体外培养的贲门癌组织对神经节突起的促生长和诱向作用
吕双红 林树新 周岩 阙海萍 胡良平 刘少君
摘 要 目的：探讨体外培养条件下肿瘤组织和原代培养肿瘤细胞对鸡胚神经节神经元的影响。方法：⑴贲门癌组织块和原代培养的肿瘤细胞与鸡胚背根神经节共培养；⑵贲门癌组织/原代细胞培养液与鸡胚背根神经节和交感神经节共培养；⑶贲门癌组织/原代细胞培养液中加入神经生长因子(nerve growth factor，NGF)抗体后与鸡胚背根神经节和交感神经节共培养。结果：⑴贲门癌组织块及原代培养的肿瘤细胞对神经节突起有促生长和诱向作用；⑵肿瘤组织/原代肿瘤细胞培养液也能促使背根神经节和交感神经节长出浓密突起；⑶NGF抗体只能部分阻断这种促神经生长作用。结论：体外培养的贲门癌组织和细胞对神经节突起有促生长和诱向作用，这种作用可能部分与神经生长因子有关。
关键词：贲门癌；神经节，脊；神经节，交感；共培养；神经生长因子
, 百拇医药
作者所在实验室在对胃癌、贲门癌、乳腺癌、脑膜瘤等数十种肿瘤进行研究后发现，多种肿瘤组织内都弥散分布有多种神经肽免疫阳性的神经纤维[1，2],这些神经纤维多从肿瘤周围的神经束发出，深入肿瘤组织内部，并与肿瘤细胞密切接触。为此我们推测，可能是肿瘤组织分泌了促神经生长的活性物质，诱使周围正常组织中的神经纤维长入肿瘤组织中的。为探讨肿瘤组织中是否存在促神经生长的活性物质，我们采用贲门癌组织块及原代培养的肿瘤细胞与鸡胚神经节共培养的方法，并用肿瘤组织/细胞条件培养液培养鸡胚神经节，以观察贲门癌组织对神经节突起的生长是否有影响；并通过加入神经生长因子(nerve growth factor,NGF)抗血清阻断的方法，初步探讨肿瘤内影响神经元突起生长的物质的性质。
1 材料与方法
1.1 贲门癌标本的收集与处理
贲门癌标本10例，7例男性，3例女性，年龄46～72岁。均由北京医科大学附属肿瘤医院提供。患者经临床和病理诊断确诊为腺癌。征得患者和家属同意后，将手术取得的癌肿无菌收集于含1 000 U/ml青霉素和1 000 U/ml链霉素的DMEM培养液(高糖，Gibco公司)中，1.5 h内做培养。
, 百拇医药
1.2 鸡胚神经节的分离
8～10日龄鸡胚，购于中国农业科学院畜牧所。按文献[3]所述方法，70%酒精消毒蛋壳，气室朝上敲破，取出鸡胚，置于解剖显微镜下，腹侧暴露脊柱，取腰旁交感链及背根神经节，置于盛1 ml DMEM培养液的平皿中；剥除外膜备用。
1.3 贲门癌组织块与背根神经节共培养
肿瘤标本修除周围坏死组织后Hanks液冲洗，剪切成1 mm3大小，与鸡胚背根神经节相距1 mm接种于涂有L-多聚赖氨酸(Sigma公司产品)的24孔板(Coastar公司产品)中共培养。10例标本每例共培养12孔，每孔一对。于饱和湿度的温箱内(37℃，7.5%CO2)孵育。4 h后加无血清的DMEM培养液。对照组用无血清DMEM液培养神经节，每例10孔，每孔一个。24 h后于IX70型倒置显微镜(Olympus公司产品)下观察，计数长出突起的神经节个数。
, 百拇医药
1.4 贲门癌原代培养细胞与背根神经节共培养
按组织块培养法，用含4 mmol/L的L-谷氨酰胺，10%FBS(Hyclone公司产品)的DMEM培养液培养肿瘤细胞。收集10例标本中肿瘤细胞生长较旺盛的6例 ，用无血清DMEM液洗涤肿瘤细胞2次，加含4 mmol/L的L-谷氨酰胺的无血清DMEM液，制成原代肿瘤细胞悬液；以5×103的密度与背根神经节在24孔板中混和共培养。每例标本种12孔，每孔1个神经节；对照组取含4 mmol/L L-谷氨酰胺的无血清DMEM液培养神经节，每例10孔，每孔1个。24 h后于倒置显微镜下观察。
1.5 贲门癌组织/细胞培养液培养背根神经节和交感神经节
取培养一周的生长旺盛的贲门癌原代肿瘤细胞无血清培养液，离心后取上清培养鸡胚背根神经节和交感神经节。10例标本每例培养背根节15孔，交感节9孔，每孔各1个，加培养液0.5 ml。对照组10孔神经节用无血清DMEM培养液培养。
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1.6 NGF抗体阻断实验
