重组人生长激素对卵巢切除大鼠松质骨的影响
作者：黄遂柱 戴尅戎 姜立本 汤亭亭
单位：黄遂柱(河南省人民医院骨科)；戴尅戎 汤亭亭(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科 200011)；姜立本(上海医科大学附属中山医院康复医学研究所)
关键词：促生长素类；重组；骨质疏松；绝经后；骨密度；组织学；动物实验替代试验；大鼠,Sprague-Dawley
中华骨科杂志001112
【摘要】目的 研究重组人生长激素对卵巢切除后已发生明显骨丢失大鼠松质骨的影响。方法 6月龄SD雌性大鼠卵巢切除3个月后开始接受低、中、高三种剂量重组人生长激素皮下注射8周，采用骨密度测定、骨组织形态计量学等手段研究大鼠腰椎松质骨的改变。结果 重组人生长激素显著增加骨质疏松大鼠的骨密度，对改善松质骨骨量及骨结构参数都有显著作用。1.0mg·kg-1·d-1治疗组效果最佳。结论 重组人生长激素能够促进骨质疏松大鼠骨量恢复，并能够显著改善松质骨的结构，其作用效果与重组人生长激素的剂量有关。
, 百拇医药
The effects of recombinant human growth hormone on cancellous bone of ovariectomized rats
HUANG Suizhu
(Department of Orthopaedics, Ninth People's Hospital,Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011, China)
DAI Kerong, JIANG Liben, et al.
【 Abstract】 Objective To investigate the effects of recombinant human growth hormone on cancellous bone of ovariectomized rats with remarkable bone loss. Methods Six-month old Sprague-Dawley(SD) rats were used to receive low, middle and high doses of recombinant human growth hormone three months after ovariectomy. Bone mineral density and bone histomorphormetry were used to study the alteration of cancellous bone of lumbar vertebrae. Results Recombinant human growth hormone significantly increased bone mineral density and improved the cancellous bone volume and trabecular bone architectures. Conclusion Recombinant human growth hormone can restore the bone loss in ovariectomized rats and improve the trabecular bone architectures. However, its effect is dose related.
, http://www.100md.com
【Key words】 Somatotropins, recombinant; Osteoporosis, postmenopausal; Bone density; Histology; Animal testing alternatives; Rats, Sprague-Dawley
对于骨量已经严重丧失的绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PMO)患者，还没有一种药物能够有效刺激骨形成、促进骨量恢复。氟化物虽已被证实能够促进新骨形成，但临床应用效果却非常令人失望，因为新骨的质量存在问题[1]。因此，对于严重的骨质疏松症的治疗已经成为骨科临床的一大难题。众多体外实验已经证实，生长激素(growthhormone,GH)对成骨细胞分裂增殖、功能活性具有显著促进作用[2，3]，除可促进骨的生长外，还可对成熟骨代谢具有重要影响。
本研究选用6月龄卵巢切除3个月后的SD雌性大鼠，制作成绝经后骨质疏松动物模型，并应用不同剂量重组人生长激素(recombinanthumangrowthhormone,rh-GH)进行治疗。采用骨密度测定、骨组织形态计量学等手段研究其对松质骨的影响，并和传统的雌激素治疗相比较。
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材料与方法
一、动物分组、手术方法与用药情况
