上海地区24株幽门螺杆菌的vacA基因及cag致病岛状态的研究
作者：纪徐淮 许国铭 John Telford 屠振兴 丁华 杜奕奇 李兆申 Rino Rappukli
单位：纪徐淮 许国铭 屠振兴 丁华 杜奕奇 李兆申(第二军医大学长海医院消化内科 上海200433)；John Telford Rino Rappukli(IRIS Research Center, Chiron Vaccines, Siena 53100, Italy)
关键词：
中华医学杂志001117 世界上约有50%的人感染幽门螺杆菌(Hp)，但仅有10%的感染者有临床症状，这可能与细菌毒力差异、宿主差异及环境因素等有关。最新研究发现，长约39 kb的cag致病岛(cag PAI)，含有与Ⅳ型分泌系统相关的所有毒力基因，可以强有力地诱导IL-8的分泌与表达[1]。另外，Hp致空泡变性毒素(VacA)在Hp致病过程中起关键作用[2]。我国是Hp感染的高发区，30岁以上的成人感染率高达70%[3]。但有关中国人群Hp基因特征所知较少。因此，对我国人群Hp vacA、cag PAI进行系统研究有助于进一步认识菌型的地理学变异，理解其在致病过程中的作用。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.Hp分离：从20例Hp感染患者胃粘膜活检中常规分离培养单克隆Hp 80株，经尿素酶试验、组织化学检查等确认。
2.VacA与Cag的蛋白质印渍分析：应用菌株水溶性浸出物，以兔抗人Hp重组的VacA或CagA抗血清作为一抗。按常规蛋白质印渍方法分析菌株VacA或CagA的表达[4]。
3.空泡毒性试验：将菌株水溶性浸出液加于每孔含105 HeLa或RK13细胞的96孔培养板上，孵育20 h，用中性红摄取试验作定量分析[2]。
4.vacA基因序列测定和分析：常规提取Hp DNA[3]。参考CCUG17874 vacA基因序列，设计特异性引物(表1)扩增vacA片段，用373A型DNA全自动测序分析仪(美国Applied Biosystems公司)测序[2]。应用Wiscosin unix软件包(10.0 Version)及Boxshader程序对序列进行比较分析。
, 百拇医药
5.cagPAI结构与Southern杂交：参照NCTC11637及CCUG17874的cag PAI序列，针对cag PAI不同片段设计5对引物(表1)进行PCR扩增[1]。采用Boehringer地高辛标记试剂盒标记这5对探针，与菌株DNA做Southern点杂交，经光敏显色。
二、结果
1.Hp菌株的CagA、VacA蛋白表达：20例80株单克隆Hp菌株，CagA及VacA的阳性率分别为97.5%(78/80)及95%(76/80)。除1例为CagA阳性与CagA阴性株、3例为VacA阳性与VacA阴性株混合感染、1例为CagA阳性VacA阴性株感染外，其余均为CagA阳性并VacA阳性菌株，剔除同一病例相同菌株，选择24株做进一步研究。
表1 用于vacA测序和cag PAI杂交的引物 扩增部位
, http://www.100md.com
引物名称
核苷酸序列
vacA
p37
DHWL
ACATTGGTTGTAGATACTATATAT
RIGT
GCCACAAATCCAGTGTTCCAATAT
DTPD
AACTCCGGATAAACCCGATAAAGT
RLYK
, 百拇医药 TGTATAAGTCGTATTCCTTGT
p58
DVWM
GTGTGGATGGGCCGTTTGCAATAC
RKYL
AAGATACTTGTAATTGTCAGGGTT
DPTQ
ACCCACGCAAGTCATTGATGGGCC
DTFN
ACTTTTAATAACGATATCCATCTA
RNAQ
, 百拇医药
TTGAGCGCTATTGATCTTAATGAG
DMI
AAACAGCAACGCAAGCATGGATT
RMI
CGAGTAATGTCGAAGGTGAT
DNDI
AACGATATCCGTTTAGGAAAAGCG
DAFN
GCTTTTAATAACAATATCAGTCTG
p33
DALY
, http://www.100md.com
GCCCTTTATAACAACAATAACCTC
REX2
GGGTTAAATGTTTTGTAAGATTT
DATP
GCTACTCCTAATTTAGTCGCTATC
DNAM
AATGCGATGATTTTAAATTCTCGT
RYYY
ATAATAATAACGCGCTTCCACATT
cag PAI
, http://www.100md.com cagA
D008
ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCG
R008
TTAGAATAATCAACAAACATCCACGCCA
5′-cagI
ARTF2
TATTGGCCTCGTTGATCAAACAAAGCTCTGC
HR2
GGGGTGATTTTAGTTTATCCATAA
IS605
, http://www.100md.com
E64U
GGTGGCTATCTCATCTATAACAGA
HI2H
TCATCGCTCCATAACTAGC
3′-cagⅡ
B2LI
AAGTGCATGCAGTAATTATGCGAA
E64Q
TCTAAAGAGAAACCAAATCCATTG
5′-cagⅡ
ORF8F
, 百拇医药
TCCACATGTTTCTAGTAGCAGGAC
ORF9Q
TACCTAGCAAAACAACCTATCCTC
2.体外细胞毒性试验：24株临床菌株中只有5株可诱导HeLa细胞产生大量空泡变性。然而，表达VacA蛋白的20个菌株均可诱导RK-13细胞产生明显空泡变性。
