国德克萨斯大学Ernst教授惠赠，常规37℃，微需氧条件下培养，固体为Skirrow选择性培养基，液体为布氏肉汤。CD4阳性T细胞系Cem-C7 (Th2表型)及Jurkat购自美国菌种收集保存与分型中心，常规RPMI1640液培养。
二、细胞凋亡试验
按文献报道[4]应用JAM技术测定T细胞凋亡。3H标记的T细胞与Hp或其培养上清共同孵育24 h(细菌/细胞比例为1 000∶1，上清1∶4稀释)后，裂解并收集细胞DNA进行液闪测定，根据丢失DNA的比例，计算Hp的杀伤率。在测定Hp抗原的杀伤作用时，Hp抗原应用浓度均为10 μg/ml。
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三、Hp抗原
Hp外膜蛋白Hop25、Hop35和Hop38系由国外合作伙伴提供，重组尿素酶及粘附素HpaA系自行从含有Hp尿素酶基因质粒pHP902和含HpaA基因质粒pHP901的工程菌中纯化。
四、流式细胞仪检测FasL表达
T细胞与Hp(1∶300)或其抗原(10 μg/ml)孵育24 h，收集并漂洗细胞，应用兔抗人FasL抗体C-20(Santa Cruz公司)及二抗FITC标记羊抗兔IgG染色，对照抗体应用正常兔IgG，流式细胞仪分析，比较Hp处理组与非处理组，评价FasL升高情况。
五、金属蛋白酶抑制剂对Hp杀伤T细胞的作用
由于细胞表面的FasL易于被体液(包括培养液中的血清成分)中的金属蛋白酶抑制剂降解，成为可溶性FasL，而可溶性分子与Fas作用致细胞凋亡的能力弱于膜结合FasL。我们应用金属蛋白酶抑制剂1,10-phenanthroline(PHE，美国Sigma公司)提高Fas介导的T细胞凋亡能力[5]。在前述JAM技术中，标记T细胞与Hp孵育时培养液加入2.5 mmol/L的PHE，评价杀伤率的改变。
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六、蛋白合成抑制剂对Hp杀伤T细胞及FasL表达的抑制作用
为探讨Hp杀伤T细胞是否需要新合成的FasL蛋白，我们应用蛋白合成抑制剂emetine( 美国Sigma公司)抑制T细胞FasL合成及Hp介导的致凋亡作用[6]。10 mmol/L emetine与T细胞孵育45 min后检测Hp对其FasL表达的影响及诱导凋亡的能力。
七、统计学处理
各种凋亡(杀伤)率均以Sigma plot 3.0作图，以
±s表示，并进行student's t检验。P<0.05为差异有显著意义。
结果
一、cagA与Hp致T细胞凋亡的关系
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cagA阳性Hp，无论是活菌还是培养上清均可以杀伤T细胞Cem-C7，杀伤率在43%～53%之间，而Cag同源突变株D-1的杀伤率小于10%(P<0.05)。对Jurkat的杀伤有同样差别，但杀伤率低于30%(表1)。
表1 cagA阳性及阴性菌株致T细胞凋亡率比较(%，±s) T细胞
ATCC 26695
活菌
D-1活菌
ATCC 26695
上清
D-1上清
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Cem-C7
43±4
9±4
53±5
4±2
Jurkat
26±2
6±2
28±4
6±3
与D-1相比，P<0.05
二、Hp抗原组分致T细胞凋亡的能力比较
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以cagA阳性Hp活菌作为对照，我们比较了几种Hp表面蛋白致T细胞Cem-C7凋亡的作用。结果发现cagA阳性株ATCC26695活菌、粘附素HpaA、外膜蛋白Hop25、Hop35及Hop38的杀伤率分别为49.0±0.4、18±2、9±4、22±5及75±3，而尿素酶无作用。其中Hop38的毒性最强，ATCC26695活菌、 Hop25、HpaA的作用较弱。应用Jurkat细胞有同样发现。
三、Hp各蛋白组分对T细胞FasL表达的调节作用