6月龄清洁级健康雌性SD大鼠60只，随机均分为6组，每组10只。大鼠分组、手术方法、用药情况及处死时间见表1。大鼠手术时采用氯胺酮腹腔麻醉，无菌操作下经背侧入路摘除双侧卵巢。假手术组大鼠仅做开、关腹腔手术，不摘除卵巢。手术后，任其活动，不用抗生素。大鼠摄食为灭菌的标准饲料(含Ca1.02%、P0.76%、VitD2000IU/kg)和自来水。GH的用量参考大鼠垂体切除后需要做GH替代治疗的剂量(生理剂量)[4]和我们在预先实验中采用的能够显著引起大鼠体形改变的剂量(药理剂量)而分为低(0.15mg·kg-1·d-1)、中(1.00mg·kg-1·d-1)、高(3.00mg·kg-1·d-1)三种剂量。rh-GH由中国科学院上海细胞研究所提供(1mg=3IU)。
, 百拇医药
注：与SO组比较▲P<0.01，*P<0.05；与OVX组比较**P<0.01
表1动物分组、手术方法、用药情况及处死时间
分组
手术方法
给药剂量
处死时间
SO
假手术
生理盐水
术后3个月+8周
OVX
卵巢切除术
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生理盐水
术后3个月+8周
E2
卵巢切除术
1.50μg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
GH1
卵巢切除术
0.15mg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
GH2
, 百拇医药 卵巢切除术
1.00mg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
GH3
卵巢切除术
3.00mg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
注：SO为对照组，OVX为空白去势组，E2为雌二醇组，GH1为低剂量组，GH2为中剂量组，GH3为高剂量组。以下同
二、实验指标观测
(一)骨密度测定
, 百拇医药
大鼠处死后迅速取出L4～6椎体，尽量去除软组织，但保留椎弓等附件。同时取右股骨，剥除周围软组织，置-40℃冰箱内保存。应用Hologic-2000型DEXA骨密度仪测量，精确度1%。结果以均数±标准差表示，差异性通过组间t检验判断。
(二)骨组织形态计量学研究
大鼠处死后立即取出L3椎体，去除附件及附着的软组织，放入福尔马林溶液中固定24h。乙醇逐级脱水，每次24h，最后二甲苯透明4h，甲基丙烯酸甲酯包埋。在Polycut-s型硬组织切片机上切片，沿椎体中部冠状面切厚度为4μm的切片。甲苯胺蓝染色，参照Parfitt等[5]骨小梁参数计量方法，借助VIDAS图像分析系统进行测量，参数包括松质骨体积(Cn-BV/TV)、类骨质表面(OS/BS)、骨吸收表面(ES/BS)、小梁连结点数(N.Nd)和游离末端指数(N.Tm)。结果以均数±标准差表示，差异性通过组间t检验进行判断。
, 百拇医药
(三)血清rh-GH和大鼠IGF-Ⅰ水平测定
血清rh-GH水平采用上海生物制品研究所的rh-GH放射免疫药盒测定。血清类胰岛素生长因子Ⅰ(insulin-likegrowthhormone-Ⅰ，IGF-Ⅰ)水平采用美国DSL-2900大鼠专用放射免疫诊断药盒测定。大鼠血清在正式测定前需要经过抽提(50μl样本+200μl抽提液，25℃，放置30min混匀)，抽提后的血清按常规步骤进行IGF-Ⅰ水平测定。结果以均数±标准差表示，差异性通过t检验进行判断。
结果
一、骨密度测定结果
大鼠卵巢切除术后5个月，椎体骨密度明显低于对照组(P<0.05,OVX组与SO组比较，表2)，而同期股骨中段骨密度值和对照组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。E2治疗使椎体骨密度有一定恢复，而股骨中段骨密度没有明显变化。GH治疗使椎体骨密度有不同程度的恢复，其中中剂量和高剂量GH治疗组骨密度和治疗前比较，差异有显著性意义(P<0.05，表2)。并且高剂量治疗时股骨中段骨密度也有所增加，与治疗前比较，差异有显著性意义(P<0.05，表2)。
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表2GH对卵巢切除大鼠椎体及股骨中段
骨密度的影响(
±s,g/cm2)
分组
L4～6骨密度
股骨中段骨密度
SO
0.1367±0.0083
0.1046±0.0056
OVX
0.1238±0.0058▲
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0.1043±0.0039
E2
0.1293±0.0019
0.1061±0.0086
GH1
0.1267±0.0057
0.1091±0.0045
GH2
0.1381±0.0117*
0.1109±0.0060
GH3
0.1411±0.0108*
, 百拇医药
0.1121±0.0052*
