局部分泌的血管抑素K(1～3)蛋白抑制人脑胶质瘤生长的实验研究
作者：吴景文 章翔 高大宽 荆俊杰 屈延 粱景文 刘先珍 王煊
单位：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所 西安市710032
关键词：脑肿瘤；抑制蛋白类；胶质瘤
中华医学杂志001119
【摘要】 目的 探讨局部分泌血管抑素K(1～3)蛋白[angiostatin K (1～3)，AK(1～3)]治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建AK(1～3)基因的真核表达载体pcDNA-SAK(1～3)，经脂质体法将该载体转染入人脑胶质瘤细胞SHG44，行G418筛选。用电镜和流式细胞仪测定转染细胞的生物学性状，以内皮细胞抑制实验和免疫荧光实验检测该细胞表达的AK(1～3)蛋白。应用裸鼠皮下致瘤性实验，结合免疫组织化学、电镜、微血管和瘤体坏死区计数，确定局部分泌AK(1～3)蛋白对裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的影响。结果 成功构建pcDNA-SAK(1～3)载体并在人脑胶质瘤细胞获得表达，该细胞在裸鼠皮下致瘤性和诱导血管生成能力显著下降(肿瘤终体积实验组为170 mm3，对照组为8 120 mm3，P<0.01；血管计数，实验组为5.4，对照组为12.2，P<0.01)。结论 局部分泌的AK(1～3)蛋白能抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长，可进一步用于实体瘤的治疗研究。
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Inhibition of human glioma growth in nude mice by local secretion of angiostatin K(1～3)
WU Jingwen ZHANG Xiang GAO Dakuan
(Neurosurgical Institute of PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China)
【Abstract】 Objective To discuss the feasibility of human glioma therapy by the local secretion of angiostatin K(1-3)[AK(1-3)]. Method AK(1-3) cDNA with secretive signal was inserted into polylinker sites of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3); The vector was transfected into human glioma SHG44 cells by lipofectamine and the positive clone was screened by G418. The biological characters of glioma cells were examined with electron microscopy and FCM. The activity of AK(1-3) protein expressed by the SHG44 cells was examined by the endotheliocyte inhibition assay and immunofluorescence assay. When the tumor cells were implanted into nude mice, the tumor necrosis and micrangium was calculated by immunohistochemistry and electron microscopy in order to determine the influence of AK(1-3) protein to the human glioma growth. Results The pcDNA-SAK(1-3) vector was successfully constructed and transfected into glioma cells that could express AK(1-3) protein. The tumorigenesis and angiogenesis of glioma cells in nude mice were greatly reduced (tumour end volume，experiment group 170 mm3，control group 8 120 mm3, P<0.01；Blood vessel counting，experimental group 5.4，control group 12.2，P<0.01). Conclusion The human glioma angiogenesis and growth were inhibited by the local secretion of AK(1-3). It can be further used in the treatment of other solid tumors.