用1.5的方法制备贲门癌培养液，然后加入NGF抗血清(Boehringer Mannheim公司产品，编号1087754；小鼠多克隆抗体，可与人、大鼠和牛的NGF反应)。根据另一项SDS电泳研究、光密度分析结果，确定加入过量抗血清浓度为100 ng/ml。为保证抗血清足量，另增加200 ng/ml抗血清浓度组。取预先加有NGF抗体的肿瘤培养液500 μl与鸡胚背根神经节和交感神经节在24孔板中共培养。10例标本每例共培养背根节15孔，交感节9孔，每孔1个神经节。对照组：单纯贲门癌组织/细胞培养液培养神经节，数量同实验组。空白对照组：含4 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM液培养神经节，每例10孔，每孔1个。
1.7 统计分析
采用单组设计资料的t检验、配对资料的t检验和具有两个重复测量设计资料的方差分析[4]的统计方法，用SAS统计软件对结果进行分析。
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2 结果
2.1 肿瘤组织块与背根神经节共培养
神经节长出浓密突起，部分神经节长出的突起对肿瘤组织块表现出趋化性。对照组神经节未长出突起。结果见图1、图2和表1。
表1 与肿瘤组织块共培养的背根神经节长出突起的情况
组 别
长出突起的神
经节总数(孔)
未长出突起的神
经节总数(孔)
长出突起的神经节
, http://www.100md.com 百分率(
±s)
共培养组
60
29
0.67±0.09***
对照组
0
63
0
*** t=23.36，P<0.0001，说明与肿瘤组织块共培养的神经节中长出突起的神经节百分率与对照组之间的差异有非常显著性意义。其中突起有趋化性的神经节百分率的±s为0.49±0.11
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图1 与贲门癌组织块共培养的背根神经节
(×70，培养48 h)
神经节(G)两端和靠近肿瘤组织块一侧(右侧，照片未显示)可见密集的突起长出，而对侧仅见稀疏而短小的突起。
顶端部分神经纤维呈弯曲状(箭头)向肿瘤组织块位置集中、生长
图2 DMEM培养液中的对照组神经节(×100，培养48 h)
神经节(G)周围未长出突起
2.2 原代培养贲门癌细胞与背根神经节混合共培养
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神经节长出较多突起。结果见图3和表2。
表2 与原代培养贲门癌细胞共培养的背根神经节长出突起的情况
组别
长出突起的神
经节总数(孔)
未长出突起的神
经节总数(孔)
长出突起的神经节
百分率(±s)
, 百拇医药
共培养组
43
17
0.70±0.12***
对照组
0
67
0
*** t=14.65，P<0.0001，说明与肿瘤细胞混合共培养的神经节中长出突起的神经节百分率与对照组之间的差异有非常显著性意义
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图3 与贲门癌细胞共培养的背根神经节
(×160，培养24 h)
神经节(G)周围长出较稀疏的神经纤维，有些神经纤维伸向肿瘤细胞(箭头)或小肿瘤组织(三角)
2.3 贲门癌组织/细胞培养液培养交感和感觉神经节
背根节长出浓密突起，交感节突起较长、较稀疏。结果见图4、图5和表3。
图4 贲门癌培养液中的背根神经节(×250，培养24 h)
密集的神经纤维从神经节(G)伸出
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图5 贲门癌培养液中的交感神经节(×80，培养24 h)
较多的突起从神经节(G)发出
表3 贲门癌培养液培养的神经节长出突起的情况
组别
长出突起的神
经节数(孔)
未长出突起的
神经节数(孔)
长出突起的神经节
百分率(±s)
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背根节
81
32
0.70±0.13***###
交感节
36
31
0.54±0.12***
对照组
0
65
0
, 百拇医药 *** 长出突起的背根节和交感节的百分率分别与对照组之间比较，t值分别为17.32和14.83，P<0.0001，说明肿瘤培养液中长出突起的背根节和交感节的百分率与对照组之间的差异均有非常显著性意义；
### 长出突起的背根节与交感节百分率之间的比较，t=3.52，P=0.0065<0.01， 说明肿瘤培养液对背根神经节和交感神经节的突起生长的促进作用之间的差异有非常显著性意义，对背根节的作用更强
2.4 NGF抗体阻断实验
NGF抗体组培养的背根节和交感节均有少量突起长出。结果见图6和表4。
