雷公藤甲素对哮喘豚鼠肺组织表达IL-5、GM-CSFmRNA的作用
作者：郭晓明 郭爱云 樊丽荣 王长征 钱桂生
单位：郭晓明(中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000)；郭爱云(中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000)；樊丽荣(中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000)；王长征(第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所 四川 重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所 四川 重庆 400037)
关键词：哮喘；动物模型；豚鼠；雷公藤甲素；白介素-5；粒细胞-巨噬细胞集落；刺激因子
中国医师杂志001105 【摘要】 为探讨白介素-5(IL-5)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA在哮喘豚 鼠肺组织中的表达及雷公藤甲素的影响。本组采用原位杂交方法检测3组豚鼠(共30只)肺组 织IL-5、GM-CSFmRNA的表达。结果发现哮喘组肺组织IL-5、GM-CSFmRNA的表达强度分别为(3 6 .38±7.65和32.78±9.43)；处理组分别为(17.46±7.32和18.92±6.38)；对照组 分别为(13.82±5.43和18.27±7.45)。哮喘组IL-5、GM-CSFmRNA表达强度显著高于对照 组和处 理组(P<0.01)。 说明哮喘豚鼠肺组织IL-5、G M-CSFmRNA高表达可能在哮喘气道炎症中发挥重要作用。而雷公藤甲素可能通过抑制IL-5、G M-CSF的分泌而发挥抗哮喘气道炎症的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] 562.2+5 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372(2000)11 -0651-03
Action of Triptolide in the Expressions of IL-5，GM-CSF mRNA in Pulmonary Tissue of Asthmatic Guinea Pig
GUO Xiao-ming,GUO Ai-yun,FAN Li-rong,et al.251st Hospital of PLA Zh angjiakuo,075000,China
【Abstract】 To research the expressions of IL-5,granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF) in the asthmatic guinea pig pulmonary tissue and infl uence of triptolide on the expression,30 guinea pigs were divided at random into three groups:the asthma group(n＝10),treated group(n＝10) and control gr ou p(n＝10).The expression levels of the IL-5,GM-CSF mRNA were detected by usi ng in situ hybridization method.The results showed that the expressive intensit ies of IL-5,GM-CSF mRNA in asthma group were 36.38±7.65 and 32.78±9.43 res pectively;the treated group were 17.46±7.32 and 18.92±6.38 respectively;co ntrol group were 13.82±5.43 and 18.27±7.45 respectively.The expressive int en sities of IL-5,GM-CFS mRNA in asthmatic group were obviously higther than those of both treated and control groups,there was significantly difference between tw o groups(P<0.01). The data suggest that the overexpression of IL-5,CM-CSF in the pulmonary tissu e of asthmatic guinea pig may be play an important role in development of the as thmatic airway inflammation.
, 百拇医药
Key Words Asthma,Animal model;Triptolide;Interleukin-5;Granulocyte-Mac rophage;Colony stimulating factor
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(Eos)、T淋巴细胞等参与的气道慢性炎 症性疾病。哮喘时活化的T淋巴细胞分泌IL-3、IL-5和GM-CSF等增多，从而促进Eos在骨髓中 的 生成增多，以及在气道局部的募集、活化，并延长Eos的存活时间[1]。雷公藤是矛 卫科植物。雷公藤甲素是从雷公藤中提取的三环二萜类雷公藤内酯醇，兼有抗炎及免疫抑制 作用[2]，已广泛应用于自身免疫性疾病，如关节炎、血管炎等，本实验观察了哮 喘组、处理组和对照组三组豚鼠IL-5、GM-CSFmRNA表达。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 IL-5、GM-CSF探针由重庆第三军医大学新桥医院全军呼吸 病研究所赖克方博士合成并惠赠。IL-5探针序列为3’-CACTCGGTGTTCATTA-CAVCCAAGAAACTCT -5’；GM-CSF探针序列为3-CTGACGACCCTCGCTGGT-
, http://www.100md.com
CAGGTCC-5’。