注：与SO组比较▲P<0.05；与OVX组比较*P<0.05
二、L3椎体组织形态计量学研究结果
卵巢切除组Cn-BV/TV明显下降。各治疗组Cn-BV/TV均有恢复，其中GH2和GH3组增加最明显(与OVX组比较，P<0.01，表3)。OVX组OS/BS和ES/BS均显著增加，应用雌激素(E2组)后两种参数又显著降低。GH治疗组上述两种参数和OVX组比较差异无显著性意义。OVX组松质骨的结构参数如N.Nd和N.Tm也发生明显退变。GH治疗使这两个参数均有一定程度改善，尤其是N.Nd(表3)。
三、血清中rh-GH和大鼠IGF-Ⅰ水平测定结果
表3GH治疗对卵巢切除大鼠L3椎体骨小梁静态参数的影响(±s)
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分组
Cn-BV/TV(%)
OS/BS(%)
ES/BS(%)
N.Nd
N.Tm
SO
26.7±3.66
20.24±4.38
1.44±0.39
8.50±1.66
7.60±1.14
, 百拇医药
OVX
11.42±2.09▲
35.89±4.16▲
4.76±0.81▲
4.75±0.82▲
15.32±3.05▲
E2
15.03±2.47*
13.28±2.73**
0.94±0.22**
5.25±0.96
, 百拇医药
13.16±2.83
GH1
15.89±1.96*
35.41±4.61
3.88±0.47
5.81±1.06
13.24±2.69
GH2
20.26±2.86**
33.77±5.08
3.67±0.62
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7.02±1.39*
12.86±2.98
GH3
17.89±2.73**
31.37±4.36
4.01±0.65
6.25±1.17*
13.04±3.01
一般认为，人和高等动物的GH对低等动物有作用，反之则不然。本实验结果表明，大鼠应用rh-GH后，血清IGF-Ⅰ水平显著升高，说明rh-GH对大鼠是有作用的。未采用rh-GH治疗的大鼠，测定结果为阴性，说明rh-GH测定药盒不能测出大鼠GH水平。卵巢切除后大鼠血清IGF-Ⅰ水平没有明显变化，补充雌激素可使OVX大鼠的血清IGF-Ⅰ水平显著下降(P<0.01，表4)。补充GH可使血清IGF-Ⅰ水平显著提高，其变化幅度和GH的用量有关。
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表4卵巢切除及GH治疗对大鼠IGF-Ⅰ的
影响及血清rh-GH测定(±s,ng/ml)
分组
rhGH
IGFⅠ
SO
-
364.56±133.81
OVX
-
368.90±65.06
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E2
-
180.56±18.78**
GH1
47.49±4.50
487.00±83.33*
GH2
50.09±6.10
545.15±91.79*
GH3
55.09±4.58
637.74±110.16**
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注：与OVX组比较*P<0.05，**P<0.01
讨论
目前用于治疗PMO的药物主要是通过阻止过度的骨吸收而发挥作用的，例如常用的雌激素、降钙素、二磷酸盐类等。由于这些药物的主要作用机制是抑制破骨细胞吸收、降低过高的骨转换，因此，理论上讲这些药物只能阻止骨量进一步丢失，而不能够恢复已经丧失的骨量和退变的骨结构。氟化物能够确切地增加骨量，临床上也已经用于PMO的治疗。但有资料表明[1]，由氟化物刺激形成的新骨，在改善骨结构及力学性能方面价值不大。
GH有可能成为一种新的能够刺激骨形成的药物。rh-GH的分泌量随着衰老而递减，特别是妇女绝经后rh-GH的分泌量将明显下降。长期以来，人们试图将GH的分泌状态与骨量的变化结合起来，虽然目前尚没有充分的理由来支持这一假设，但至少在临床上可见到由于GH分泌过多而导致骨量增加(如肢端肥大症)和由于GH分泌过少而导致骨量降低(如GH缺乏症)的许多例子。最近的一些研究表明，骨质疏松症患者(包括PMO)体内GH和IGF-Ⅰ的水平要明显低于老年骨关节炎患者和同龄正常人[6，7]。这些资料说明，GH将可能用于PMO的治疗。有限的临床研究证实GH可以减少PMO患者体内脂肪总量、增加肌肉量、改善精神状态、减少疼痛、增加全身骨钙总量，但这与骨密度测定的结果不完全一致。造成这种情况的原因是：(1)早期GH来源有限，价格昂贵，导致长期研究受到限制；(2)早期研究采用的手段不够先进，例如骨密度测定仪采用单光子吸收法，精度不够，难以发现骨量的微小变化；(3)早期对所治疗的患者缺乏选择，如治疗前未对患者骨转换的高低和血清IGF-Ⅰ水平等进行评定。基因工程合成rh-GH的研制成功，为研究GH治疗PMO提供了条件。