3.本组vacA基因序列特征及与西方菌株的主要变异：24株临床分离株中5株行vacA基因全长测序，其余针对信号肽及中间区序列进行部分测序。结果表明，所有菌株信号序列均为s1a型，但有3个氨基酸差异；5株为m1型，19株为m2型。基因发生学分析显示，中西方菌株vacA基因m1型之间相对距离相差显著，而m2型间相差不显著(表2)。表2 vacA基因中区序列的地理差异(
±s) 部位
, http://www.100md.com
组间差异
100 bp中核苷酸替换数
西方菌株
上海菌株
西方菌株∶上海菌株
p58共同区
7.2±2.8
6.1±2.6
10.3±1.7
5′ml
4.4±2.2
4.9±2.2
, 百拇医药
13.8±3.3
3′ml
2.6±0.9
2.9±1.0
13.2±0.9
5′m2a
6.1±1.5
4.3±2.0
5.7±2.6
3′m2
2.6±0.8
3.3±1.0
, 百拇医药
2.9±1.1
4.cag PAI的结构特征：所有24株菌株均存在cag PAI，点杂交阳性率100%。应用PCR法分析，cagA及5′-cagⅡ阳性率高达100%，5′-cagⅠ及3′-cagⅡ阳性率分别为85.2%及96.3%，而IS605插入的阳性率仅29.6%。
三、讨论
本研究显示，上海地区临床Hp分离株均表达VacA及CagA蛋白，属于Ⅰ型菌株。但仅20%的菌株可在体外诱导HeLa细胞产生明显空泡变性，而表达VacA的菌株均可诱导PK13细胞产生空泡变性，与国外最近文献报道一致[2]。vacA基因表型研究发现这些菌株多为m2型，与我国广州的结果类似[5]。这意味着中国东部及南部Hp感染的主要菌型为m2型，而欧美及日本以m1型占优势。不同人群流行不同m型Hp的机制可能与环境因素和宿主人群因素有关，也可能与Hp的长期演变进化有关[6]。cag PAI研究发现，所有临床分离株均获得cagPAI，但仅20.8%菌株的cag PAI中有IS605插入。cag PAI阳性率高于欧洲菌株，而IS605插入率低于欧洲菌株，可能与不同人群感染Hp时发生菌型适应性突变有关。尽管同一病例不同单克隆分离的Hp菌株vacA及cag PAI存在微小的差异，但真正不同菌型的混合感染并不多见。可见Hp感染过程中，宿主可能对感染的Hp菌株进行选择，而使某种菌型感染占优势。本结果表明，上海地区Hp vacA基因表型和cag PAI的结构特征与西方主要菌株相比存在明显差异，形成相对独立的亚族。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金(396706481)及欧共体委员会INCO-DC基金(IC18CT95-0024)资助项目
参考文献
1，Censini S, Lange C, Xiang Z, et al. Cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type 1-specific and disease-associated virulence factors. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,93：14648-14653.
2，Pagliaccia C, de Bernard M, Lupetti P, et al. The m2 form of the Helicobacter pylori cytotoxin has cell type-specific vacuolating activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95：10212-10217.
, 百拇医药
3，Pan Z, van der Hulst RWM, Fell M, et al. Equally high prevalence of infection with cag-positive Helicobacter pylori in Chinese patients with peptic ulcer disease and those with chronic gastritis-associated dyspepsia. J Clin Microbiol, 1997,35：1344-1347.
4，Xiang Z, Censini S, Bayeli M, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that cagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995,63：94-98.
, 百拇医药
5，Pan ZJ, Berg DE, van der Hulst RWM, et al. Prevence of vacuolating cytotoxin production and distrbution of distinct vacA alleles in Helicobacter pylori from China. J Infect Dis, 1998,178：220-226.
6，Covacci A, Falkow S, Berg DE, et al. Did the inheritence of a pathogenicity isoland modify the virulence of Helicobacter pylori? Trends Microbiol, 1997,5：205-208.