图6 NGF抗体组背根神经节(×100，培养48 h)
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加有NGF抗体的贲门癌培养液中神经节(G)周围
长出稀疏而细长的突起
表4 NGF抗体组及贲门癌培养液对照组长出突起的
背根节比例(±s)
组 别
背根神经节
交感神经节
100 ng/mlNGF抗体组
0.49±0.076* ###
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0.44±0.048* ###
200 ng/ml NGF抗体组
0.51±0.061###
0.45±0.066###
单纯贲门癌培养液对照组
0.72±0.067
0.60±0.095
* 两种浓度NGF抗体组背根节之间和交感节之间比较，P均大于0.05；说明两个NGF抗体浓度组作用之间的差异无显著性意义；
### 100 ng/ml和200 ng/ml NGF抗体组分别与贲门癌培养液组背根节之间和交感节之间比较，P均小于0.01；说明两种浓度的NGF抗体组与单纯贲门癌培养液对照组相比，长出突起的背根节及交感节比例的差异均有非常显著性意义
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3 讨论
神经与肿瘤的关系早已为神经学家和肿瘤病理学家所关注[5，6]，但苦于无突破口，这方面的研究一直未有明显进展。近年来，随着神经活性物质，主要是神经肽的发现，又引起了人们探讨神经与肿瘤关系的兴趣。作者所在实验室曾发现包括贲门癌在内的多种肿瘤组织中存在多种肽能神经纤维[1，2]；神经纤维与肿瘤细胞密切接触；与支配肿瘤起源组织的神经纤维相比，肿瘤中神经纤维的化学性质发生明显改变。这些初步研究可能为探讨神经纤维在局部如何影响肿瘤的生长、分化提供了突破口。本实验用肿瘤与神经节共培养的方法，探讨肿瘤与神经相互作用的关系；用贲门癌组织和(或)原代培养细胞及肿瘤培养液与背根神经节和(或)交感神经节共培养，以及加入NGF抗血清的阻断实验，初步探讨肿瘤组织如何影响神经生长，从而为肿瘤组织内神经纤维的来源提供证据。在以前的研究中，不少作者曾经探讨过肿瘤对神经的影响，据我们掌握的文献看，我们是首先将肿瘤组织和(或)原代肿瘤细胞与神经节共培养进行探讨研究的。神经节神经元培养对培养条件要求较苛刻，在无血清培养液中难以生长分化，我们在研究中也得到同样的结论。但是用肿瘤组织或细胞，甚至肿瘤培养液与鸡胚背根神经节和(或)交感神经节共培养，发现肿瘤组织或细胞及肿瘤培养液均能促进神经节突起的生长。据此我们推测，贲门癌组织内确实存在能够影响神经节神经元生长分化的物质。
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在确定贲门癌组织和(或)原代肿瘤细胞甚至培养液能够影响神经节神经元生长分化的基础上，我们还对肿瘤组织如何影响神经节神经元生长进行了探讨。据文献报道，NGF可能是存在于肿瘤组织中的主要促生长物质。NGF最早就是从小鼠肉瘤组织中发现的。近年来又不断在前列腺癌组织中发现有NGF的存在[7]，在胰腺癌中有NT-3的表达[8]等。然而，据我们掌握的文献，尚未有关于贲门癌、胃癌存在NGF 或NGF受体的报告。我们用肿瘤组织或细胞培养液与神经节共培养的方法，证明肿瘤内促神经生长的物质可被分泌到培养液内，进而采用阻断实验，在肿瘤培养液中加入NGF抗血清后再与神经节共培养来探讨肿瘤对神经节突起的促生长作用是否是通过NGF实现的。结果发现，与单纯贲门癌培养液组相比，加入NGF抗血清组对神经节突起生长的影响明显减弱，说明NGF在其中确实起相当作用；但NGF抗血清阻断实验组与无血清DMEM培养液对照组相比也有显著差异，表明NGF抗体只能起到部分阻断作用。在抗体阻断实验组中，加入抗血清浓度100 ng/ml组和200 ng/ml组无任何区别，表明这种部分阻断作用并非由于抗体剂量不足造成，可能除NGF外，癌组织培养液中还存在其他能促神经生长的物质。在对肿瘤组织培养液做SDS电泳中我们也观察到其中存在与NGF相对分子质量相同的条带(待发表)。从这些研究可以推断，肿瘤内的神经纤维可能是受肿瘤分泌的NGF和其他促神经生长物质影响，而从周围正常组织长入肿瘤的。此研究部分解释了我们在另一组实验中发现的肿瘤组织中大量肽能神经纤维的来源。
, 百拇医药
