药用植物莪术的组织培养快速繁殖与植株再生的研究
作者：李春斌 方宏筠 王关林
单位：李春斌 方宏筠(辽宁省植物生物工程重点实验室 大连 116029)；王关林(辽宁师范大学生物工程研究所)
关键词：莪术；组织培养；快速繁殖；愈伤组织；再生
中草药001128
摘 要 通过茎尖培养实现了中药莪术试管苗的快速繁殖并从试管苗基 部诱导出了愈伤组织。实验表明：以MS培养基为基本培养基，附加ZT 4.0 mg/L+IAA 0.5 ～1.0 mg/L适于丛生芽的诱导与增殖；附加2，4-D 1.0 mg/L + KT 4.0～6.0 m g/L 适于愈伤组织的诱导；附加 2，4-D 1.0～2.0 mg/L + KT 0.2～0.5 mg/L 适于愈 伤组织的继代培养；附加 KT 4.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L 适于愈伤组织的分化。
, 百拇医药
Studies on Plantlet Regeneration and Propagation of Cur cuma zedoaria
Li Chunbin
(Plant-Biology Engineering Key Laboratory of Liaoning Province Dalia n 116029) Fang Hongjun and Wa ng Guanlin
(Biology Engineering Institute of Liaoning Normal University)
Abstract Aseptic seedling of the traditional Chinese medicin a l plant, Curcuma zedoaria (Christm.) Rosc. was successfully pr op agated by means of shoot culture, and calli were induced from the base of asepti c seedling. MS medium with 4.0 mg/L ZT and 0.5 ～ 1.0 mg/L IAA was suitable for t he induction and proliferation of fascicular gemma. MS medium with 1.0 mg/L 2, 4 - D and 4.0 ～ 6.0 mg/L KT was suitable for the induction of cal li . MS medium with 1.0 ～ 2.0 mg/L 2, 4 - D and 0.2 ～ 0.5 mg/ L KT was suitable for the subculture of calli. MS medium with 4.0 mg/L KT and 0.2 mg/L NAA was suitable for the differentiation of calli.
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Key words Curcuma zedoaria (Christm) Rosc. tissue c ulture rapid propagation callus regeneration
莪术 Curcuma zedoaria (Christm) Rosc. 为姜科姜黄属多年 生 草本植物[1]。中药莪术已具有上千年的历史，在医学上应用非常广泛。唐《药性 论》及李时珍《本草纲目》均有记载，莪术具有行气破血、消食化积之功效，被称为血中之 气药。应用莪术治疗肿瘤是我国医药工作者首先报道的[2]。
莪术的药用部位主要是根茎和块根，主要含挥发油类和姜黄素类成分，此外还有树脂类和糖 类等[3]。在栽培生产上以根茎进行营养繁殖，耗种量大，且病毒化严重，品质下 降。为了解决莪术生产上存在的问题，我们采用生物技术手段复壮莪术优良新品种，并为莪 术优良品种的快速繁殖打下基础。莪术的组织培养工作国内外尚未见报道。
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1 材料和方法
1.1 材料：植物材料取自大连市药物科学研究所，由该所刘玉兴研究员鉴定。外植体为莪 术根茎上的芽长成的试管苗。
1.2 方法