流式细胞术发现 Hop38及cagA蛋白可以刺激T细胞表达FasL。图1示cagA阳性Hp株ATCC26695提高了T细胞分泌FasL，而cagA基因突变株D-1则无此作用。此结果与JAM结果一致。
四、金属蛋白酶抑制剂的作用
应用JAM技术，我们发现在金属蛋白酶抑制剂PHE存在的情况下，无论是ATCC26695株菌还是其培养上清对Cem-C7和Jurkat的杀伤作用均有提高(P<0.05)，说明金属蛋白酶抑制剂保护了膜结合FasL的杀伤能力，结果见图2。
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图1 cagA阳性Hp株对T细胞FasL表达的影响
图2 金属蛋白酶抑制剂对Hp诱导的T细胞凋亡的影响
五、蛋白合成抑制剂抑制Hp介导的FasL表达及T细胞凋亡
10 mmol/L emetine能不可逆地抑制细胞合成新蛋白，如图3所示，它可以下调Hp26695介导的T细胞FasL表达,同时抑制Hp对Cem-C7的杀伤作用(图4)。说明Hp致T细胞凋亡需要新合成的Fas L蛋白，而不能直接作用于T细胞表面的Fas受体。
图3 蛋白合成抑制剂抑制Hp诱导的
, http://www.100md.com T细胞FasL表达
图4 蛋白合成抑制剂抑制Hp对
cem-c7的杀伤作用
讨论
在机体对外来病原的免疫反应中，T细胞能直接参与细胞免疫并控制B细胞产生抗体，对外来抗原的免疫耐受也多由T细胞介导。已有研究发现，Hp感染时胃T细胞增殖不活跃，且Hp体外可抑制T细胞增殖(少数Hp抗原例外，如尿素酶可刺激T细胞增殖)[7]，人们怀疑Hp能抑制人T细胞生长及其功能，从而使感染持续终生。
了解Hp功能和表面抗原对T细胞生长的影响能够预测其作为免疫原时的效果和安全性。尿素酶不损害T细胞生长反而促进其增殖，从而可用作安全、高效的免疫原。cagA和 Hop38损害T细胞生长，因而在实际应用中可能因不能刺激T细胞产生足够有效的辅助细胞因子而不能获得保护免疫所需的足量抗体。HpaA和 Hop 25仅有微弱的抑制T细胞生长的作用，因而可以在疫苗中试用。
, 百拇医药
虽然有报道应用cagA蛋白免疫小鼠可以保护动物不受cagA阳性Hp菌株的感染[8]，但本研究和如下一些发现并不支持cagA用于免疫的有效前景。cagA阳性菌株更常见于炎症和/或疾病较重的患者，这些患者胃型上皮中AP-1及NFkB等转录因子活性升高[9]，其激活可导致多种炎症因子如干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-8等的表达，从而加剧胃粘膜损害[10]；最近更发现T细胞Fas L基因的启动子区域至少有2个NFkB的结合位点，3个AP-1结合位点[11]，因而cagA可能通过激活转录因子而启动T细胞FasL表达，不仅参与损害Fas阳性的胃型上皮，更能促进T细胞之间互相残杀，加剧机体对Hp抗原的无反应性和免疫耐受。本研究发现cagA阳性与阴性菌株在激活FasL和杀伤T细胞方面的巨大差异为完善这一假设提供了新的证据。
至于Fas/ FasL在Hp抗原所致的T细胞耐受中的作用，鉴于T辅助细胞存在两种功能表型，Th1产生的IFN-γ、TNF-α等广泛存在于Hp自然感染的胃粘膜，而免疫保护有效的动物其胃粘膜以Th2细胞为主，且据报道这类表型细胞对Fas/ FasL介导细胞凋亡的敏感性不同，下一步的研究应更深入地评价这些疫苗候选抗原对不同T细胞表型的作用，以期最终克服T细胞耐受，获得安全有效的Hp保护抗原。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700007)
参考文献
1，D'Elios MM, Manghetti M, Almerigogna F, et al. Different cytokine profile and antigen-specificity repertoire in Helicobacter pylori-specific T cell clones from the antrum of chronic gastritis patients with or without peptic ulcer. Eur J Immunol, 1997,27:1751-1755.