除了促进神经生长外，促神经生长物质还能作为促有丝分裂剂促进肿瘤细胞的分裂，如在前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、胰腺癌[11]中；或者抑制增殖，促进分化，如对PC12细胞[12]等。因为肿瘤组织块及原代培养的肿瘤细胞中并非只有单一的肿瘤细胞，贲门癌组织中的促神经生长物质可能由肿瘤细胞或基质细胞分泌，参与调节肿瘤的生长与分化。
[作者简介]吕双红(1972-)，女，甘肃徽县人，第四军医大学硕士生。
吕双红(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
林树新(第四军医大学病理生理学教研室，西安 710032)
周岩(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
, http://www.100md.com
阙海萍(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
胡良平(军事医学科学院情报研究所，北京 100850)
刘少君(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1]刘少君.人脑膜瘤有肽能神经纤维分布[J].第四军医大学学报,1992,13(3):220.
[2]刘少君,杨 萍,张世忠等.脑膜瘤内的肽能神经支配[J].第四军医大学学报,1993,14(1):14.
[3]Greene LA.Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons II.Sensory neurons[J].Develop Biol,1977,58(1):106.
, 百拇医药
[4]胡良平.现代统计学与SAS应用[M].北京:军事医学科学出版社,1996.129～145.
[5]Willis RA.The spread of tumors in the human body[M].2nd ed.London:Butterworths,1952.121～126.
[6]Willis RA.Pathology of tumors[M].3rd ed.London :Butterworths,1960.127～147.
[7]MacGrogan D,Saint André JP,Dicou E.Expression of nerve growth factor and nerve growth factor receptor genes in human tissues and in prostatic adenocarcinoma cell lines[J].J Neurochem,1992,59(4):1381 .
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[8]Ohta T,Numata M,Tsukioka Y，et al.Neurotrophin-3 expression in human pancreatic cancers[J].J Pathol,1997,181(4):405.
[9]Djakiew D,Delsiue R,Pflug B，et al.Regulation of growth by a nerve growth factor-like protein which modulates paracrine interaction between a neoplastic epithelial cell line and stromal cells of the human prostate[J].Cancer Res,1991,51(12):3304.
[10]Descamps S,Lebourhis X,Delehedde M，et al.Nerve growth factor is mitogenic for cancerous but not normal human breast epithelial cells[J].J Biol Chem,1998,273(27):16659.
[11]Bold RJ,Ishizuka J,Rajaraman S，et al.Nerve growth factor as a mitogen for a pancreatic carcinoid cell line[J].J Neurochem,1995,64(6):2622.