1.2.1 无菌外植体的获得：洗净莪术根茎，将莪术根茎上大约 0.5 cm 的芽切下，于 7 5% 乙醇中浸泡 45 s，再于 0.1% 升汞中消毒 8 min，无菌水冲洗 5 次，然后接种于 M S + BA 0.5 mg/L + IAA 0.1 mg/L 的培养基中培养。培养条件为 MS 培养基附加 0.5% 琼脂，pH 5.8；培养温度 (25±2) ℃；光照 10～12 h/d，光强 2 000 lx，蔗糖浓度为 3 0 g/L。
1.2.2 丛生芽的诱导与增殖：剪取莪术试管苗基部约 1 cm 长接种于附加不同激素配比 的 MS 培养基中，筛选出适于丛生芽诱导与增殖的培养基。
, 百拇医药
1.2.3 愈伤组织的诱导、继代与分化：选取较幼嫩的莪术试管苗的不同部位接入附加不 同激素配比的愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导。将诱导出的愈伤组织于愈伤组 织继代培养基上每 25～30 d 继代一次。选取继代了 2～3 次生长旺盛、质地致密、表面有 细颗粒状结构、颜色鲜黄的愈伤组织转入愈伤组织分化培养基中进行愈伤组织的分化培养。
1.2.4 芽的伸长与生根培养：将在愈伤组织分化培养基中生长健壮的再生芽及在芽增殖 培养基中生长了约一个月的丛生芽分成 3～4 个为一小簇转入到芽伸长培养基中进行芽的伸 长培 养。将在芽伸长培养基中生长了约一个月的芽再转入到芽生根培养基中进行生根培养。
1.2.5 试管苗的移栽：将在生根培养基中生长了约一个月的生长健壮的试管苗在移栽前 3～5 d 将瓶口打开，注入少量清水淹没培养基表面，于室内自然光下散射。移栽时将试管 苗从瓶中取出，用清水将根表面的培养基冲净，然后移入经多次冲洗的较粗河沙中，于温室 内培养。
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2 结果与分析
2.1 激素对丛生芽诱导与增殖的影响：细胞分裂素和生长素是芽诱导与增殖过程中最关键 的因子，本实验研究了多种细胞分裂素和生长素的不同浓度的配比组合，其中以 ZT 和 IAA 的组合最佳。ZT 与 IAA 对芽诱导与增殖的影响见表1。
表1 ZT 与 IAA 对莪术试管苗丛生芽诱导与增殖的影 响 ZT
(mg/L)
IAA
(mg/L)
产生芽时间
(d)
增殖倍数
, 百拇医药
芽生长状况
3.0
0.5
11～13
3.2
3.0
1.0
11～13
2.8
芽健壮、饱满，4.0
0.5
7～8
4.8
, 百拇医药
生长迅速。
4.0
1.0
7～8
4.5
5.0
0.5
9～10
3.3
芽弱小，生长
5.0
1.0
9～10
, 百拇医药
2.9
缓慢。
由表1可见 ZT 4.0 mg/L + IAA 0.5～1.0 mg/L 最适于丛生芽的诱导与增殖(图1)，ZT 浓 度超过 4.0 时对芽的分化与增殖又产生了抑制作用。
图1 茎尖诱导出的丛生芽
2.2 影响莪术外植体愈伤组织诱导、继代和分化的因素
2.2.1 生长素对愈伤组织诱导、继代和分化的影响：以 MS 培养基为基本培养基分别附 加不同浓度的 IAA、NAA、2，4-D 对莪术试管苗基部进行愈伤组织的诱导，培养一个月后 观察，结果见表2。
表2 生长素对愈伤组织诱导的影响 IAA
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(mg/L)
NAA
(mg/L)
2，4-D
(mg/L)
产生愈伤组织
时间(d)
诱导率
(%)
0.5
0.0
0.0
1.0
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0.0
0.0
无愈伤组织产生
无愈伤组织产生
0.0
0.5
0.0
0.0
1.0
0.0
0.0
0.0
0.5
, 百拇医药
27～28
82～84
0.0
0.0
1.0
24～25
95～96
由表2可见，2，4-D 对莪术试管苗有很强的诱导愈伤组织的作用，而 IAA 和 NAA 不能诱 导出愈伤组织。
但进一步的试验发现 2，4-D 对愈伤组织的分化有很强的抑制作用。选取继代了 2～3 次 状态基本相同的愈伤组织分别转入含有 2，4-D 0.5 mg/L 和不含 2，4-D 的愈伤组织分 化培养基中，一个月后观察，结果发现不含 2，4-D 的愈伤组织分化培养基中出现了大量 的绿芽，而含有 2，4-D 的培养基中则没有绿芽的产生。