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【Key words】 Brain neoplasms； Arrestins； Gliomas
在血管生成抑制因子家族中，血管抑素K(1～3) 片段由纤维蛋白溶酶原(plasminogen, Pgn)的前3个kringles区(Ks)组成，它是一种非常有效的血管生成抑制剂[1，2]。目前，国外大多采用AK(1～3)的原核表达蛋白进行实体瘤的治疗研究，取得了一定疗效。本研究在转染AK(1～3)基因的SHG44细胞于裸鼠皮下形成移植瘤后，探讨了瘤细胞真核表达并局部分泌的AK(1～3)蛋白对胶质瘤血管生成和肿瘤生长的影响。
材料与方法
一、材料
宿主菌E.Coli DH5α，SHG44人脑胶质瘤细胞株和pcDNA3真核表达载体由本所保存。SAK(1～3)基因的载体质粒为pSAK(1～3)，酶切位点为EcoRI和XbaI，由本所克隆所得，共916 bp，其中前57 bp为编码19个氨基酸的Pgn分泌信号肽序列，后859 bp为编码约280～286个氨基酸的AK(1～3)基因序列，该基因原核表达蛋白具有抑制牛毛细血管内皮细胞增殖活性[3，4]。兔抗人 Pgn单克隆抗体购自(英国DAKO公司)，T4 DNA ligase，PCR 纯化试剂盒，质粒纯化试剂盒，各种限制性内切酶，Lipofectamine和G418，鼠抗兔SABC试剂盒和Von Willebrand 因子分别为Promega、Clontech、上海华顺、Gibco、Sigma和博士德公司产品。15只裸鼠购自本校实验动物中心。
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二、方法
1.真核表达载体pcDNA-SAK(1～3)的构建和鉴定：将1 μg pSAK(1～3)和0.5 μg pcDNA3质粒分别以EcoR I和Xba I双酶切，电泳回收目的基因与载体片段，并将其分别溶于20 μl TE中。 连接时取1 μl载体片段和5 μl目的基因片段，以1∶5分子比率相连接，转化DH5α。结果含Ampr琼脂平板上长出约90克隆。随机选取8个克隆，小量提取质粒，以EcoRI和XbaI双酶切鉴定，切除约916 bp的克隆为阳性克隆，并将该重组质粒命名为pcDNA-SAK(1～3)。
2.pcDNA-SAK(1～3)载体转染SHG44细胞：参照Lipofectamine说明书进行。SHG44细胞分为实验组[转染pcDNA-SAK(1～3)]、对照组(不转染)和空载体组(转染pcDNA3)。实验组和空载体组经G418筛选1周后，应用单细胞显微镜操作法选取单个阳性克隆，继续在G418抗性培养液内筛选2周。转染成功细胞扩大培养并收集培养上清液。上述转染细胞的后继培养始终在G418的筛选压力下进行，以防转入基因的丢失。
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3.SHG44细胞的生物学性状检测：实验组、空载体组和对照组细胞各约3×106个，用无血清培养液洗涤2次，经胰酶消化离心后戊二醛固定，送本校电镜室观察细胞超微结构；上述细胞在25 ml培养瓶长至70%～80%，经上述同样洗涤消化后，使0.1 ml细胞终体积混匀，并注入10 ml/L、 700 ml/L盛冷乙醇烧杯中，制成单细胞悬液，送本校中心实验室进行细胞周期检测；上述3种细胞以2×104密度接种于25 ml培养瓶，各接种7瓶，每日各取1瓶倒置显微镜下观察计数，比较各组细胞的生长速度。
4.AK(1～3) 表达蛋白的活性测定：(1)内皮细胞抑制实验：体外分离并原代培养的牛毛细血管内皮细胞传至第4代时，加入上述3组瘤细胞上清400 μl，继续培养24 h后进行观察；(2)免疫组织化学：对3组SHG44细胞爬片，用兔抗人Pgn单克隆抗体，采用SABC法检测AK(1～3)表达蛋白；(3)免疫荧光实验 ：一抗为兔抗人Pgn单抗，对照一抗为兔血清，二抗为荧光素标记的鼠抗兔抗体。上述3组细胞制成单细胞悬液(1×106)，用PBS洗2次，加40 g/L多聚甲醛固定40 min，离心沉淀溶于200 μl TritonX(1 g/L) 溶液中。37℃作用1 h后，PBS洗2次，依次加入100 μl小羊血清(100 ml/L)稀释的一抗(1∶50)和100 μl PBS稀释的二抗(1∶100)，最后用PBS稀释至总量为400 μl后送检。