1.2 哮喘豚鼠模型 雄性健康豚鼠400～500g，30只随机分为哮喘组、处理 组和对照组。采用卵白蛋白致敏和激发建立哮喘模型，激发时吸入2%卵白蛋白生理盐水1h或 出现哮喘样发作为止；对照组按哮喘组的方法应用生理盐水代替卵白蛋白处理。
1.3 留取肺组织 分别留取三组豚鼠肺组织，三组豚鼠均在激发48h后留标 本，处理组待豚鼠出现哮喘样发作24h后，给予腹腔注射雷公藤甲素20mg/kg；留取标本 后液氮速冻制成5μm厚冰冻切片，置于-70℃保存备用。
1.4 肺组织IL-5、GM-CSFmRNA原位杂交检测 取肺组织冰冻切片，0.1MPB S漂洗5min，0.3%TritonX-100 20min，蛋白酶K(2ng/ml)37℃，30min，4%多聚甲醛5min，( 1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1MTris-HCL，pH8.0 10min，2×SSC漂洗10min，杂交 液(每片加含有IL-5、GM-CSF探针标记液20μl)，45℃下，20h，4×SSC，37℃下、15min，2 ×SSC，37℃下，30min，依次转入1×SSC、0.5×SSC，37℃下各10min，0.5MPBS漂洗 5min，加Anti-Dig-Ap抗(1∶1000)37℃下，1h，转入4℃下，20h，TSM1、TSM2各10min，NBT /BCIP显色3～4h，0.05MPBS漂洗，终止反应，中性树胶封片。杂交前所需液体及试剂均需D EPC无RNAase处理。
, http://www.100md.com
1.5 统计分析 肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达强度：在高倍视野(×400)下 ，随机选择10个视野计数IL-5、GM-CSFmRNA表达的阳性细胞数，单位面积内的表达强度用10 个高倍视野下IL-5mRNA或GM-CSFmRNA阳性细胞数的平均值表示(细胞数/hps)。资料采用非配 对资料t检验，P<0.05差异显著。
2 结果
2.1 结果判定 IL-5、GM-CSFmRNA阳性信号为紫兰色或棕兰色颗粒，主要 集中在胞核区及核周边区域。
2.2 豚鼠肺组织IL-5mRNA、GM-CSFmRNA表达强度 哮喘组IL-5、GM-CSFmRN A 单位面积内的阳性细胞数显著高于处理组和对照组(P<0.01)，而处理组与对照组比较 无显著差异(P>0.05)。
3 讨论
, http://www.100md.com
目前认为支气管哮喘是因为变态反应所致的慢性 气道炎症性疾病，主要由Eos、T淋巴细胞及单核细胞等参与，其中T淋巴细胞受到抗 原刺激后被激活，可产 生多种细胞因子，如IL-5、GM-CSF等，其中IL-5特异性地作用于Eos生成与分化的各个阶段 。Eos在肺组织内浸润与活化引起气道炎症和气道高反应性的过程受IL-5调控[3]。 IL-5、GM-CSF本身不能损伤气道上皮，但可通过促进Eos的产生、活化及介质释放等作用在 哮喘的气道炎症中发挥重要作用。给豚鼠模型的气管内滴入IL-5可诱导Eos增多及产生气道 高反应性[4]。而抗IL-5抗体可抑制这些作用[5，6]。IL-5、GM-CSF可延 长Eos的存活时间，使正常密度Eos转化为低密度表型，增加Eos对趋化因子的反应[7] 。雷公藤为具有免疫抑制作用的中药，主要成份是雷公藤内酯醇又称雷公藤甲素，以往主 要用于治疗类风湿、血管炎等。邵静芳等研究发现雷公藤甲素对正常人的单核细胞、淋巴细 胞均有抑制作用[8]。我们以往研究发现雷公藤甲素可降低哮喘豚鼠气道反应性 [9]。并用雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘病人30余例，取得了满意效果[10] 。本实验哮喘模型组支气管肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达显著升高，提示其在哮喘发病中起 重要作用。实验结果进一步表明雷公藤甲素能抑制哮喘豚鼠肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达， 可能是雷公藤甲素减轻哮喘气道炎症，降低气道高反应性，缓解临床症状的重要机制。雷公 藤甲素抑制IL-5、GM-CSFmRNA表达的机制尚不清楚。IL-5、GM-CSF可由多种炎性细胞产生， 而活化的T淋巴细胞是其主要的来源，推测雷公藤甲素对表达IL-5、GM-CSFmRNA的抑制作用机理可能通过抑制T淋巴细胞的增殖或直接抑制IL-5、GM-CSF的基因表达起作用 。
, 百拇医药
附表三组豚鼠肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达强度(细胞数/hps) 分组
哮喘组
处理组
对照组
IL-5mRNA
36.38±7.65
17.46±7.32△△
13.82±5.43△△
GM-CSFmRNA
32.78±9.43
18.92±6.38△△
, 百拇医药
18.27±7.45△△
注：△△与哮喘组比较P<0.01参考文献
1.Corrigan CL,Kay AB.CD4T-Lymphocyte activation in acute servere asthma. Am Rev Respir Dis 1990；141：970
2.郑家润，顾克显，徐兰，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成份筛选Ⅲ，7个环 氧二萜化合物物体抗炎免疫活性比较.中国医学科学院报 1991；13：391
3.Walker C,Kaegin MK,Braun P,et al.Activated T cells and eosinophilia i n bronchoalveolar lavages from subjects with asthma correlated with disease sever ity.J Allergy Clin Immunol 1991；88：935
, http://www.100md.com
4.Iwama T,Nagai H,Tsuruoka N,et al.Effect of muline interleukin-5 on bro nchial reactivity in guinea pigs.Clin Exp Allergy 1993；23：32
5.Shi H,Qin S,Huang G.Infiltration of eosinophils into the asthmatic air ways caused by interleukin-5.Am J Respir Cell Mol Biol 1997；16(3)：220