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众多研究资料表明，GH对骨组织具有直接的作用，即直接促进骨形成，也可通过IGF-Ⅰ而间接发挥作用。GH既可促进骨组织分泌IGF-Ⅰ(占IGF-Ⅰ总量的20%)，也可促进肝脏分泌IGF-Ⅰ(占IGF-Ⅰ总量的80%)。IGF-Ⅰ对多种类型的细胞均有促进作用，包括成骨细胞和破骨细胞，而GH则选择性地对靶细胞起作用，如对成骨细胞的作用大于对破骨细胞的作用[8]。GH可促进IGF-Ⅰ的合成与在体内、体外实验的结果一致，但雌激素可促进IGF-Ⅰ的合成与在体内、体外实验的结果不完全相同。雌激素在体外可促进IGF-Ⅰ的合成[9]，而在体内(临床应用或动物实验)均明显抑制IGF-Ⅰ合成[4，10]。但有人认为雌激素只是抑制了肝脏中的IGF-Ⅰ的合成，对骨组织IGF-Ⅰ的合成仍具有促进作用[8]。本实验结果证实OVX大鼠血清IGF-Ⅰ水平与SO组比较无明显改变，而补充雌激素后血清IGF-Ⅰ水平与SO组比较，差异有非常显著性意义(P<0.01)。最近的一些临床应用和动物实验研究也发现，E2可以阻止GH促进IGF-Ⅰ合成的作用[4]。这说明，雌激素治疗骨质疏松症主要是通过降低骨转换实现的，它在降低破骨细胞性骨吸收的同时，也抑制了骨形成。
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骨密度测定结果显示，各治疗组均可使椎体骨密度增加，以GH2和GH3组增加最明显(与OVX组比较，P<0.05)。GH3组对大鼠股骨中段骨密度也有明显增加作用(与OVX组比较，P<0.05)，说明GH对OVX大鼠的松质骨及皮质骨骨量均有增加的作用。椎体骨密度的改变可能包含两个因素：椎体中松质骨骨量的改变及椎体皮质骨骨量的改变(包括椎体附件)。所以，骨密度测定的结果不会像骨组织形态计量学测定的那样准确，因为后者恰恰反映了松质骨骨量的改变。
对大鼠L3椎体的组织形态计量学研究发现，各治疗组Cn-BV/TV均有不同程度增加，以GH2组增加最为明显，说明中剂量生长激素(1.00mg·kg-1·d-1)对松质骨的作用比高剂量(3.00mg·kg-1·d-1)生长激素更为有效。我们在实验中还发现，卵巢切除后大鼠的骨转换明显加快，表现为小梁骨的OS/BS和ES/BS均明显增加(与SO组比较，P<0.01)。应用雌激素可使OVX大鼠骨转换显著降低。GH治疗组骨转换无明显改变，其提高骨量的作用很可能是通过促使骨重建过程中骨形成增加(即重建正平衡)实现的。Duursma等[8]认为GH的作用具有明显的细胞专一性，它对成骨细胞的作用要大于对破骨细胞的作用，从而有利于骨形成。对骨结构参数如N.Nd和N.Tm的研究发现，卵巢切除的大鼠不仅骨量明显丢失，而且骨结构也出现明显变化。表现为卵巢切除组N.Nd明显低于对照组，而N.Tm则明显高于对照组(P<0.01)。GH治疗可使骨结构参数明显改善，表现为GH2和GH3组N.Nd明显增加(P<0.05,与OVX组比较)。
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从本实验的结果看，GH治疗骨质疏松症和传统的雌激素治疗有很大的不同，主要的区别就在于GH是通过促进骨形成而保护骨量；雌激素则是通过降低过高的骨转换而发挥作用，它在抑制骨吸收的同时，也影响到骨形成。另外，GH在提高骨量的同时，松质骨结构也有改善，这是雌激素治疗所不能达到的。加上雌激素众所周知的副作用，因此，GH是治疗骨质疏松症新的具有良好作用的药物。由于GH是通过促进骨形成而起作用，所以它对老年性骨质疏松症可能有更好的治疗效果。
总之，本实验结果证实rh-GH可以显著增加卵巢切除后发生明显骨丢失大鼠的骨量，并且可以改善其松质骨结构。rh-GH的作用和IGF-Ⅰ的合成有关。大鼠GH用量和临床GH用量相差较大，可能和种属差异有关。用于治疗骨质疏松症的GH最佳用量和给药途径尚有待于进一步研究。另外，尽管GH和雌激素、降钙素合用后无助于前者对骨组织作用的提高，但GH和钙剂、维生素D或其它药物合用的作用效果尚有待进一步阐明。
基金项目：上海市科技发展基金资助项目(964119024)
, 百拇医药
参考文献
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, 百拇医药
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5，Parfitt AM, Mathews CH, Villanueva AR, et al. Relationship between surface, volume, and thickness of iliac trabecular bone in aging and in osteoporosis:implications for the microanatomic and cellular mechanisms of bone loss. J Clin Invest, 1983,72:1396- 1409.