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5.SHG44细胞裸鼠皮下致瘤性：15只成年裸鼠分为实验组，空载体组和对照组，每组5只。裸鼠用甲氧氟烷吸入麻醉，每只右腿上部皮下注射100 μl无血清培养液含3×106个相应各组细胞，接种后严密观察肿瘤生长情况。肿瘤形成后，每日用三维卡规测量肿瘤体积V(mm3)＝长×宽×高，V是每组5只裸鼠肿瘤体积平均值。接种30 d后，处死裸鼠，取肿瘤、肝脏和肺组织标本，经常规处理后，制成4 μm厚系列石蜡切片。
6.各种组织标本的检测：(1)HE染色和免疫组织化学：对肝、肺和肿瘤标本进行HE染色。用SABC免疫组织化学法，分别采用兔抗人Pgn单克隆抗体和Von Willebrand因子检测肿瘤标本AK(1～3)表达和血管生成情况；(2)电镜：将实验组和对照组肿瘤标本各1块固定后送本校电镜室检查；(3)肿瘤坏死率和血管计数[5]：使用IS-2000数字图像分析系统计算每一肿瘤存在的坏死百分比。坏死区通过每一切片的长和宽来计算，坏死率以坏死面积占肿瘤面积的百分比表示，从肿瘤最外边直至中央，以2个肿瘤切片坏死面积平均值占肿瘤面积的百分比统计坏死率。肿瘤血管数由每一切片内的血管数量决定，计算每组2个肿瘤，每个肿瘤5个切片，每个切片随机选择10个视野(每视野0.6 mm ×0.4 mm)的血管平均数量，肿瘤切片选自瘤体最外边，中心和次外边，以确保抽样来源于整个肿瘤。
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7.统计学处理： 数据均用均数±标准差和百分比(%)表示，采用SPSS软件进行数据处理，差异显著性检验采用t检验或χ2检验。
结果
1.pcDNA-SAK(1～3)载体的构建和鉴定：pcDNA-SAK(1～3)载体以BamHI和XbaI双酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组克隆构建正确(图1)。
2.转染成功的SHG44阳性克隆： 实验组和空载体组细胞在200 μg/ml G418筛选压力下开始呈克隆状生长，挑出单细胞克隆后，在400 μg/ml G418筛选压力下呈片状生长；而对照组细胞在200 μg/ml G418筛选压力下全部死亡。
图1 重组质粒pcDNA-SAK(1～3)的双酶切鉴定
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3.SHG44细胞的生物学性状检测：(1)电镜：实验组、对照组、空载体组细胞均表现为细胞核大、胞浆较少和线粒体增多；实验组内质网扩张和胞浆内有分泌颗粒(图2)；(2)流式细胞仪：实验组、对照组、空载体组G1，S 和G2期未见差异性改变；(3)细胞生长速率：3种细胞接种后，经1～7 d的计数观察，体外生长速率一致。
4.AK(1～3)表达蛋白生物学活性测定：(1)内皮细胞抑制实验：实验组上清液明显抑制内皮细胞增殖，而对照和空载体组上清液不抑制内皮细胞生长；(2)免疫组织化学；实验组瘤细胞检测到AK(1～3)表达, 表达蛋白为棕黄色颗粒分布于细胞周围；对照组或空载体组瘤细胞未检测到AK(1～3)表达；(3)免疫荧光实验：结果与免疫组化相同。
5.裸鼠皮下胶质瘤的生长特性：对照组和空载体组的肿瘤生长速率一致(t=1.574，P>0.05)；实验组肿瘤出现较晚，生长速率较慢且瘤体相对较小(分别与对照组和空载体组相比，t1＝5.698, t2=5.536, P1，P2<0.01)。在接种后第12、18、24和30 d，各组肿瘤平均体积分别为：对照组(43±1、370±9、1 445±34和8 120 mm3±191 mm3)，空载体组(42±1、376±9、1 430±33和7 929 mm3±187 mm3)，实验组(0，3±0.5，75±2和170 mm3±4 mm3)(图4)。
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6.各种组织标本检测：(1)免疫组织化学和HE染色：实验组AK(1～3)表达较高，而对照组和空载细胞核体组无AK(1～3)表达。实验组较对照组血管明显减少。肝和肺的HE染色未见肿瘤转移，实验组HE染色见瘤体有较多出血和坏死，血管较少；空载体和对照组HE染色见出血和坏死均较少，血管和瘤细胞增生活跃。(2)电镜：实验组瘤体有较多出血和坏死，瘤细胞有核固缩现象；对照组瘤细胞增生活跃，有极少量坏死，未见瘤内出血，2组瘤细胞超微结构未见明显差异性改变。(3)肿瘤坏死率和血管计数：用肿瘤切片进行肿瘤坏死和血管计数。对照组、空载体组和实验组肿瘤平均坏死率分别为9.6%，9.3%和36.0%；血管计数分别为12.2，11.4和5.40。在肿瘤坏死率上，实验组显著高于对照组或空载体组(χ21=7.85, χ22=7.94, P1, P2<0.01)，而在血管计数上，实验组显著低于对照组或空载体组(X21=6.74,χ22=6.69, P1, P2<0.01)，空载体组与对照组在上述的肿瘤坏死率或血管计数比较中差异无显著意义(χ21=0.086，χ22=0.075，P1，P2>0.05)。