6.Van Qosterhout AIM,ladenius ARC,Savelkou IIF,et al.Effect of anti-IL-5 and IL-5 on airway hypereactivity and eosinophila in guinea pigs.Am Rev Respi r Dis 1993；147：548
, 百拇医药
7.Rand AT,Warringa LK,Paul TMK,et al.Modulation and induc tion of eosinophil chemotaxis by Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating facto r and interleukin-3.Blood 1991；77：2694
8.邵静芳，沈关心，王晓林，等.雷公藤甲素对正常人细胞免疫功能的抑制效应. 同济医科大学学报 1996；25：241
9.王长征，郭先健，王顺朝.致敏豚鼠的气道高反应性机理及药物干预作用.中国病理生理杂志 1997；13：8
10.王长征，郭先健，王顺朝.雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘病人30例. 实用肺科杂志 1998；5：17
[收稿日期：1999-09-16], 百拇医药
单位：郭晓明(中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000)；郭爱云(中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000)；樊丽荣(中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000)；王长征(第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所 四川 重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所 四川 重庆 400037)
关键词：哮喘；动物模型；豚鼠；雷公藤甲素；白介素-5；粒细胞-巨噬细胞集落；刺激因子
中国医师杂志001105 【摘要】 为探讨白介素-5(IL-5)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA在哮喘豚 鼠肺组织中的表达及雷公藤甲素的影响。本组采用原位杂交方法检测3组豚鼠(共30只)肺组 织IL-5、GM-CSFmRNA的表达。结果发现哮喘组肺组织IL-5、GM-CSFmRNA的表达强度分别为(3 6 .38±7.65和32.78±9.43)；处理组分别为(17.46±7.32和18.92±6.38)；对照组 分别为(13.82±5.43和18.27±7.45)。哮喘组IL-5、GM-CSFmRNA表达强度显著高于对照 组和处 理组(P<0.01)。 说明哮喘豚鼠肺组织IL-5、G M-CSFmRNA高表达可能在哮喘气道炎症中发挥重要作用。而雷公藤甲素可能通过抑制IL-5、G M-CSF的分泌而发挥抗哮喘气道炎症的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] 562.2+5 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372(2000)11 -0651-03
Action of Triptolide in the Expressions of IL-5，GM-CSF mRNA in Pulmonary Tissue of Asthmatic Guinea Pig
GUO Xiao-ming,GUO Ai-yun,FAN Li-rong,et al.251st Hospital of PLA Zh angjiakuo,075000,China
【Abstract】 To research the expressions of IL-5,granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF) in the asthmatic guinea pig pulmonary tissue and infl uence of triptolide on the expression,30 guinea pigs were divided at random into three groups:the asthma group(n＝10),treated group(n＝10) and control gr ou p(n＝10).The expression levels of the IL-5,GM-CSF mRNA were detected by usi ng in situ hybridization method.The results showed that the expressive intensit ies of IL-5,GM-CSF mRNA in asthma group were 36.38±7.65 and 32.78±9.43 res pectively;the treated group were 17.46±7.32 and 18.92±6.38 respectively;co ntrol group were 13.82±5.43 and 18.27±7.45 respectively.The expressive int en sities of IL-5,GM-CFS mRNA in asthmatic group were obviously higther than those of both treated and control groups,there was significantly difference between tw o groups(P<0.01). The data suggest that the overexpression of IL-5,CM-CSF in the pulmonary tissu e of asthmatic guinea pig may be play an important role in development of the as thmatic airway inflammation.