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2.2.2 KT对愈伤组织诱导、继代和分化的影响：实验中发现单独使用 2，4-D 即可诱导 出愈伤组织，但诱导出的愈伤组织生长缓慢且不能分化。因此本实验在诱导愈伤组织过程中 除了使用 2，4-D 外，还附加了不同浓度的 KT。结果发现高浓度的 KT 有利于状态良好的 愈伤组织的产生。在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 4.0～6.0 mg/L的培养基中诱导产生的愈伤 组 织在继代培养中生长旺盛，而且易于分化。虽然高浓度的KT利于诱导产生状态良好的愈伤组 织 ，但在继代培养中却应降低KT的浓度，否则很难保证愈伤组织的稳定性。以 MS + 2，4 -D 1.0 ～ 2.0 mg/L + KT 0.2 ～ 0.5 mg/L 进行 愈伤组织的继代培养较为适宜(图2)。KT 对愈伤组织的分化也有很大的影响，结果见表3。
图2 从外植体诱导出愈伤组织
由表3可见 KT 4.0 ～ 6.0 mg/L 愈伤组织都能分化出较多的芽(图3)，但 KT 4.0 mg/L 既有利
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表3 KT 对愈伤组织分化的影响 KT
(mg/L)
产生芽
时间(d)
诱导率
(%)
再生芽数目
(个/块)
再生芽生 长状态
0.5
-
-
-
, 百拇医药
-
2.0
25～27
82
4～5
芽生长状态良好，易成苗
4.0
19～21
96
10～12
芽生长状态良好，易成苗
6.0
19～21
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96
12～14
芽生长较弱，不易成苗
于愈伤组织的分化，又有利于再生芽的成苗(成苗率 70% 以上)。当采用 MS + KT 4 .0 mg/L + NAA 0.2 mg/L 培养基进行愈伤组织的分化培养时，再生芽成苗率可较 MS + K T 4.0 mg/L培养基提高 10% 以上(成苗率 82% ～ 84%)，而且每块愈伤组织也可多分化出 2～ 3 个芽。
图3 愈伤组织开始分化出芽
2.2.3 外植体部位对愈伤组织诱导、继代和分化的影响：实验中发现外植体部位对愈伤 组织诱导具有极其重要的影响。本实验只是从莪术试管苗基部诱导出了可以继代和分化的愈 伤组织。对莪术叶片进行了上百次试验，但未能诱导出愈伤组织及实现分化。从叶鞘部位偶 而诱导出了愈伤组织，但产生的全是白色小颗粒状的愈伤组织，很难进行继代培养，不能实 现分化。对根部诱导出了愈伤组织但只是局限于根尖部位，在继代培养中生长缓慢，未能实 现分化。因此，本实验采用莪术试管苗基部进行愈伤组织的诱导，莪术愈伤组织诱导培养基为 MS + 2，4-D 1.0 mg/L + KT 4.0～6.0 mg/L；愈伤组织继代培养基为 MS + 2，4 - D 1 .0 ～2.0 mg/L + KT 0.2～0.5 mg/L；愈伤组织分化培养基为 MS + KT 4.0 mg + NAA 0.2 mg/ L。
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2.3 影响莪术试管苗成活率的主要因素
2.3.1 GA对再生芽伸长的影响：在莪术再生芽的伸长培养中，不需要高浓度的细胞分裂 素和生长素，附加一定浓度的 GA 时对莪术再生芽的伸长有明显的促进作用。在 MS + KT 0 .5 mg/L + IAA 0.2 mg/L 的培养基中附加 GA 0.1 mg/L时，30 d 后即可较未加 GA 的 对照组 芽高 1 倍左右，但附加 GA 0.1 mg/L 的芽明显较对照组的芽细弱。实验中采用 MS + KT 0.5 mg/L + IAA 0.2 mg/L + GA 0.02 mg/L 进行再生芽的伸长培养，取得了良好的效果 ，既能保证再生芽的快速生长，又能保证其健壮而不弱小(图4)。
图4 再生芽伸长培养
2.3.2 IAA 对试管苗生根的影响：实验中发现 IAA 即能使试管苗正常生长，又能诱导出 良好的根系。在试管苗生根培养过程中还发现在 IAA 浓度相同的条件下，使用 1/2 MS 培 养基更有利于根的形成，可较 MS 全量培养基提前 5～6 d 多生出 1～2 条根。本实验采用 1 /2 MS + KT 0.5 mg/L + IAA 1.0 mg/L + 蔗糖 15 g/L 的培养基作为莪术试管苗的生根 培 养基，并取得了良好的效果，一周左右即可出 4～5 条根，生根率可达 98%，并获得了生长 极健壮的试管苗。