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图2 SHG44细胞的电镜照片 ×7 500
图3 裸鼠皮下人脑胶质瘤标本
讨论
本研究初步证实，应用AK(1～3)基因可抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长，具有一定的治疗作用。
在体外实验中，我们将带有分泌信号肽序列的SAK(1～3)基因构建在真核表达载体pcDNA3上，并将其转染入SHG44胶质瘤细胞中，获得了较理想的体外表达。AK(1～3)表达与受体瘤细胞和质粒载体均有密切关系。首先，SHG44瘤细胞能主动识别Pgn分泌信号肽且使其出细胞后降解，保证了AK(1～3)蛋白在细胞间质中发挥其抗血管生成作用；其次， pcDNA3真核表达载体具有SV40早期启动子驱动的抗新霉素基因Neor，可用G418进行压力筛选，使转染AK(1～3)基因的SHG44细胞得到大量扩增和稳定生长，从而确定了SHG44瘤细胞被移植时携带有AK(1～3)基因质粒。各种体外实验检测结果表明，实验组瘤细胞能表达和分泌AK(1～3)蛋白，而对照和空载体组瘤细胞无此功能。实验组瘤细胞的超微结构特点是有分泌颗粒存在和溶酶体增多，说明溶酶体对外源蛋白的吞饮作用增强；该组瘤细胞上清液能显著抑制体外培养的牛毛细血管内皮细胞增殖，而对照和空载体组瘤细胞上清液不具备此作用；实验组、空载体组和对照组的瘤细胞周期或体外生长速率基本一致。上述这些结果说明，转染AK(1～3)基因或空载体质粒对体外胶质瘤细胞的生物学特性没有影响。
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体内实验表明，胶质瘤生长依赖于其自身的血管生成，当移植瘤小于0.4 mm3时尚未形成血管，肿瘤呈缓慢的线性生长；当超过0.4 mm3时，肿瘤开始形成自身的血管系统，呈快速的近指数生长。研究发现，实验组瘤细胞株与对照和空载体组相比，它在裸鼠皮下致瘤性显著下降，表现为裸鼠皮下移植瘤形成较晚、生长速率较慢、肿瘤体积也较小，这可能与实验组瘤细胞表达AK(1～3)蛋白使其血管生成受阻有关。胶质瘤标本的各项检测结果充分证实了上述推断，如实验组胶质瘤高表达AK(1～3)蛋白，而对照和空载体组不表达；实验组的血管数量明显减少，其缺血坏死率亦明显增高[6，7]。
上述结果说明，采用瘤细胞局部分泌的AK(1～3)蛋白，可阻止裸鼠皮下人脑胶质瘤的血管生成，进而抑制了胶质瘤增长。该项实验为临床进一步应用抗血管生成方法治疗人脑胶质瘤或其他实体瘤研究奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970854)
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参考文献
1，吴景文, 章翔. 血管抑素与肿瘤的抗血管生成治疗. 国外医学肿瘤学分册. 1998, 25:16-17.
2，Hayes AJ, Li LY, Lippman ME. Antivascular therapy: a new approach to cancer treatment. BMJ, 1999,318:853-856.
3，Zhang Xiang, Wu Jingwen, Gao D, et al. Cloning and sequencing of the fragment of angiostatin K(1-3) gene.Chin Med J,1999,112:947-950.
4，吴景文，章翔，柴玉波,等.AngiostatinK(1～3)基因真核表达载体的构建、鉴定和表达.细胞与分子生物学杂志,2000,16:10-13.
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5，Weidner N. Current pathological methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors. Breast Cancer Res Treat,1996, 36: 169-180.
6，Frank Griscelli, Li Hong, Annelise BG, et al. Angiostatin gene transfer: Inhibition of tumor growth in vivo by blockage of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest. Med Sci, 1998, 95: 6367-6372.