, http://www.100md.com
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7，Dequeker J, Burssens A, Bouillon R. Dynamics of growth hormone secretion in patients with osteoporosis and in patients with osteoarthrosis. Horm Res, 1982, 16:353- 356.
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10，Wiedemann E, Schwartz E, Frantz AG. Acute and chronic estrogen effects upon serum somatomedin activity, growth hormone, and prolactin in man. J Clin Endocrinol Metab, 1976,42:942- 952.
(收稿日期：1999-08-03), http://www.100md.com
单位：黄遂柱(河南省人民医院骨科)；戴尅戎 汤亭亭(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科 200011)；姜立本(上海医科大学附属中山医院康复医学研究所)
关键词：促生长素类；重组；骨质疏松；绝经后；骨密度；组织学；动物实验替代试验；大鼠,Sprague-Dawley
中华骨科杂志001112
【摘要】目的 研究重组人生长激素对卵巢切除后已发生明显骨丢失大鼠松质骨的影响。方法 6月龄SD雌性大鼠卵巢切除3个月后开始接受低、中、高三种剂量重组人生长激素皮下注射8周，采用骨密度测定、骨组织形态计量学等手段研究大鼠腰椎松质骨的改变。结果 重组人生长激素显著增加骨质疏松大鼠的骨密度，对改善松质骨骨量及骨结构参数都有显著作用。1.0mg·kg-1·d-1治疗组效果最佳。结论 重组人生长激素能够促进骨质疏松大鼠骨量恢复，并能够显著改善松质骨的结构，其作用效果与重组人生长激素的剂量有关。
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HUANG Suizhu
(Department of Orthopaedics, Ninth People's Hospital,Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011, China)
DAI Kerong, JIANG Liben, et al.
【 Abstract】 Objective To investigate the effects of recombinant human growth hormone on cancellous bone of ovariectomized rats with remarkable bone loss. Methods Six-month old Sprague-Dawley(SD) rats were used to receive low, middle and high doses of recombinant human growth hormone three months after ovariectomy. Bone mineral density and bone histomorphormetry were used to study the alteration of cancellous bone of lumbar vertebrae. Results Recombinant human growth hormone significantly increased bone mineral density and improved the cancellous bone volume and trabecular bone architectures. Conclusion Recombinant human growth hormone can restore the bone loss in ovariectomized rats and improve the trabecular bone architectures. However, its effect is dose related.
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【Key words】 Somatotropins, recombinant; Osteoporosis, postmenopausal; Bone density; Histology; Animal testing alternatives; Rats, Sprague-Dawley