, 百拇医药
Key Words Asthma,Animal model;Triptolide;Interleukin-5;Granulocyte-Mac rophage;Colony stimulating factor
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(Eos)、T淋巴细胞等参与的气道慢性炎 症性疾病。哮喘时活化的T淋巴细胞分泌IL-3、IL-5和GM-CSF等增多，从而促进Eos在骨髓中 的 生成增多，以及在气道局部的募集、活化，并延长Eos的存活时间[1]。雷公藤是矛 卫科植物。雷公藤甲素是从雷公藤中提取的三环二萜类雷公藤内酯醇，兼有抗炎及免疫抑制 作用[2]，已广泛应用于自身免疫性疾病，如关节炎、血管炎等，本实验观察了哮 喘组、处理组和对照组三组豚鼠IL-5、GM-CSFmRNA表达。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 IL-5、GM-CSF探针由重庆第三军医大学新桥医院全军呼吸 病研究所赖克方博士合成并惠赠。IL-5探针序列为3’-CACTCGGTGTTCATTA-CAVCCAAGAAACTCT -5’；GM-CSF探针序列为3-CTGACGACCCTCGCTGGT-
, http://www.100md.com
CAGGTCC-5’。
1.2 哮喘豚鼠模型 雄性健康豚鼠400～500g，30只随机分为哮喘组、处理 组和对照组。采用卵白蛋白致敏和激发建立哮喘模型，激发时吸入2%卵白蛋白生理盐水1h或 出现哮喘样发作为止；对照组按哮喘组的方法应用生理盐水代替卵白蛋白处理。
1.3 留取肺组织 分别留取三组豚鼠肺组织，三组豚鼠均在激发48h后留标 本，处理组待豚鼠出现哮喘样发作24h后，给予腹腔注射雷公藤甲素20mg/kg；留取标本 后液氮速冻制成5μm厚冰冻切片，置于-70℃保存备用。
1.4 肺组织IL-5、GM-CSFmRNA原位杂交检测 取肺组织冰冻切片，0.1MPB S漂洗5min，0.3%TritonX-100 20min，蛋白酶K(2ng/ml)37℃，30min，4%多聚甲醛5min，( 1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1MTris-HCL，pH8.0 10min，2×SSC漂洗10min，杂交 液(每片加含有IL-5、GM-CSF探针标记液20μl)，45℃下，20h，4×SSC，37℃下、15min，2 ×SSC，37℃下，30min，依次转入1×SSC、0.5×SSC，37℃下各10min，0.5MPBS漂洗 5min，加Anti-Dig-Ap抗(1∶1000)37℃下，1h，转入4℃下，20h，TSM1、TSM2各10min，NBT /BCIP显色3～4h，0.05MPBS漂洗，终止反应，中性树胶封片。杂交前所需液体及试剂均需D EPC无RNAase处理。
, http://www.100md.com
1.5 统计分析 肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达强度：在高倍视野(×400)下 ，随机选择10个视野计数IL-5、GM-CSFmRNA表达的阳性细胞数，单位面积内的表达强度用10 个高倍视野下IL-5mRNA或GM-CSFmRNA阳性细胞数的平均值表示(细胞数/hps)。资料采用非配 对资料t检验，P<0.05差异显著。
2 结果
2.1 结果判定 IL-5、GM-CSFmRNA阳性信号为紫兰色或棕兰色颗粒，主要 集中在胞核区及核周边区域。
2.2 豚鼠肺组织IL-5mRNA、GM-CSFmRNA表达强度 哮喘组IL-5、GM-CSFmRN A 单位面积内的阳性细胞数显著高于处理组和对照组(P<0.01)，而处理组与对照组比较 无显著差异(P>0.05)。
3 讨论
, http://www.100md.com
目前认为支气管哮喘是因为变态反应所致的慢性 气道炎症性疾病，主要由Eos、T淋巴细胞及单核细胞等参与，其中T淋巴细胞受到抗 原刺激后被激活，可产 生多种细胞因子，如IL-5、GM-CSF等，其中IL-5特异性地作用于Eos生成与分化的各个阶段 。Eos在肺组织内浸润与活化引起气道炎症和气道高反应性的过程受IL-5调控[3]。 IL-5、GM-CSF本身不能损伤气道上皮，但可通过促进Eos的产生、活化及介质释放等作用在 哮喘的气道炎症中发挥重要作用。给豚鼠模型的气管内滴入IL-5可诱导Eos增多及产生气道 高反应性[4]。而抗IL-5抗体可抑制这些作用[5，6]。IL-5、GM-CSF可延 长Eos的存活时间，使正常密度Eos转化为低密度表型，增加Eos对趋化因子的反应[7] 。