2，Doig P, Trust TJ. Identification of surface-exposed outer membrane antigens of Helicobacter pylori. Infect Immun, 1994,62:4526-4533.
, 百拇医药
3，Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Mol Microbiol, 1998,28:37-53.
4，Matzinger P. The JAM test. A simple assay for DNA fragmentation and cell death. J Immunol Methods, 1991,145:185.
5，Mitsiades N, Poulaki V, Kotoula V, et al. Fas ligand is present in tumors of the Ewing's sarcoma family and is cleaved into a soluble form by a metalloproteinase. Am J Pathol, 1998,153:1947-1956.
, 百拇医药
6，Li JH, Rosen D, Ronen D, et al. The regulation of CD95 ligand expression and function in CTL. J Immunol, 1998,161:3943-3949.
7，Haeberle HA, Kubin M, Bamford KB, et al. Differential stimulation of interleukin-12 (IL-12) and IL-10 by live and killed Helicobacter pylori in vitro and association of IL-12 production with gamma interferon-producing T cells in the human gastric mucosa. Infect Immun, 1997,65:4229-4235.
8，Marchetti M, Rossi M, Giannelli V, et al. Protection against Helicobacter pylori infection in mice by intragastric vaccination with H. pylori antigens is achieved using a non-toxic mutant of E. coli heat-labile enterotoxin (LT) as adjuvant. Vaccine, 1998,16:33-37.
, 百拇医药
9，Glocker E, Lange C, Covacci A, et al. Proteins encoded by the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori are required for NF-kappa B activation. Infect Immun, 1998,66: 2346-2348.
10，Yasumoto K, Okamoto S, Mukaida N, et al. Tumor necrosis factor and interferon synergistically induce interleukin 8 production in a human gastric cancer cell line through acting concurrently on AP-1 and NF-kappaB-like binding sites of the interleukin 8 gene. J Biol Chem, 1992,267: 22506-22511.
11，Matsui K, Fine A, Ahu B, et al. Identificaiton of two NF-kappa B sites in mouse CD95 ligand (Fas ligand) promoter: Functional analysis in T cell hybridomas. J Immunol, 1998,161: 3469-3473.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药
单位：广州，第一军医大学南方医院全军消化病研究所510515
关键词：螺杆菌；幽门；免疫；细胞；脱噬作用
中华医学杂志001105
【摘要】 目的 评价幽门螺杆菌(Hp)多种功能蛋白致T细胞凋亡的能力，以探求它们在Fas/FasL介导的机体T细胞耐受中的作用，为Hp疫苗研制寻求安全有效的免疫原。方法 应用JAM技术对cagA阳性Hp及同源基因突变株、重组尿素酶、粘附素HpaA及外膜蛋白Hop25、35、38致T细胞系凋亡的能力进行了比较；应用流式细胞术对上述因素特别是cagA阳性菌株诱导T细胞FasL表达的能力进行了检测；应用金属蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂分别提高和降低Hp介导的T细胞凋亡，以证实其与FasL合成的关系。结果 Hp cagA阳性株无论在提高T细胞表达FasL还是在诱导T细胞凋亡方面的作用均强于同源基因突变株。Hp抗原制品中尿素酶对T细胞无杀伤能力，而Hop38毒性最强，Hop25、Hop35和HpaA等作用较弱。金属蛋白酶抑制剂提高了cagA阳性Hp致T细胞凋亡的能力，而蛋白合成抑制剂Emetine则通过抑制T细胞FasL表达而抑制了Hp介导的T细胞凋亡。结论 cagA蛋白及Hop38能通过调节FasL表达造成T细胞耐受；尿素酶、外膜蛋白Hop25、Hop35和HpaA不会通过抑制T细胞而导致耐受机制的发生，因而可安全应用于疫苗研制。