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2.3.3 温度、光照和水分对试管苗移栽的影响：莪术试管苗在生根培养基中生长一个月 后便可以进行移栽。由于莪术是热带植物，所以移栽后要保证适宜的温度、光照和水分，莪 术试管苗移栽时温度不能低于 22 ℃，也不宜过高，否则易引起试管苗徒长。移栽初期试管 苗不能接受阳光的直射，最好是散射光或遮阴。莪术试管苗移栽后对缺水十分敏感，每 2～3 d 就应浇透一次水，相对湿度应保持在 85% 以上。
试管苗移栽 8～10 d 以后可适当提高光照强度和温度，再经过约 2 周的培养，移栽的试管 苗便已长出了 1 片新叶，并生出大量的须根，当户外温度稳定在 20 ℃ 以上时便可移栽入 大田。
3 讨论
3.1 细胞分裂素和生长素之间的比例关系对莪术组织培养的影响：在莪术丛生芽的诱导、 增殖和愈伤组织的分化过程中，高浓度的细胞分裂素是必需的，而且同时应配合一定低浓度 的生长素。不含生长素或生长素浓度过低时产生的芽生长势弱、数目也少；崔徵[4] 1952 年指出细胞分裂素类物质腺嘌呤与生长素 IAA 之间的比例关系非常主要，可以有效 地控制植物组织培养中芽和根的发生，这一比例高时有利于芽的分化，比例低时有利于根的 分化。本实验结果与上述观点相符。
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在莪术愈伤组织的诱导过程中也使用了高浓度的细胞分裂素 KT 4.0～6.0 mg/L 并配合 2 ， 4-D 1.0 mg/L 进行愈伤组织的诱导。虽然细胞分裂素对莪术愈伤组织的诱导不是必需的 ， 但是配合高浓度的细胞分裂素却有利于莪术产生高质量的易于继代和分化的愈伤组织。这可 能是由于莪术试管苗具有较高的内源生长素的原因。同时也提示我们，如果一种植物在愈伤 组织的诱导过程中细胞分裂素对其愈伤组织的诱导没有抑制作用，那么我们可以试着采用高 浓度的细胞分裂素配合生长素来进行愈伤组织的诱导，这样获得的愈伤组织很可能容易进行 高频的分化和再生。
3.2 细胞分化程度与莪术脱分化的关系：在莪术组织培养的快速繁殖和愈伤组织诱导过程 中，发现正确的选择外植体的部位极其重要。莪术试管苗丛生芽的诱导、增殖和愈伤组织的 诱导都是在相同的部位产生的，都是在试管苗基部茎尖生长点处。是因为该处分生细胞较多 ，细胞比较幼嫩、分化程度低的原因。本实验曾试图从莪术叶片、叶鞘等其它部位诱导产生 不定芽和愈伤组织，但未能成功。在愈伤组织诱导过程中曾将外植体以竖放、横放和倒放的 方式接入愈伤组织诱导培养基中培养，结果竖放的外植体周围距培养基 1 cm 范围内都能产 生大量的愈伤组织；而横放的愈伤组织只是在靠近基部约0.5 cm 的范围内产生了一些愈伤 组织；倒放的外植体只是在上端(原形态学下端，试管苗基部)产生了少量的愈伤组织，而接 触培养基的部位却未能产生出愈伤组织，这证明了细胞的分化程度对莪术试管苗的脱分化有 极其重要的影响。应该选择细胞分化程度低的部位进行莪术的脱分化研究。
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在莪术愈伤组织的诱导中从根尖部位也诱导出了愈伤组织，根尖部位也是分生细胞和幼嫩细 胞较多、细胞分化程度较低的部位。但该部位诱导出的愈伤组织却不能进行分化，可见即使 都是分化程度较低的细胞，但因部位的不同，它们的生理特性也不相同。
Address： Li Chunbin, Plant-Biology Engineering Key Laboratory of Liaoni ng Province, Dalian
辽宁省教委资助的科研攻关项目
大连理工大学化工学院九七级博士研究生
参 考 文 献
1，全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编.上册.北京：人民卫生出版社，1979 ：685
2，旅大市妇产医院肿瘤防治小组.中草药，1972，2：15
3，肖小河，苏中武，乔传卓，等.中草药，1997，2：114
4，崔 徵.植物学报，1952，2：152
(1999-12-14收稿), 百拇医药
单位：李春斌 方宏筠(辽宁省植物生物工程重点实验室 大连 116029)；王关林(辽宁师范大学生物工程研究所)
关键词：莪术；组织培养；快速繁殖；愈伤组织；再生
中草药001128