对于骨量已经严重丧失的绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PMO)患者，还没有一种药物能够有效刺激骨形成、促进骨量恢复。氟化物虽已被证实能够促进新骨形成，但临床应用效果却非常令人失望，因为新骨的质量存在问题[1]。因此，对于严重的骨质疏松症的治疗已经成为骨科临床的一大难题。众多体外实验已经证实，生长激素(growthhormone,GH)对成骨细胞分裂增殖、功能活性具有显著促进作用[2，3]，除可促进骨的生长外，还可对成熟骨代谢具有重要影响。
本研究选用6月龄卵巢切除3个月后的SD雌性大鼠，制作成绝经后骨质疏松动物模型，并应用不同剂量重组人生长激素(recombinanthumangrowthhormone,rh-GH)进行治疗。采用骨密度测定、骨组织形态计量学等手段研究其对松质骨的影响，并和传统的雌激素治疗相比较。
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材料与方法
一、动物分组、手术方法与用药情况
6月龄清洁级健康雌性SD大鼠60只，随机均分为6组，每组10只。大鼠分组、手术方法、用药情况及处死时间见表1。大鼠手术时采用氯胺酮腹腔麻醉，无菌操作下经背侧入路摘除双侧卵巢。假手术组大鼠仅做开、关腹腔手术，不摘除卵巢。手术后，任其活动，不用抗生素。大鼠摄食为灭菌的标准饲料(含Ca1.02%、P0.76%、VitD2000IU/kg)和自来水。GH的用量参考大鼠垂体切除后需要做GH替代治疗的剂量(生理剂量)[4]和我们在预先实验中采用的能够显著引起大鼠体形改变的剂量(药理剂量)而分为低(0.15mg·kg-1·d-1)、中(1.00mg·kg-1·d-1)、高(3.00mg·kg-1·d-1)三种剂量。rh-GH由中国科学院上海细胞研究所提供(1mg=3IU)。
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注：与SO组比较▲P<0.01，*P<0.05；与OVX组比较**P<0.01
表1动物分组、手术方法、用药情况及处死时间
分组
手术方法
给药剂量
处死时间
SO
假手术
生理盐水
术后3个月+8周
OVX
卵巢切除术
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生理盐水
术后3个月+8周
E2
卵巢切除术
1.50μg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
GH1
卵巢切除术
0.15mg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
GH2
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1.00mg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
GH3
卵巢切除术
3.00mg·kg-1·d-1
术后3个月+8周
注：SO为对照组，OVX为空白去势组，E2为雌二醇组，GH1为低剂量组，GH2为中剂量组，GH3为高剂量组。以下同
二、实验指标观测
(一)骨密度测定
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大鼠处死后迅速取出L4～6椎体，尽量去除软组织，但保留椎弓等附件。同时取右股骨，剥除周围软组织，置-40℃冰箱内保存。应用Hologic-2000型DEXA骨密度仪测量，精确度1%。结果以均数±标准差表示，差异性通过组间t检验判断。
(二)骨组织形态计量学研究
大鼠处死后立即取出L3椎体，去除附件及附着的软组织，放入福尔马林溶液中固定24h。乙醇逐级脱水，每次24h，最后二甲苯透明4h，甲基丙烯酸甲酯包埋。在Polycut-s型硬组织切片机上切片，沿椎体中部冠状面切厚度为4μm的切片。甲苯胺蓝染色，参照Parfitt等[5]骨小梁参数计量方法，借助VIDAS图像分析系统进行测量，参数包括松质骨体积(Cn-BV/TV)、类骨质表面(OS/BS)、骨吸收表面(ES/BS)、小梁连结点数(N.Nd)和游离末端指数(N.Tm)。结果以均数±标准差表示，差异性通过组间t检验进行判断。
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(三)血清rh-GH和大鼠IGF-Ⅰ水平测定
血清rh-GH水平采用上海生物制品研究所的rh-GH放射免疫药盒测定。血清类胰岛素生长因子Ⅰ(insulin-likegrowthhormone-Ⅰ，IGF-Ⅰ)水平采用美国DSL-2900大鼠专用放射免疫诊断药盒测定。大鼠血清在正式测定前需要经过抽提(50μl样本+200μl抽提液，25℃，放置30min混匀)，抽提后的血清按常规步骤进行IGF-Ⅰ水平测定。结果以均数±标准差表示，差异性通过t检验进行判断。
结果
一、骨密度测定结果
大鼠卵巢切除术后5个月，椎体骨密度明显低于对照组(P<0.05,OVX组与SO组比较，表2)，而同期股骨中段骨密度值和对照组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。E2治疗使椎体骨密度有一定恢复，而股骨中段骨密度没有明显变化。GH治疗使椎体骨密度有不同程度的恢复，其中中剂量和高剂量GH治疗组骨密度和治疗前比较，差异有显著性意义(P<0.05，表2)。并且高剂量治疗时股骨中段骨密度也有所增加，与治疗前比较，差异有显著性意义(P<0.05，表2)。