7，CaoYihai, O'Reilly MS, Marshall B, et al. Expression of angiostatin cDNA in a murine fibrosarcoma suppresses primary tumor growth and produces long-term dormancy of metastases. J Clin Invest, 1998, 101:1055-1063.
(收稿日期:2000-03-27), 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所 西安市710032
关键词：脑肿瘤；抑制蛋白类；胶质瘤
中华医学杂志001119
【摘要】 目的 探讨局部分泌血管抑素K(1～3)蛋白[angiostatin K (1～3)，AK(1～3)]治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建AK(1～3)基因的真核表达载体pcDNA-SAK(1～3)，经脂质体法将该载体转染入人脑胶质瘤细胞SHG44，行G418筛选。用电镜和流式细胞仪测定转染细胞的生物学性状，以内皮细胞抑制实验和免疫荧光实验检测该细胞表达的AK(1～3)蛋白。应用裸鼠皮下致瘤性实验，结合免疫组织化学、电镜、微血管和瘤体坏死区计数，确定局部分泌AK(1～3)蛋白对裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的影响。结果 成功构建pcDNA-SAK(1～3)载体并在人脑胶质瘤细胞获得表达，该细胞在裸鼠皮下致瘤性和诱导血管生成能力显著下降(肿瘤终体积实验组为170 mm3，对照组为8 120 mm3，P<0.01；血管计数，实验组为5.4，对照组为12.2，P<0.01)。结论 局部分泌的AK(1～3)蛋白能抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长，可进一步用于实体瘤的治疗研究。
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Inhibition of human glioma growth in nude mice by local secretion of angiostatin K(1～3)
WU Jingwen ZHANG Xiang GAO Dakuan
(Neurosurgical Institute of PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China)
【Abstract】 Objective To discuss the feasibility of human glioma therapy by the local secretion of angiostatin K(1-3)[AK(1-3)]. Method AK(1-3) cDNA with secretive signal was inserted into polylinker sites of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3); The vector was transfected into human glioma SHG44 cells by lipofectamine and the positive clone was screened by G418. The biological characters of glioma cells were examined with electron microscopy and FCM. The activity of AK(1-3) protein expressed by the SHG44 cells was examined by the endotheliocyte inhibition assay and immunofluorescence assay. When the tumor cells were implanted into nude mice, the tumor necrosis and micrangium was calculated by immunohistochemistry and electron microscopy in order to determine the influence of AK(1-3) protein to the human glioma growth. Results The pcDNA-SAK(1-3) vector was successfully constructed and transfected into glioma cells that could express AK(1-3) protein. The tumorigenesis and angiogenesis of glioma cells in nude mice were greatly reduced (tumour end volume，experiment group 170 mm3，control group 8 120 mm3, P<0.01；Blood vessel counting，experimental group 5.4，control group 12.2，P<0.01). Conclusion The human glioma angiogenesis and growth were inhibited by the local secretion of AK(1-3). It can be further used in the treatment of other solid tumors.