摘 要 通过茎尖培养实现了中药莪术试管苗的快速繁殖并从试管苗基 部诱导出了愈伤组织。实验表明：以MS培养基为基本培养基，附加ZT 4.0 mg/L+IAA 0.5 ～1.0 mg/L适于丛生芽的诱导与增殖；附加2，4-D 1.0 mg/L + KT 4.0～6.0 m g/L 适于愈伤组织的诱导；附加 2，4-D 1.0～2.0 mg/L + KT 0.2～0.5 mg/L 适于愈 伤组织的继代培养；附加 KT 4.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L 适于愈伤组织的分化。
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Studies on Plantlet Regeneration and Propagation of Cur cuma zedoaria
Li Chunbin
(Plant-Biology Engineering Key Laboratory of Liaoning Province Dalia n 116029) Fang Hongjun and Wa ng Guanlin
(Biology Engineering Institute of Liaoning Normal University)
Abstract Aseptic seedling of the traditional Chinese medicin a l plant, Curcuma zedoaria (Christm.) Rosc. was successfully pr op agated by means of shoot culture, and calli were induced from the base of asepti c seedling. MS medium with 4.0 mg/L ZT and 0.5 ～ 1.0 mg/L IAA was suitable for t he induction and proliferation of fascicular gemma. MS medium with 1.0 mg/L 2, 4 - D and 4.0 ～ 6.0 mg/L KT was suitable for the induction of cal li . MS medium with 1.0 ～ 2.0 mg/L 2, 4 - D and 0.2 ～ 0.5 mg/ L KT was suitable for the subculture of calli. MS medium with 4.0 mg/L KT and 0.2 mg/L NAA was suitable for the differentiation of calli.
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Key words Curcuma zedoaria (Christm) Rosc. tissue c ulture rapid propagation callus regeneration
莪术 Curcuma zedoaria (Christm) Rosc. 为姜科姜黄属多年 生 草本植物[1]。中药莪术已具有上千年的历史，在医学上应用非常广泛。唐《药性 论》及李时珍《本草纲目》均有记载，莪术具有行气破血、消食化积之功效，被称为血中之 气药。应用莪术治疗肿瘤是我国医药工作者首先报道的[2]。
莪术的药用部位主要是根茎和块根，主要含挥发油类和姜黄素类成分，此外还有树脂类和糖 类等[3]。在栽培生产上以根茎进行营养繁殖，耗种量大，且病毒化严重，品质下 降。为了解决莪术生产上存在的问题，我们采用生物技术手段复壮莪术优良新品种，并为莪 术优良品种的快速繁殖打下基础。莪术的组织培养工作国内外尚未见报道。
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1 材料和方法
1.1 材料：植物材料取自大连市药物科学研究所，由该所刘玉兴研究员鉴定。外植体为莪 术根茎上的芽长成的试管苗。
1.2 方法
1.2.1 无菌外植体的获得：洗净莪术根茎，将莪术根茎上大约 0.5 cm 的芽切下，于 7 5% 乙醇中浸泡 45 s，再于 0.1% 升汞中消毒 8 min，无菌水冲洗 5 次，然后接种于 M S + BA 0.5 mg/L + IAA 0.1 mg/L 的培养基中培养。培养条件为 MS 培养基附加 0.5% 琼脂，pH 5.8；培养温度 (25±2) ℃；光照 10～12 h/d，光强 2 000 lx，蔗糖浓度为 3 0 g/L。