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The evaluation of cagA and other vaccine candidate proteins of Helicobacter pylori on T cell apoptosis mediated by Fas/Fas ligand interaction
WANG Jide CHEN Ye LAI Zhuosheng
(PLA Institute for Digestive Disease, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To evaluate the effect of several surface proteins of Helicobacter pylori (H. pylori) on inducing apoptosis of T cells through the modulation of Fas/Fas ligand (FasL) interaction and to provide information on the screen of safe and effective immunogen for H. pylori vaccine. Methods T cell apoptosis induced by cagA+ and isogenic cagA knockout strain, recombinant urease, HpaA and outer membrane proteins, Hop25, Hop35 and Hop38 was detected by JAM assay. Flow cytometry was used to evaluate the increase in FasL expression on T cells under the stimulation of these bacterial proteins. Metalloprotease inhibitor, 1, 10-Phenanthroline (PHE) and protein synthesis inhibitor, emetine, were used to change the activity of FasL to confirm the association of FasL with H. pylori mediated killing toward T cells. Results The effect of cagA+ H.pylori was stronger in both the induction of apoptosis and FasL expression of T cells than that of cagA knockout strain. H. pylori urease could not kill T cell, while Hop38 had the strongest effect among the tested H. pylori proteins on the induction of T cell apoptosis through increasing FasL expression. Metaloprotease inhibitor could increase the killing of T cells induced by H. pylori because of its ability to prevent the cleavage of membrane-bound FasL protein. On the other hand, emetine could decrease H. pylori mediated killing by inhibiting of FasL synthesis on T cells. Conclusion cagA and Hop38 protein might be involved in the negative regulation of T cell growth through upregulating FasL expression urease and other Hop proteins tested might be safe and effective to be used as the antigens for H. pylori vaccine.
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【Key words】 Helicobacter pylori； Immunity, cellular； Apoptosis
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染可以引起胃炎和消化性溃疡，并能促进胃癌的发生。常用的联合药物治疗方案存在病人依从性差、毒副作用大和细菌获得性耐药等不足，因此，开展疫苗的研制十分重要。