(收稿日期：1999-11-05), http://www.100md.com
单位：纪徐淮 许国铭 屠振兴 丁华 杜奕奇 李兆申(第二军医大学长海医院消化内科 上海200433)；John Telford Rino Rappukli(IRIS Research Center, Chiron Vaccines, Siena 53100, Italy)
关键词：
中华医学杂志001117 世界上约有50%的人感染幽门螺杆菌(Hp)，但仅有10%的感染者有临床症状，这可能与细菌毒力差异、宿主差异及环境因素等有关。最新研究发现，长约39 kb的cag致病岛(cag PAI)，含有与Ⅳ型分泌系统相关的所有毒力基因，可以强有力地诱导IL-8的分泌与表达[1]。另外，Hp致空泡变性毒素(VacA)在Hp致病过程中起关键作用[2]。我国是Hp感染的高发区，30岁以上的成人感染率高达70%[3]。但有关中国人群Hp基因特征所知较少。因此，对我国人群Hp vacA、cag PAI进行系统研究有助于进一步认识菌型的地理学变异，理解其在致病过程中的作用。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.Hp分离：从20例Hp感染患者胃粘膜活检中常规分离培养单克隆Hp 80株，经尿素酶试验、组织化学检查等确认。
2.VacA与Cag的蛋白质印渍分析：应用菌株水溶性浸出物，以兔抗人Hp重组的VacA或CagA抗血清作为一抗。按常规蛋白质印渍方法分析菌株VacA或CagA的表达[4]。
3.空泡毒性试验：将菌株水溶性浸出液加于每孔含105 HeLa或RK13细胞的96孔培养板上，孵育20 h，用中性红摄取试验作定量分析[2]。
4.vacA基因序列测定和分析：常规提取Hp DNA[3]。参考CCUG17874 vacA基因序列，设计特异性引物(表1)扩增vacA片段，用373A型DNA全自动测序分析仪(美国Applied Biosystems公司)测序[2]。应用Wiscosin unix软件包(10.0 Version)及Boxshader程序对序列进行比较分析。
, 百拇医药
5.cagPAI结构与Southern杂交：参照NCTC11637及CCUG17874的cag PAI序列，针对cag PAI不同片段设计5对引物(表1)进行PCR扩增[1]。采用Boehringer地高辛标记试剂盒标记这5对探针，与菌株DNA做Southern点杂交，经光敏显色。
二、结果
1.Hp菌株的CagA、VacA蛋白表达：20例80株单克隆Hp菌株，CagA及VacA的阳性率分别为97.5%(78/80)及95%(76/80)。除1例为CagA阳性与CagA阴性株、3例为VacA阳性与VacA阴性株混合感染、1例为CagA阳性VacA阴性株感染外，其余均为CagA阳性并VacA阳性菌株，剔除同一病例相同菌株，选择24株做进一步研究。
表1 用于vacA测序和cag PAI杂交的引物 扩增部位
, http://www.100md.com
引物名称
核苷酸序列
vacA
p37
DHWL
ACATTGGTTGTAGATACTATATAT
RIGT
GCCACAAATCCAGTGTTCCAATAT
DTPD
AACTCCGGATAAACCCGATAAAGT
RLYK
, 百拇医药 TGTATAAGTCGTATTCCTTGT
p58
DVWM
GTGTGGATGGGCCGTTTGCAATAC
RKYL
AAGATACTTGTAATTGTCAGGGTT
DPTQ
ACCCACGCAAGTCATTGATGGGCC
DTFN
ACTTTTAATAACGATATCCATCTA
RNAQ
, 百拇医药
TTGAGCGCTATTGATCTTAATGAG
DMI
AAACAGCAACGCAAGCATGGATT
RMI
CGAGTAATGTCGAAGGTGAT
DNDI
AACGATATCCGTTTAGGAAAAGCG
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GCTTTTAATAACAATATCAGTCTG
p33
DALY
, http://www.100md.com
GCCCTTTATAACAACAATAACCTC
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GGGTTAAATGTTTTGTAAGATTT
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GCTACTCCTAATTTAGTCGCTATC
DNAM
AATGCGATGATTTTAAATTCTCGT
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ATAATAATAACGCGCTTCCACATT
cag PAI
, http://www.100md.com cagA
D008
ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCG
R008
TTAGAATAATCAACAAACATCCACGCCA
5′-cagI
ARTF2
TATTGGCCTCGTTGATCAAACAAAGCTCTGC
HR2
GGGGTGATTTTAGTTTATCCATAA
IS605
, http://www.100md.com
E64U
GGTGGCTATCTCATCTATAACAGA
HI2H
TCATCGCTCCATAACTAGC
3′-cagⅡ
B2LI
AAGTGCATGCAGTAATTATGCGAA
E64Q
TCTAAAGAGAAACCAAATCCATTG
5′-cagⅡ
ORF8F
, 百拇医药
TCCACATGTTTCTAGTAGCAGGAC
ORF9Q
TACCTAGCAAAACAACCTATCCTC