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【Key words】 Brain neoplasms； Arrestins； Gliomas
在血管生成抑制因子家族中，血管抑素K(1～3) 片段由纤维蛋白溶酶原(plasminogen, Pgn)的前3个kringles区(Ks)组成，它是一种非常有效的血管生成抑制剂[1，2]。目前，国外大多采用AK(1～3)的原核表达蛋白进行实体瘤的治疗研究，取得了一定疗效。本研究在转染AK(1～3)基因的SHG44细胞于裸鼠皮下形成移植瘤后，探讨了瘤细胞真核表达并局部分泌的AK(1～3)蛋白对胶质瘤血管生成和肿瘤生长的影响。
材料与方法
一、材料
宿主菌E.Coli DH5α，SHG44人脑胶质瘤细胞株和pcDNA3真核表达载体由本所保存。SAK(1～3)基因的载体质粒为pSAK(1～3)，酶切位点为EcoRI和XbaI，由本所克隆所得，共916 bp，其中前57 bp为编码19个氨基酸的Pgn分泌信号肽序列，后859 bp为编码约280～286个氨基酸的AK(1～3)基因序列，该基因原核表达蛋白具有抑制牛毛细血管内皮细胞增殖活性[3，4]。兔抗人 Pgn单克隆抗体购自(英国DAKO公司)，T4 DNA ligase，PCR 纯化试剂盒，质粒纯化试剂盒，各种限制性内切酶，Lipofectamine和G418，鼠抗兔SABC试剂盒和Von Willebrand 因子分别为Promega、Clontech、上海华顺、Gibco、Sigma和博士德公司产品。15只裸鼠购自本校实验动物中心。
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二、方法
1.真核表达载体pcDNA-SAK(1～3)的构建和鉴定：将1 μg pSAK(1～3)和0.5 μg pcDNA3质粒分别以EcoR I和Xba I双酶切，电泳回收目的基因与载体片段，并将其分别溶于20 μl TE中。 连接时取1 μl载体片段和5 μl目的基因片段，以1∶5分子比率相连接，转化DH5α。结果含Ampr琼脂平板上长出约90克隆。随机选取8个克隆，小量提取质粒，以EcoRI和XbaI双酶切鉴定，切除约916 bp的克隆为阳性克隆，并将该重组质粒命名为pcDNA-SAK(1～3)。
2.pcDNA-SAK(1～3)载体转染SHG44细胞：参照Lipofectamine说明书进行。SHG44细胞分为实验组[转染pcDNA-SAK(1～3)]、对照组(不转染)和空载体组(转染pcDNA3)。实验组和空载体组经G418筛选1周后，应用单细胞显微镜操作法选取单个阳性克隆，继续在G418抗性培养液内筛选2周。转染成功细胞扩大培养并收集培养上清液。上述转染细胞的后继培养始终在G418的筛选压力下进行，以防转入基因的丢失。
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3.SHG44细胞的生物学性状检测：实验组、空载体组和对照组细胞各约3×106个，用无血清培养液洗涤2次，经胰酶消化离心后戊二醛固定，送本校电镜室观察细胞超微结构；上述细胞在25 ml培养瓶长至70%～80%，经上述同样洗涤消化后，使0.1 ml细胞终体积混匀，并注入10 ml/L、 700 ml/L盛冷乙醇烧杯中，制成单细胞悬液，送本校中心实验室进行细胞周期检测；上述3种细胞以2×104密度接种于25 ml培养瓶，各接种7瓶，每日各取1瓶倒置显微镜下观察计数，比较各组细胞的生长速度。
4.AK(1～3) 表达蛋白的活性测定：(1)内皮细胞抑制实验：体外分离并原代培养的牛毛细血管内皮细胞传至第4代时，加入上述3组瘤细胞上清400 μl，继续培养24 h后进行观察；(2)免疫组织化学：对3组SHG44细胞爬片，用兔抗人Pgn单克隆抗体，采用SABC法检测AK(1～3)表达蛋白；(3)免疫荧光实验 ：一抗为兔抗人Pgn单抗，对照一抗为兔血清，二抗为荧光素标记的鼠抗兔抗体。上述3组细胞制成单细胞悬液(1×106)，用PBS洗2次，加40 g/L多聚甲醛固定40 min，离心沉淀溶于200 μl TritonX(1 g/L) 溶液中。37℃作用1 h后，PBS洗2次，依次加入100 μl小羊血清(100 ml/L)稀释的一抗(1∶50)和100 μl PBS稀释的二抗(1∶100)，最后用PBS稀释至总量为400 μl后送检。
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5.SHG44细胞裸鼠皮下致瘤性：15只成年裸鼠分为实验组，空载体组和对照组，每组5只。裸鼠用甲氧氟烷吸入麻醉，每只右腿上部皮下注射100 μl无血清培养液含3×106个相应各组细胞，接种后严密观察肿瘤生长情况。肿瘤形成后，每日用三维卡规测量肿瘤体积V(mm3)＝长×宽×高，V是每组5只裸鼠肿瘤体积平均值。接种30 d后，处死裸鼠，取肿瘤、肝脏和肺组织标本，经常规处理后，制成4 μm厚系列石蜡切片。