[12]Gill JS,Schenone AE,Podratz JL，et al.Autocrine regulation of neurite outgrowth from PC12 cells by nerve growth factor[J].Mol Brain Res,1998,57(1):123., 百拇医药
摘 要 目的：探讨体外培养条件下肿瘤组织和原代培养肿瘤细胞对鸡胚神经节神经元的影响。方法：⑴贲门癌组织块和原代培养的肿瘤细胞与鸡胚背根神经节共培养；⑵贲门癌组织/原代细胞培养液与鸡胚背根神经节和交感神经节共培养；⑶贲门癌组织/原代细胞培养液中加入神经生长因子(nerve growth factor，NGF)抗体后与鸡胚背根神经节和交感神经节共培养。结果：⑴贲门癌组织块及原代培养的肿瘤细胞对神经节突起有促生长和诱向作用；⑵肿瘤组织/原代肿瘤细胞培养液也能促使背根神经节和交感神经节长出浓密突起；⑶NGF抗体只能部分阻断这种促神经生长作用。结论：体外培养的贲门癌组织和细胞对神经节突起有促生长和诱向作用，这种作用可能部分与神经生长因子有关。
关键词：贲门癌；神经节，脊；神经节，交感；共培养；神经生长因子
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作者所在实验室在对胃癌、贲门癌、乳腺癌、脑膜瘤等数十种肿瘤进行研究后发现，多种肿瘤组织内都弥散分布有多种神经肽免疫阳性的神经纤维[1，2],这些神经纤维多从肿瘤周围的神经束发出，深入肿瘤组织内部，并与肿瘤细胞密切接触。为此我们推测，可能是肿瘤组织分泌了促神经生长的活性物质，诱使周围正常组织中的神经纤维长入肿瘤组织中的。为探讨肿瘤组织中是否存在促神经生长的活性物质，我们采用贲门癌组织块及原代培养的肿瘤细胞与鸡胚神经节共培养的方法，并用肿瘤组织/细胞条件培养液培养鸡胚神经节，以观察贲门癌组织对神经节突起的生长是否有影响；并通过加入神经生长因子(nerve growth factor,NGF)抗血清阻断的方法，初步探讨肿瘤内影响神经元突起生长的物质的性质。
1 材料与方法
1.1 贲门癌标本的收集与处理
贲门癌标本10例，7例男性，3例女性，年龄46～72岁。均由北京医科大学附属肿瘤医院提供。患者经临床和病理诊断确诊为腺癌。征得患者和家属同意后，将手术取得的癌肿无菌收集于含1 000 U/ml青霉素和1 000 U/ml链霉素的DMEM培养液(高糖，Gibco公司)中，1.5 h内做培养。
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1.2 鸡胚神经节的分离
8～10日龄鸡胚，购于中国农业科学院畜牧所。按文献[3]所述方法，70%酒精消毒蛋壳，气室朝上敲破，取出鸡胚，置于解剖显微镜下，腹侧暴露脊柱，取腰旁交感链及背根神经节，置于盛1 ml DMEM培养液的平皿中；剥除外膜备用。
1.3 贲门癌组织块与背根神经节共培养
肿瘤标本修除周围坏死组织后Hanks液冲洗，剪切成1 mm3大小，与鸡胚背根神经节相距1 mm接种于涂有L-多聚赖氨酸(Sigma公司产品)的24孔板(Coastar公司产品)中共培养。10例标本每例共培养12孔，每孔一对。于饱和湿度的温箱内(37℃，7.5%CO2)孵育。4 h后加无血清的DMEM培养液。对照组用无血清DMEM液培养神经节，每例10孔，每孔一个。24 h后于IX70型倒置显微镜(Olympus公司产品)下观察，计数长出突起的神经节个数。
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1.4 贲门癌原代培养细胞与背根神经节共培养
按组织块培养法，用含4 mmol/L的L-谷氨酰胺，10%FBS(Hyclone公司产品)的DMEM培养液培养肿瘤细胞。收集10例标本中肿瘤细胞生长较旺盛的6例 ，用无血清DMEM液洗涤肿瘤细胞2次，加含4 mmol/L的L-谷氨酰胺的无血清DMEM液，制成原代肿瘤细胞悬液；以5×103的密度与背根神经节在24孔板中混和共培养。每例标本种12孔，每孔1个神经节；对照组取含4 mmol/L L-谷氨酰胺的无血清DMEM液培养神经节，每例10孔，每孔1个。24 h后于倒置显微镜下观察。
1.5 贲门癌组织/细胞培养液培养背根神经节和交感神经节
取培养一周的生长旺盛的贲门癌原代肿瘤细胞无血清培养液，离心后取上清培养鸡胚背根神经节和交感神经节。10例标本每例培养背根节15孔，交感节9孔，每孔各1个，加培养液0.5 ml。对照组10孔神经节用无血清DMEM培养液培养。
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1.6 NGF抗体阻断实验