雷公藤为具有免疫抑制作用的中药，主要成份是雷公藤内酯醇又称雷公藤甲素，以往主 要用于治疗类风湿、血管炎等。邵静芳等研究发现雷公藤甲素对正常人的单核细胞、淋巴细 胞均有抑制作用[8]。我们以往研究发现雷公藤甲素可降低哮喘豚鼠气道反应性 [9]。并用雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘病人30余例，取得了满意效果[10] 。本实验哮喘模型组支气管肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达显著升高，提示其在哮喘发病中起 重要作用。实验结果进一步表明雷公藤甲素能抑制哮喘豚鼠肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达， 可能是雷公藤甲素减轻哮喘气道炎症，降低气道高反应性，缓解临床症状的重要机制。雷公 藤甲素抑制IL-5、GM-CSFmRNA表达的机制尚不清楚。IL-5、GM-CSF可由多种炎性细胞产生， 而活化的T淋巴细胞是其主要的来源，推测雷公藤甲素对表达IL-5、GM-CSFmRNA的抑制作用机理可能通过抑制T淋巴细胞的增殖或直接抑制IL-5、GM-CSF的基因表达起作用 。
, 百拇医药
附表三组豚鼠肺组织IL-5、GM-CSFmRNA表达强度(细胞数/hps) 分组
哮喘组
处理组
对照组
IL-5mRNA
36.38±7.65
17.46±7.32△△
13.82±5.43△△
GM-CSFmRNA
32.78±9.43
18.92±6.38△△
, 百拇医药
18.27±7.45△△
注：△△与哮喘组比较P<0.01参考文献
1.Corrigan CL,Kay AB.CD4T-Lymphocyte activation in acute servere asthma. Am Rev Respir Dis 1990；141：970
2.郑家润，顾克显，徐兰，等.雷公藤抗炎免疫及抗生育活性成份筛选Ⅲ，7个环 氧二萜化合物物体抗炎免疫活性比较.中国医学科学院报 1991；13：391
3.Walker C,Kaegin MK,Braun P,et al.Activated T cells and eosinophilia i n bronchoalveolar lavages from subjects with asthma correlated with disease sever ity.J Allergy Clin Immunol 1991；88：935
, http://www.100md.com
4.Iwama T,Nagai H,Tsuruoka N,et al.Effect of muline interleukin-5 on bro nchial reactivity in guinea pigs.Clin Exp Allergy 1993；23：32
5.Shi H,Qin S,Huang G.Infiltration of eosinophils into the asthmatic air ways caused by interleukin-5.Am J Respir Cell Mol Biol 1997；16(3)：220
6.Van Qosterhout AIM,ladenius ARC,Savelkou IIF,et al.Effect of anti-IL-5 and IL-5 on airway hypereactivity and eosinophila in guinea pigs.Am Rev Respi r Dis 1993；147：548
, 百拇医药
7.Rand AT,Warringa LK,Paul TMK,et al.Modulation and induc tion of eosinophil chemotaxis by Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating facto r and interleukin-3.Blood 1991；77：2694
8.邵静芳，沈关心，王晓林，等.雷公藤甲素对正常人细胞免疫功能的抑制效应. 同济医科大学学报 1996；25：241
9.王长征，郭先健，王顺朝.致敏豚鼠的气道高反应性机理及药物干预作用.中国病理生理杂志 1997；13：8
10.王长征，郭先健，王顺朝.雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘病人30例. 实用肺科杂志 1998；5：17
[收稿日期：1999-09-16], 百拇医药