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表2GH对卵巢切除大鼠椎体及股骨中段
骨密度的影响(
±s,g/cm2)分组
L4～6骨密度
股骨中段骨密度
SO
0.1367±0.0083
0.1046±0.0056
OVX
0.1238±0.0058▲
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0.1043±0.0039
E2
0.1293±0.0019
0.1061±0.0086
GH1
0.1267±0.0057
0.1091±0.0045
GH2
0.1381±0.0117*
0.1109±0.0060
GH3
0.1411±0.0108*
, 百拇医药
0.1121±0.0052*
注：与SO组比较▲P<0.05；与OVX组比较*P<0.05
二、L3椎体组织形态计量学研究结果
卵巢切除组Cn-BV/TV明显下降。各治疗组Cn-BV/TV均有恢复，其中GH2和GH3组增加最明显(与OVX组比较，P<0.01，表3)。OVX组OS/BS和ES/BS均显著增加，应用雌激素(E2组)后两种参数又显著降低。GH治疗组上述两种参数和OVX组比较差异无显著性意义。OVX组松质骨的结构参数如N.Nd和N.Tm也发生明显退变。GH治疗使这两个参数均有一定程度改善，尤其是N.Nd(表3)。
三、血清中rh-GH和大鼠IGF-Ⅰ水平测定结果
表3GH治疗对卵巢切除大鼠L3椎体骨小梁静态参数的影响(
±s), 百拇医药
分组
Cn-BV/TV(%)
OS/BS(%)
ES/BS(%)
N.Nd
N.Tm
SO
26.7±3.66
20.24±4.38
1.44±0.39
8.50±1.66
7.60±1.14
, 百拇医药
OVX
11.42±2.09▲
35.89±4.16▲
4.76±0.81▲
4.75±0.82▲
15.32±3.05▲
E2
15.03±2.47*
13.28±2.73**
0.94±0.22**
5.25±0.96
, 百拇医药
13.16±2.83
GH1
15.89±1.96*
35.41±4.61
3.88±0.47
5.81±1.06
13.24±2.69
GH2
20.26±2.86**
33.77±5.08
3.67±0.62
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7.02±1.39*
12.86±2.98
GH3
17.89±2.73**
31.37±4.36
4.01±0.65
6.25±1.17*
13.04±3.01
一般认为，人和高等动物的GH对低等动物有作用，反之则不然。本实验结果表明，大鼠应用rh-GH后，血清IGF-Ⅰ水平显著升高，说明rh-GH对大鼠是有作用的。未采用rh-GH治疗的大鼠，测定结果为阴性，说明rh-GH测定药盒不能测出大鼠GH水平。卵巢切除后大鼠血清IGF-Ⅰ水平没有明显变化，补充雌激素可使OVX大鼠的血清IGF-Ⅰ水平显著下降(P<0.01，表4)。补充GH可使血清IGF-Ⅰ水平显著提高，其变化幅度和GH的用量有关。
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表4卵巢切除及GH治疗对大鼠IGF-Ⅰ的
影响及血清rh-GH测定(
±s,ng/ml)分组
rhGH
IGFⅠ
SO
-
364.56±133.81
OVX
-
368.90±65.06
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E2
-
180.56±18.78**
GH1
47.49±4.50
487.00±83.33*
GH2
50.09±6.10
545.15±91.79*
GH3
55.09±4.58
637.74±110.16**
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注：与OVX组比较*P<0.05，**P<0.01
讨论
目前用于治疗PMO的药物主要是通过阻止过度的骨吸收而发挥作用的，例如常用的雌激素、降钙素、二磷酸盐类等。由于这些药物的主要作用机制是抑制破骨细胞吸收、降低过高的骨转换，因此，理论上讲这些药物只能阻止骨量进一步丢失，而不能够恢复已经丧失的骨量和退变的骨结构。氟化物能够确切地增加骨量，临床上也已经用于PMO的治疗。但有资料表明[1]，由氟化物刺激形成的新骨，在改善骨结构及力学性能方面价值不大。