1.2.2 丛生芽的诱导与增殖：剪取莪术试管苗基部约 1 cm 长接种于附加不同激素配比 的 MS 培养基中，筛选出适于丛生芽诱导与增殖的培养基。
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1.2.3 愈伤组织的诱导、继代与分化：选取较幼嫩的莪术试管苗的不同部位接入附加不 同激素配比的愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导。将诱导出的愈伤组织于愈伤组 织继代培养基上每 25～30 d 继代一次。选取继代了 2～3 次生长旺盛、质地致密、表面有 细颗粒状结构、颜色鲜黄的愈伤组织转入愈伤组织分化培养基中进行愈伤组织的分化培养。
1.2.4 芽的伸长与生根培养：将在愈伤组织分化培养基中生长健壮的再生芽及在芽增殖 培养基中生长了约一个月的丛生芽分成 3～4 个为一小簇转入到芽伸长培养基中进行芽的伸 长培 养。将在芽伸长培养基中生长了约一个月的芽再转入到芽生根培养基中进行生根培养。
1.2.5 试管苗的移栽：将在生根培养基中生长了约一个月的生长健壮的试管苗在移栽前 3～5 d 将瓶口打开，注入少量清水淹没培养基表面，于室内自然光下散射。移栽时将试管 苗从瓶中取出，用清水将根表面的培养基冲净，然后移入经多次冲洗的较粗河沙中，于温室 内培养。
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2 结果与分析
2.1 激素对丛生芽诱导与增殖的影响：细胞分裂素和生长素是芽诱导与增殖过程中最关键 的因子，本实验研究了多种细胞分裂素和生长素的不同浓度的配比组合，其中以 ZT 和 IAA 的组合最佳。ZT 与 IAA 对芽诱导与增殖的影响见表1。
表1 ZT 与 IAA 对莪术试管苗丛生芽诱导与增殖的影 响 ZT
(mg/L)
IAA
(mg/L)
产生芽时间
(d)
增殖倍数
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芽生长状况
3.0
0.5
11～13
3.2
3.0
1.0
11～13
2.8
芽健壮、饱满，4.0
0.5
7～8
4.8
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生长迅速。
4.0
1.0
7～8
4.5
5.0
0.5
9～10
3.3
芽弱小，生长
5.0
1.0
9～10
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2.9
缓慢。
由表1可见 ZT 4.0 mg/L + IAA 0.5～1.0 mg/L 最适于丛生芽的诱导与增殖(图1)，ZT 浓 度超过 4.0 时对芽的分化与增殖又产生了抑制作用。
图1 茎尖诱导出的丛生芽
2.2 影响莪术外植体愈伤组织诱导、继代和分化的因素
2.2.1 生长素对愈伤组织诱导、继代和分化的影响：以 MS 培养基为基本培养基分别附 加不同浓度的 IAA、NAA、2，4-D 对莪术试管苗基部进行愈伤组织的诱导，培养一个月后 观察，结果见表2。
表2 生长素对愈伤组织诱导的影响 IAA
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(mg/L)
NAA
(mg/L)
2，4-D
(mg/L)
产生愈伤组织
时间(d)
诱导率
(%)
0.5
0.0
0.0
1.0
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0.0
0.0
无愈伤组织产生
无愈伤组织产生
0.0
0.5
0.0
0.0
1.0
0.0
0.0
0.0
0.5
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27～28
82～84
0.0
0.0
1.0
24～25
95～96
由表2可见，2，4-D 对莪术试管苗有很强的诱导愈伤组织的作用，而 IAA 和 NAA 不能诱 导出愈伤组织。
但进一步的试验发现 2，4-D 对愈伤组织的分化有很强的抑制作用。选取继代了 2～3 次 状态基本相同的愈伤组织分别转入含有 2，4-D 0.5 mg/L 和不含 2，4-D 的愈伤组织分 化培养基中，一个月后观察，结果发现不含 2，4-D 的愈伤组织分化培养基中出现了大量 的绿芽，而含有 2，4-D 的培养基中则没有绿芽的产生。