Hp感染可导致宿主发生T细胞耐受。人们已在胃粘膜分离了Hp特异T细胞克隆[1]，并在局部和外周血中检出了抗Hp抗体，并对免疫致病和免疫耐受机制进行了研究[2，3]。认为尿素酶是最重要的定植、致病因子之一，cagA致病岛基因(Pathogenicity Island, PAI)则编码一系列与细胞物质转送有关的多肽[3]。但Hp免疫致病和免疫耐受的机制尚不明了，无法保证疫苗的效果和安全性。由于Hp能刺激T细胞产生Fas Ligand (FasL)并通过Fas/FasL相互作用而自杀或互相杀伤，这也许是Hp致宿主T细胞无反应性进而B细胞耐受的可能机制。在本研究中，我们应用体外T细胞系模型评价了Hp多种疫苗候选抗原对Fas/FasL介导T细胞凋亡的调节作用，以预测它们用于免疫保护时的可行性。
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材料与方法
一、Hp菌株和T细胞系
Hp国际标准株ATCC26695及其cagA致病岛同源突变株D-1由美国德克萨斯大学Ernst教授惠赠，常规37℃，微需氧条件下培养，固体为Skirrow选择性培养基，液体为布氏肉汤。CD4阳性T细胞系Cem-C7 (Th2表型)及Jurkat购自美国菌种收集保存与分型中心，常规RPMI1640液培养。
二、细胞凋亡试验
按文献报道[4]应用JAM技术测定T细胞凋亡。3H标记的T细胞与Hp或其培养上清共同孵育24 h(细菌/细胞比例为1 000∶1，上清1∶4稀释)后，裂解并收集细胞DNA进行液闪测定，根据丢失DNA的比例，计算Hp的杀伤率。在测定Hp抗原的杀伤作用时，Hp抗原应用浓度均为10 μg/ml。
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三、Hp抗原
Hp外膜蛋白Hop25、Hop35和Hop38系由国外合作伙伴提供，重组尿素酶及粘附素HpaA系自行从含有Hp尿素酶基因质粒pHP902和含HpaA基因质粒pHP901的工程菌中纯化。
四、流式细胞仪检测FasL表达
T细胞与Hp(1∶300)或其抗原(10 μg/ml)孵育24 h，收集并漂洗细胞，应用兔抗人FasL抗体C-20(Santa Cruz公司)及二抗FITC标记羊抗兔IgG染色，对照抗体应用正常兔IgG，流式细胞仪分析，比较Hp处理组与非处理组，评价FasL升高情况。
五、金属蛋白酶抑制剂对Hp杀伤T细胞的作用
由于细胞表面的FasL易于被体液(包括培养液中的血清成分)中的金属蛋白酶抑制剂降解，成为可溶性FasL，而可溶性分子与Fas作用致细胞凋亡的能力弱于膜结合FasL。我们应用金属蛋白酶抑制剂1,10-phenanthroline(PHE，美国Sigma公司)提高Fas介导的T细胞凋亡能力[5]。在前述JAM技术中，标记T细胞与Hp孵育时培养液加入2.5 mmol/L的PHE，评价杀伤率的改变。
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六、蛋白合成抑制剂对Hp杀伤T细胞及FasL表达的抑制作用
为探讨Hp杀伤T细胞是否需要新合成的FasL蛋白，我们应用蛋白合成抑制剂emetine( 美国Sigma公司)抑制T细胞FasL合成及Hp介导的致凋亡作用[6]。10 mmol/L emetine与T细胞孵育45 min后检测Hp对其FasL表达的影响及诱导凋亡的能力。
七、统计学处理
各种凋亡(杀伤)率均以Sigma plot 3.0作图，以
±s表示，并进行student's t检验。P<0.05为差异有显著意义。结果
一、cagA与Hp致T细胞凋亡的关系
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cagA阳性Hp，无论是活菌还是培养上清均可以杀伤T细胞Cem-C7，杀伤率在43%～53%之间，而Cag同源突变株D-1的杀伤率小于10%(P<0.05)。对Jurkat的杀伤有同样差别，但杀伤率低于30%(表1)。
表1 cagA阳性及阴性菌株致T细胞凋亡率比较(%，
±s) T细胞ATCC 26695
活菌
D-1活菌
ATCC 26695
上清
D-1上清
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Cem-C7
43±4
9±4
53±5
4±2
Jurkat
26±2
6±2
28±4
6±3
与D-1相比，P<0.05
二、Hp抗原组分致T细胞凋亡的能力比较
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以cagA阳性Hp活菌作为对照，我们比较了几种Hp表面蛋白致T细胞Cem-C7凋亡的作用。结果发现cagA阳性株ATCC26695活菌、粘附素HpaA、外膜蛋白Hop25、Hop35及Hop38的杀伤率分别为49.0±0.4、18±2、9±4、22±5及75±3，而尿素酶无作用。其中Hop38的毒性最强，ATCC26695活菌、 Hop25、HpaA的作用较弱。应用Jurkat细胞有同样发现。
三、Hp各蛋白组分对T细胞FasL表达的调节作用
流式细胞术发现 Hop38及cagA蛋白可以刺激T细胞表达FasL。图1示cagA阳性Hp株ATCC26695提高了T细胞分泌FasL，而cagA基因突变株D-1则无此作用。此结果与JAM结果一致。
四、金属蛋白酶抑制剂的作用
应用JAM技术，我们发现在金属蛋白酶抑制剂PHE存在的情况下，无论是ATCC26695株菌还是其培养上清对Cem-C7和Jurkat的杀伤作用均有提高(P<0.05)，说明金属蛋白酶抑制剂保护了膜结合FasL的杀伤能力，结果见图2。
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图1 cagA阳性Hp株对T细胞FasL表达的影响
图2 金属蛋白酶抑制剂对Hp诱导的T细胞凋亡的影响
五、蛋白合成抑制剂抑制Hp介导的FasL表达及T细胞凋亡
10 mmol/L emetine能不可逆地抑制细胞合成新蛋白，如图3所示，它可以下调Hp26695介导的T细胞FasL表达,同时抑制Hp对Cem-C7的杀伤作用(图4)。说明Hp致T细胞凋亡需要新合成的Fas L蛋白，而不能直接作用于T细胞表面的Fas受体。