2.体外细胞毒性试验：24株临床菌株中只有5株可诱导HeLa细胞产生大量空泡变性。然而，表达VacA蛋白的20个菌株均可诱导RK-13细胞产生明显空泡变性。
3.本组vacA基因序列特征及与西方菌株的主要变异：24株临床分离株中5株行vacA基因全长测序，其余针对信号肽及中间区序列进行部分测序。结果表明，所有菌株信号序列均为s1a型，但有3个氨基酸差异；5株为m1型，19株为m2型。基因发生学分析显示，中西方菌株vacA基因m1型之间相对距离相差显著，而m2型间相差不显著(表2)。表2 vacA基因中区序列的地理差异(
±s) 部位, http://www.100md.com
组间差异
100 bp中核苷酸替换数
西方菌株
上海菌株
西方菌株∶上海菌株
p58共同区
7.2±2.8
6.1±2.6
10.3±1.7
5′ml
4.4±2.2
4.9±2.2
, 百拇医药
13.8±3.3
3′ml
2.6±0.9
2.9±1.0
13.2±0.9
5′m2a
6.1±1.5
4.3±2.0
5.7±2.6
3′m2
2.6±0.8
3.3±1.0
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2.9±1.1
4.cag PAI的结构特征：所有24株菌株均存在cag PAI，点杂交阳性率100%。应用PCR法分析，cagA及5′-cagⅡ阳性率高达100%，5′-cagⅠ及3′-cagⅡ阳性率分别为85.2%及96.3%，而IS605插入的阳性率仅29.6%。
三、讨论
本研究显示，上海地区临床Hp分离株均表达VacA及CagA蛋白，属于Ⅰ型菌株。但仅20%的菌株可在体外诱导HeLa细胞产生明显空泡变性，而表达VacA的菌株均可诱导PK13细胞产生空泡变性，与国外最近文献报道一致[2]。vacA基因表型研究发现这些菌株多为m2型，与我国广州的结果类似[5]。这意味着中国东部及南部Hp感染的主要菌型为m2型，而欧美及日本以m1型占优势。不同人群流行不同m型Hp的机制可能与环境因素和宿主人群因素有关，也可能与Hp的长期演变进化有关[6]。cag PAI研究发现，所有临床分离株均获得cagPAI，但仅20.8%菌株的cag PAI中有IS605插入。cag PAI阳性率高于欧洲菌株，而IS605插入率低于欧洲菌株，可能与不同人群感染Hp时发生菌型适应性突变有关。尽管同一病例不同单克隆分离的Hp菌株vacA及cag PAI存在微小的差异，但真正不同菌型的混合感染并不多见。可见Hp感染过程中，宿主可能对感染的Hp菌株进行选择，而使某种菌型感染占优势。本结果表明，上海地区Hp vacA基因表型和cag PAI的结构特征与西方主要菌株相比存在明显差异，形成相对独立的亚族。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金(396706481)及欧共体委员会INCO-DC基金(IC18CT95-0024)资助项目
参考文献
1，Censini S, Lange C, Xiang Z, et al. Cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type 1-specific and disease-associated virulence factors. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,93：14648-14653.
2，Pagliaccia C, de Bernard M, Lupetti P, et al. The m2 form of the Helicobacter pylori cytotoxin has cell type-specific vacuolating activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95：10212-10217.
, 百拇医药
3，Pan Z, van der Hulst RWM, Fell M, et al. Equally high prevalence of infection with cag-positive Helicobacter pylori in Chinese patients with peptic ulcer disease and those with chronic gastritis-associated dyspepsia. J Clin Microbiol, 1997,35：1344-1347.
4，Xiang Z, Censini S, Bayeli M, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that cagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995,63：94-98.
, 百拇医药
5，Pan ZJ, Berg DE, van der Hulst RWM, et al. Prevence of vacuolating cytotoxin production and distrbution of distinct vacA alleles in Helicobacter pylori from China. J Infect Dis, 1998,178：220-226.
6，Covacci A, Falkow S, Berg DE, et al. Did the inheritence of a pathogenicity isoland modify the virulence of Helicobacter pylori? Trends Microbiol, 1997,5：205-208.
(收稿日期：1999-11-05), http://www.100md.com