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2.2.2 KT对愈伤组织诱导、继代和分化的影响：实验中发现单独使用 2，4-D 即可诱导 出愈伤组织，但诱导出的愈伤组织生长缓慢且不能分化。因此本实验在诱导愈伤组织过程中 除了使用 2，4-D 外，还附加了不同浓度的 KT。结果发现高浓度的 KT 有利于状态良好的 愈伤组织的产生。在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 4.0～6.0 mg/L的培养基中诱导产生的愈伤 组 织在继代培养中生长旺盛，而且易于分化。虽然高浓度的KT利于诱导产生状态良好的愈伤组 织 ，但在继代培养中却应降低KT的浓度，否则很难保证愈伤组织的稳定性。以 MS + 2，4 -D 1.0 ～ 2.0 mg/L + KT 0.2 ～ 0.5 mg/L 进行 愈伤组织的继代培养较为适宜(图2)。KT 对愈伤组织的分化也有很大的影响，结果见表3。
图2 从外植体诱导出愈伤组织
由表3可见 KT 4.0 ～ 6.0 mg/L 愈伤组织都能分化出较多的芽(图3)，但 KT 4.0 mg/L 既有利
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表3 KT 对愈伤组织分化的影响 KT
(mg/L)
产生芽
时间(d)
诱导率
(%)
再生芽数目
(个/块)
再生芽生 长状态
0.5
-
-
-
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-
2.0
25～27
82
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芽生长状态良好，易成苗
4.0
19～21
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10～12
芽生长状态良好，易成苗
6.0
19～21
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12～14
芽生长较弱，不易成苗
于愈伤组织的分化，又有利于再生芽的成苗(成苗率 70% 以上)。当采用 MS + KT 4 .0 mg/L + NAA 0.2 mg/L 培养基进行愈伤组织的分化培养时，再生芽成苗率可较 MS + K T 4.0 mg/L培养基提高 10% 以上(成苗率 82% ～ 84%)，而且每块愈伤组织也可多分化出 2～ 3 个芽。
图3 愈伤组织开始分化出芽
2.2.3 外植体部位对愈伤组织诱导、继代和分化的影响：实验中发现外植体部位对愈伤 组织诱导具有极其重要的影响。本实验只是从莪术试管苗基部诱导出了可以继代和分化的愈 伤组织。对莪术叶片进行了上百次试验，但未能诱导出愈伤组织及实现分化。从叶鞘部位偶 而诱导出了愈伤组织，但产生的全是白色小颗粒状的愈伤组织，很难进行继代培养，不能实 现分化。对根部诱导出了愈伤组织但只是局限于根尖部位，在继代培养中生长缓慢，未能实 现分化。因此，本实验采用莪术试管苗基部进行愈伤组织的诱导，莪术愈伤组织诱导培养基为 MS + 2，4-D 1.0 mg/L + KT 4.0～6.0 mg/L；愈伤组织继代培养基为 MS + 2，4 - D 1 .0 ～2.0 mg/L + KT 0.2～0.5 mg/L；愈伤组织分化培养基为 MS + KT 4.0 mg + NAA 0.2 mg/ L。
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2.3 影响莪术试管苗成活率的主要因素
2.3.1 GA对再生芽伸长的影响：在莪术再生芽的伸长培养中，不需要高浓度的细胞分裂 素和生长素，附加一定浓度的 GA 时对莪术再生芽的伸长有明显的促进作用。在 MS + KT 0 .5 mg/L + IAA 0.2 mg/L 的培养基中附加 GA 0.1 mg/L时，30 d 后即可较未加 GA 的 对照组 芽高 1 倍左右，但附加 GA 0.1 mg/L 的芽明显较对照组的芽细弱。实验中采用 MS + KT 0.5 mg/L + IAA 0.2 mg/L + GA 0.02 mg/L 进行再生芽的伸长培养，取得了良好的效果 ，既能保证再生芽的快速生长，又能保证其健壮而不弱小(图4)。
图4 再生芽伸长培养