GH有可能成为一种新的能够刺激骨形成的药物。rh-GH的分泌量随着衰老而递减，特别是妇女绝经后rh-GH的分泌量将明显下降。长期以来，人们试图将GH的分泌状态与骨量的变化结合起来，虽然目前尚没有充分的理由来支持这一假设，但至少在临床上可见到由于GH分泌过多而导致骨量增加(如肢端肥大症)和由于GH分泌过少而导致骨量降低(如GH缺乏症)的许多例子。最近的一些研究表明，骨质疏松症患者(包括PMO)体内GH和IGF-Ⅰ的水平要明显低于老年骨关节炎患者和同龄正常人[6，7]。这些资料说明，GH将可能用于PMO的治疗。有限的临床研究证实GH可以减少PMO患者体内脂肪总量、增加肌肉量、改善精神状态、减少疼痛、增加全身骨钙总量，但这与骨密度测定的结果不完全一致。造成这种情况的原因是：(1)早期GH来源有限，价格昂贵，导致长期研究受到限制；(2)早期研究采用的手段不够先进，例如骨密度测定仪采用单光子吸收法，精度不够，难以发现骨量的微小变化；(3)早期对所治疗的患者缺乏选择，如治疗前未对患者骨转换的高低和血清IGF-Ⅰ水平等进行评定。基因工程合成rh-GH的研制成功，为研究GH治疗PMO提供了条件。
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众多研究资料表明，GH对骨组织具有直接的作用，即直接促进骨形成，也可通过IGF-Ⅰ而间接发挥作用。GH既可促进骨组织分泌IGF-Ⅰ(占IGF-Ⅰ总量的20%)，也可促进肝脏分泌IGF-Ⅰ(占IGF-Ⅰ总量的80%)。IGF-Ⅰ对多种类型的细胞均有促进作用，包括成骨细胞和破骨细胞，而GH则选择性地对靶细胞起作用，如对成骨细胞的作用大于对破骨细胞的作用[8]。GH可促进IGF-Ⅰ的合成与在体内、体外实验的结果一致，但雌激素可促进IGF-Ⅰ的合成与在体内、体外实验的结果不完全相同。雌激素在体外可促进IGF-Ⅰ的合成[9]，而在体内(临床应用或动物实验)均明显抑制IGF-Ⅰ合成[4，10]。但有人认为雌激素只是抑制了肝脏中的IGF-Ⅰ的合成，对骨组织IGF-Ⅰ的合成仍具有促进作用[8]。本实验结果证实OVX大鼠血清IGF-Ⅰ水平与SO组比较无明显改变，而补充雌激素后血清IGF-Ⅰ水平与SO组比较，差异有非常显著性意义(P<0.01)。最近的一些临床应用和动物实验研究也发现，E2可以阻止GH促进IGF-Ⅰ合成的作用[4]。这说明，雌激素治疗骨质疏松症主要是通过降低骨转换实现的，它在降低破骨细胞性骨吸收的同时，也抑制了骨形成。
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骨密度测定结果显示，各治疗组均可使椎体骨密度增加，以GH2和GH3组增加最明显(与OVX组比较，P<0.05)。GH3组对大鼠股骨中段骨密度也有明显增加作用(与OVX组比较，P<0.05)，说明GH对OVX大鼠的松质骨及皮质骨骨量均有增加的作用。椎体骨密度的改变可能包含两个因素：椎体中松质骨骨量的改变及椎体皮质骨骨量的改变(包括椎体附件)。所以，骨密度测定的结果不会像骨组织形态计量学测定的那样准确，因为后者恰恰反映了松质骨骨量的改变。
对大鼠L3椎体的组织形态计量学研究发现，各治疗组Cn-BV/TV均有不同程度增加，以GH2组增加最为明显，说明中剂量生长激素(1.00mg·kg-1·d-1)对松质骨的作用比高剂量(3.00mg·kg-1·d-1)生长激素更为有效。我们在实验中还发现，卵巢切除后大鼠的骨转换明显加快，表现为小梁骨的OS/BS和ES/BS均明显增加(与SO组比较，P<0.01)。应用雌激素可使OVX大鼠骨转换显著降低。GH治疗组骨转换无明显改变，其提高骨量的作用很可能是通过促使骨重建过程中骨形成增加(即重建正平衡)实现的。Duursma等[8]认为GH的作用具有明显的细胞专一性，它对成骨细胞的作用要大于对破骨细胞的作用，从而有利于骨形成。对骨结构参数如N.Nd和N.Tm的研究发现，卵巢切除的大鼠不仅骨量明显丢失，而且骨结构也出现明显变化。表现为卵巢切除组N.Nd明显低于对照组，而N.Tm则明显高于对照组(P<0.01)。GH治疗可使骨结构参数明显改善，表现为GH2和GH3组N.Nd明显增加(P<0.05,与OVX组比较)。
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从本实验的结果看，GH治疗骨质疏松症和传统的雌激素治疗有很大的不同，主要的区别就在于GH是通过促进骨形成而保护骨量；雌激素则是通过降低过高的骨转换而发挥作用，它在抑制骨吸收的同时，也影响到骨形成。另外，GH在提高骨量的同时，松质骨结构也有改善，这是雌激素治疗所不能达到的。加上雌激素众所周知的副作用，因此，GH是治疗骨质疏松症新的具有良好作用的药物。由于GH是通过促进骨形成而起作用，所以它对老年性骨质疏松症可能有更好的治疗效果。
总之，本实验结果证实rh-GH可以显著增加卵巢切除后发生明显骨丢失大鼠的骨量，并且可以改善其松质骨结构。rh-GH的作用和IGF-Ⅰ的合成有关。大鼠GH用量和临床GH用量相差较大，可能和种属差异有关。用于治疗骨质疏松症的GH最佳用量和给药途径尚有待于进一步研究。另外，尽管GH和雌激素、降钙素合用后无助于前者对骨组织作用的提高，但GH和钙剂、维生素D或其它药物合用的作用效果尚有待进一步阐明。
基金项目：上海市科技发展基金资助项目(964119024)
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(收稿日期：1999-08-03), http://www.100md.com