6.各种组织标本的检测：(1)HE染色和免疫组织化学：对肝、肺和肿瘤标本进行HE染色。用SABC免疫组织化学法，分别采用兔抗人Pgn单克隆抗体和Von Willebrand因子检测肿瘤标本AK(1～3)表达和血管生成情况；(2)电镜：将实验组和对照组肿瘤标本各1块固定后送本校电镜室检查；(3)肿瘤坏死率和血管计数[5]：使用IS-2000数字图像分析系统计算每一肿瘤存在的坏死百分比。坏死区通过每一切片的长和宽来计算，坏死率以坏死面积占肿瘤面积的百分比表示，从肿瘤最外边直至中央，以2个肿瘤切片坏死面积平均值占肿瘤面积的百分比统计坏死率。肿瘤血管数由每一切片内的血管数量决定，计算每组2个肿瘤，每个肿瘤5个切片，每个切片随机选择10个视野(每视野0.6 mm ×0.4 mm)的血管平均数量，肿瘤切片选自瘤体最外边，中心和次外边，以确保抽样来源于整个肿瘤。
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7.统计学处理： 数据均用均数±标准差和百分比(%)表示，采用SPSS软件进行数据处理，差异显著性检验采用t检验或χ2检验。
结果
1.pcDNA-SAK(1～3)载体的构建和鉴定：pcDNA-SAK(1～3)载体以BamHI和XbaI双酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组克隆构建正确(图1)。
2.转染成功的SHG44阳性克隆： 实验组和空载体组细胞在200 μg/ml G418筛选压力下开始呈克隆状生长，挑出单细胞克隆后，在400 μg/ml G418筛选压力下呈片状生长；而对照组细胞在200 μg/ml G418筛选压力下全部死亡。
图1 重组质粒pcDNA-SAK(1～3)的双酶切鉴定
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3.SHG44细胞的生物学性状检测：(1)电镜：实验组、对照组、空载体组细胞均表现为细胞核大、胞浆较少和线粒体增多；实验组内质网扩张和胞浆内有分泌颗粒(图2)；(2)流式细胞仪：实验组、对照组、空载体组G1，S 和G2期未见差异性改变；(3)细胞生长速率：3种细胞接种后，经1～7 d的计数观察，体外生长速率一致。
4.AK(1～3)表达蛋白生物学活性测定：(1)内皮细胞抑制实验：实验组上清液明显抑制内皮细胞增殖，而对照和空载体组上清液不抑制内皮细胞生长；(2)免疫组织化学；实验组瘤细胞检测到AK(1～3)表达, 表达蛋白为棕黄色颗粒分布于细胞周围；对照组或空载体组瘤细胞未检测到AK(1～3)表达；(3)免疫荧光实验：结果与免疫组化相同。
5.裸鼠皮下胶质瘤的生长特性：对照组和空载体组的肿瘤生长速率一致(t=1.574，P>0.05)；实验组肿瘤出现较晚，生长速率较慢且瘤体相对较小(分别与对照组和空载体组相比，t1＝5.698, t2=5.536, P1，P2<0.01)。在接种后第12、18、24和30 d，各组肿瘤平均体积分别为：对照组(43±1、370±9、1 445±34和8 120 mm3±191 mm3)，空载体组(42±1、376±9、1 430±33和7 929 mm3±187 mm3)，实验组(0，3±0.5，75±2和170 mm3±4 mm3)(图4)。
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6.各种组织标本检测：(1)免疫组织化学和HE染色：实验组AK(1～3)表达较高，而对照组和空载细胞核体组无AK(1～3)表达。实验组较对照组血管明显减少。肝和肺的HE染色未见肿瘤转移，实验组HE染色见瘤体有较多出血和坏死，血管较少；空载体和对照组HE染色见出血和坏死均较少，血管和瘤细胞增生活跃。(2)电镜：实验组瘤体有较多出血和坏死，瘤细胞有核固缩现象；对照组瘤细胞增生活跃，有极少量坏死，未见瘤内出血，2组瘤细胞超微结构未见明显差异性改变。(3)肿瘤坏死率和血管计数：用肿瘤切片进行肿瘤坏死和血管计数。对照组、空载体组和实验组肿瘤平均坏死率分别为9.6%，9.3%和36.0%；血管计数分别为12.2，11.4和5.40。在肿瘤坏死率上，实验组显著高于对照组或空载体组(χ21=7.85, χ22=7.94, P1, P2<0.01)，而在血管计数上，实验组显著低于对照组或空载体组(X21=6.74,χ22=6.69, P1, P2<0.01)，空载体组与对照组在上述的肿瘤坏死率或血管计数比较中差异无显著意义(χ21=0.086，χ22=0.075，P1，P2>0.05)。