图3 蛋白合成抑制剂抑制Hp诱导的
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图4 蛋白合成抑制剂抑制Hp对
cem-c7的杀伤作用
讨论
在机体对外来病原的免疫反应中，T细胞能直接参与细胞免疫并控制B细胞产生抗体，对外来抗原的免疫耐受也多由T细胞介导。已有研究发现，Hp感染时胃T细胞增殖不活跃，且Hp体外可抑制T细胞增殖(少数Hp抗原例外，如尿素酶可刺激T细胞增殖)[7]，人们怀疑Hp能抑制人T细胞生长及其功能，从而使感染持续终生。
了解Hp功能和表面抗原对T细胞生长的影响能够预测其作为免疫原时的效果和安全性。尿素酶不损害T细胞生长反而促进其增殖，从而可用作安全、高效的免疫原。cagA和 Hop38损害T细胞生长，因而在实际应用中可能因不能刺激T细胞产生足够有效的辅助细胞因子而不能获得保护免疫所需的足量抗体。HpaA和 Hop 25仅有微弱的抑制T细胞生长的作用，因而可以在疫苗中试用。
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虽然有报道应用cagA蛋白免疫小鼠可以保护动物不受cagA阳性Hp菌株的感染[8]，但本研究和如下一些发现并不支持cagA用于免疫的有效前景。cagA阳性菌株更常见于炎症和/或疾病较重的患者，这些患者胃型上皮中AP-1及NFkB等转录因子活性升高[9]，其激活可导致多种炎症因子如干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-8等的表达，从而加剧胃粘膜损害[10]；最近更发现T细胞Fas L基因的启动子区域至少有2个NFkB的结合位点，3个AP-1结合位点[11]，因而cagA可能通过激活转录因子而启动T细胞FasL表达，不仅参与损害Fas阳性的胃型上皮，更能促进T细胞之间互相残杀，加剧机体对Hp抗原的无反应性和免疫耐受。本研究发现cagA阳性与阴性菌株在激活FasL和杀伤T细胞方面的巨大差异为完善这一假设提供了新的证据。
至于Fas/ FasL在Hp抗原所致的T细胞耐受中的作用，鉴于T辅助细胞存在两种功能表型，Th1产生的IFN-γ、TNF-α等广泛存在于Hp自然感染的胃粘膜，而免疫保护有效的动物其胃粘膜以Th2细胞为主，且据报道这类表型细胞对Fas/ FasL介导细胞凋亡的敏感性不同，下一步的研究应更深入地评价这些疫苗候选抗原对不同T细胞表型的作用，以期最终克服T细胞耐受，获得安全有效的Hp保护抗原。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700007)
参考文献
1，D'Elios MM, Manghetti M, Almerigogna F, et al. Different cytokine profile and antigen-specificity repertoire in Helicobacter pylori-specific T cell clones from the antrum of chronic gastritis patients with or without peptic ulcer. Eur J Immunol, 1997,27:1751-1755.
2，Doig P, Trust TJ. Identification of surface-exposed outer membrane antigens of Helicobacter pylori. Infect Immun, 1994,62:4526-4533.
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3，Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Mol Microbiol, 1998,28:37-53.
4，Matzinger P. The JAM test. A simple assay for DNA fragmentation and cell death. J Immunol Methods, 1991,145:185.
5，Mitsiades N, Poulaki V, Kotoula V, et al. Fas ligand is present in tumors of the Ewing's sarcoma family and is cleaved into a soluble form by a metalloproteinase. Am J Pathol, 1998,153:1947-1956.
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7，Haeberle HA, Kubin M, Bamford KB, et al. Differential stimulation of interleukin-12 (IL-12) and IL-10 by live and killed Helicobacter pylori in vitro and association of IL-12 production with gamma interferon-producing T cells in the human gastric mucosa. Infect Immun, 1997,65:4229-4235.
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(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药