2.3.2 IAA 对试管苗生根的影响：实验中发现 IAA 即能使试管苗正常生长，又能诱导出 良好的根系。在试管苗生根培养过程中还发现在 IAA 浓度相同的条件下，使用 1/2 MS 培 养基更有利于根的形成，可较 MS 全量培养基提前 5～6 d 多生出 1～2 条根。本实验采用 1 /2 MS + KT 0.5 mg/L + IAA 1.0 mg/L + 蔗糖 15 g/L 的培养基作为莪术试管苗的生根 培 养基，并取得了良好的效果，一周左右即可出 4～5 条根，生根率可达 98%，并获得了生长 极健壮的试管苗。
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2.3.3 温度、光照和水分对试管苗移栽的影响：莪术试管苗在生根培养基中生长一个月 后便可以进行移栽。由于莪术是热带植物，所以移栽后要保证适宜的温度、光照和水分，莪 术试管苗移栽时温度不能低于 22 ℃，也不宜过高，否则易引起试管苗徒长。移栽初期试管 苗不能接受阳光的直射，最好是散射光或遮阴。莪术试管苗移栽后对缺水十分敏感，每 2～3 d 就应浇透一次水，相对湿度应保持在 85% 以上。
试管苗移栽 8～10 d 以后可适当提高光照强度和温度，再经过约 2 周的培养，移栽的试管 苗便已长出了 1 片新叶，并生出大量的须根，当户外温度稳定在 20 ℃ 以上时便可移栽入 大田。
3 讨论
3.1 细胞分裂素和生长素之间的比例关系对莪术组织培养的影响：在莪术丛生芽的诱导、 增殖和愈伤组织的分化过程中，高浓度的细胞分裂素是必需的，而且同时应配合一定低浓度 的生长素。不含生长素或生长素浓度过低时产生的芽生长势弱、数目也少；崔徵[4] 1952 年指出细胞分裂素类物质腺嘌呤与生长素 IAA 之间的比例关系非常主要，可以有效 地控制植物组织培养中芽和根的发生，这一比例高时有利于芽的分化，比例低时有利于根的 分化。本实验结果与上述观点相符。
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在莪术愈伤组织的诱导过程中也使用了高浓度的细胞分裂素 KT 4.0～6.0 mg/L 并配合 2 ， 4-D 1.0 mg/L 进行愈伤组织的诱导。虽然细胞分裂素对莪术愈伤组织的诱导不是必需的 ， 但是配合高浓度的细胞分裂素却有利于莪术产生高质量的易于继代和分化的愈伤组织。这可 能是由于莪术试管苗具有较高的内源生长素的原因。同时也提示我们，如果一种植物在愈伤 组织的诱导过程中细胞分裂素对其愈伤组织的诱导没有抑制作用，那么我们可以试着采用高 浓度的细胞分裂素配合生长素来进行愈伤组织的诱导，这样获得的愈伤组织很可能容易进行 高频的分化和再生。
3.2 细胞分化程度与莪术脱分化的关系：在莪术组织培养的快速繁殖和愈伤组织诱导过程 中，发现正确的选择外植体的部位极其重要。莪术试管苗丛生芽的诱导、增殖和愈伤组织的 诱导都是在相同的部位产生的，都是在试管苗基部茎尖生长点处。是因为该处分生细胞较多 ，细胞比较幼嫩、分化程度低的原因。本实验曾试图从莪术叶片、叶鞘等其它部位诱导产生 不定芽和愈伤组织，但未能成功。在愈伤组织诱导过程中曾将外植体以竖放、横放和倒放的 方式接入愈伤组织诱导培养基中培养，结果竖放的外植体周围距培养基 1 cm 范围内都能产 生大量的愈伤组织；而横放的愈伤组织只是在靠近基部约0.5 cm 的范围内产生了一些愈伤 组织；倒放的外植体只是在上端(原形态学下端，试管苗基部)产生了少量的愈伤组织，而接 触培养基的部位却未能产生出愈伤组织，这证明了细胞的分化程度对莪术试管苗的脱分化有 极其重要的影响。应该选择细胞分化程度低的部位进行莪术的脱分化研究。
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在莪术愈伤组织的诱导中从根尖部位也诱导出了愈伤组织，根尖部位也是分生细胞和幼嫩细 胞较多、细胞分化程度较低的部位。但该部位诱导出的愈伤组织却不能进行分化，可见即使 都是分化程度较低的细胞，但因部位的不同，它们的生理特性也不相同。
Address： Li Chunbin, Plant-Biology Engineering Key Laboratory of Liaoni ng Province, Dalian
辽宁省教委资助的科研攻关项目
大连理工大学化工学院九七级博士研究生
参 考 文 献
1，全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编.上册.北京：人民卫生出版社，1979 ：685
2，旅大市妇产医院肿瘤防治小组.中草药，1972，2：15
3，肖小河，苏中武，乔传卓，等.中草药，1997，2：114
4，崔 徵.植物学报，1952，2：152
(1999-12-14收稿), 百拇医药