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图2 SHG44细胞的电镜照片 ×7 500
图3 裸鼠皮下人脑胶质瘤标本
讨论
本研究初步证实，应用AK(1～3)基因可抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长，具有一定的治疗作用。
在体外实验中，我们将带有分泌信号肽序列的SAK(1～3)基因构建在真核表达载体pcDNA3上，并将其转染入SHG44胶质瘤细胞中，获得了较理想的体外表达。AK(1～3)表达与受体瘤细胞和质粒载体均有密切关系。首先，SHG44瘤细胞能主动识别Pgn分泌信号肽且使其出细胞后降解，保证了AK(1～3)蛋白在细胞间质中发挥其抗血管生成作用；其次， pcDNA3真核表达载体具有SV40早期启动子驱动的抗新霉素基因Neor，可用G418进行压力筛选，使转染AK(1～3)基因的SHG44细胞得到大量扩增和稳定生长，从而确定了SHG44瘤细胞被移植时携带有AK(1～3)基因质粒。各种体外实验检测结果表明，实验组瘤细胞能表达和分泌AK(1～3)蛋白，而对照和空载体组瘤细胞无此功能。实验组瘤细胞的超微结构特点是有分泌颗粒存在和溶酶体增多，说明溶酶体对外源蛋白的吞饮作用增强；该组瘤细胞上清液能显著抑制体外培养的牛毛细血管内皮细胞增殖，而对照和空载体组瘤细胞上清液不具备此作用；实验组、空载体组和对照组的瘤细胞周期或体外生长速率基本一致。上述这些结果说明，转染AK(1～3)基因或空载体质粒对体外胶质瘤细胞的生物学特性没有影响。
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体内实验表明，胶质瘤生长依赖于其自身的血管生成，当移植瘤小于0.4 mm3时尚未形成血管，肿瘤呈缓慢的线性生长；当超过0.4 mm3时，肿瘤开始形成自身的血管系统，呈快速的近指数生长。研究发现，实验组瘤细胞株与对照和空载体组相比，它在裸鼠皮下致瘤性显著下降，表现为裸鼠皮下移植瘤形成较晚、生长速率较慢、肿瘤体积也较小，这可能与实验组瘤细胞表达AK(1～3)蛋白使其血管生成受阻有关。胶质瘤标本的各项检测结果充分证实了上述推断，如实验组胶质瘤高表达AK(1～3)蛋白，而对照和空载体组不表达；实验组的血管数量明显减少，其缺血坏死率亦明显增高[6，7]。
上述结果说明，采用瘤细胞局部分泌的AK(1～3)蛋白，可阻止裸鼠皮下人脑胶质瘤的血管生成，进而抑制了胶质瘤增长。该项实验为临床进一步应用抗血管生成方法治疗人脑胶质瘤或其他实体瘤研究奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970854)
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参考文献
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3，Zhang Xiang, Wu Jingwen, Gao D, et al. Cloning and sequencing of the fragment of angiostatin K(1-3) gene.Chin Med J,1999,112:947-950.
4，吴景文，章翔，柴玉波,等.AngiostatinK(1～3)基因真核表达载体的构建、鉴定和表达.细胞与分子生物学杂志,2000,16:10-13.
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5，Weidner N. Current pathological methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors. Breast Cancer Res Treat,1996, 36: 169-180.
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7，CaoYihai, O'Reilly MS, Marshall B, et al. Expression of angiostatin cDNA in a murine fibrosarcoma suppresses primary tumor growth and produces long-term dormancy of metastases. J Clin Invest, 1998, 101:1055-1063.
(收稿日期:2000-03-27), 百拇医药