用1.5的方法制备贲门癌培养液，然后加入NGF抗血清(Boehringer Mannheim公司产品，编号1087754；小鼠多克隆抗体，可与人、大鼠和牛的NGF反应)。根据另一项SDS电泳研究、光密度分析结果，确定加入过量抗血清浓度为100 ng/ml。为保证抗血清足量，另增加200 ng/ml抗血清浓度组。取预先加有NGF抗体的肿瘤培养液500 μl与鸡胚背根神经节和交感神经节在24孔板中共培养。10例标本每例共培养背根节15孔，交感节9孔，每孔1个神经节。对照组：单纯贲门癌组织/细胞培养液培养神经节，数量同实验组。空白对照组：含4 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM液培养神经节，每例10孔，每孔1个。
1.7 统计分析
采用单组设计资料的t检验、配对资料的t检验和具有两个重复测量设计资料的方差分析[4]的统计方法，用SAS统计软件对结果进行分析。
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2 结果
2.1 肿瘤组织块与背根神经节共培养
神经节长出浓密突起，部分神经节长出的突起对肿瘤组织块表现出趋化性。对照组神经节未长出突起。结果见图1、图2和表1。
表1 与肿瘤组织块共培养的背根神经节长出突起的情况
组 别
长出突起的神
经节总数(孔)
未长出突起的神
经节总数(孔)
长出突起的神经节
, http://www.100md.com 百分率(
±s)共培养组
60
29
0.67±0.09***
对照组
0
63
0
*** t=23.36，P<0.0001，说明与肿瘤组织块共培养的神经节中长出突起的神经节百分率与对照组之间的差异有非常显著性意义。其中突起有趋化性的神经节百分率的
±s为0.49±0.11, http://www.100md.com
图1 与贲门癌组织块共培养的背根神经节
(×70，培养48 h)
神经节(G)两端和靠近肿瘤组织块一侧(右侧，照片未显示)可见密集的突起长出，而对侧仅见稀疏而短小的突起。
顶端部分神经纤维呈弯曲状(箭头)向肿瘤组织块位置集中、生长
图2 DMEM培养液中的对照组神经节(×100，培养48 h)
神经节(G)周围未长出突起
2.2 原代培养贲门癌细胞与背根神经节混合共培养
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神经节长出较多突起。结果见图3和表2。
表2 与原代培养贲门癌细胞共培养的背根神经节长出突起的情况
组别
长出突起的神
经节总数(孔)
未长出突起的神
经节总数(孔)
长出突起的神经节
百分率(
±s), 百拇医药
共培养组
43
17
0.70±0.12***
对照组
0
67
0
*** t=14.65，P<0.0001，说明与肿瘤细胞混合共培养的神经节中长出突起的神经节百分率与对照组之间的差异有非常显著性意义
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图3 与贲门癌细胞共培养的背根神经节
(×160，培养24 h)
神经节(G)周围长出较稀疏的神经纤维，有些神经纤维伸向肿瘤细胞(箭头)或小肿瘤组织(三角)
2.3 贲门癌组织/细胞培养液培养交感和感觉神经节
背根节长出浓密突起，交感节突起较长、较稀疏。结果见图4、图5和表3。
图4 贲门癌培养液中的背根神经节(×250，培养24 h)
密集的神经纤维从神经节(G)伸出
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图5 贲门癌培养液中的交感神经节(×80，培养24 h)
较多的突起从神经节(G)发出
表3 贲门癌培养液培养的神经节长出突起的情况
组别
长出突起的神
经节数(孔)
未长出突起的
神经节数(孔)
长出突起的神经节
百分率(
±s), http://www.100md.com
背根节
81
32
0.70±0.13***###
交感节
36
31
0.54±0.12***
对照组
0
65
0
, 百拇医药 *** 长出突起的背根节和交感节的百分率分别与对照组之间比较，t值分别为17.32和14.83，P<0.0001，说明肿瘤培养液中长出突起的背根节和交感节的百分率与对照组之间的差异均有非常显著性意义；
### 长出突起的背根节与交感节百分率之间的比较，t=3.52，P=0.0065<0.01， 说明肿瘤培养液对背根神经节和交感神经节的突起生长的促进作用之间的差异有非常显著性意义，对背根节的作用更强
2.4 NGF抗体阻断实验
NGF抗体组培养的背根节和交感节均有少量突起长出。结果见图6和表4。
图6 NGF抗体组背根神经节(×100，培养48 h)
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加有NGF抗体的贲门癌培养液中神经节(G)周围
长出稀疏而细长的突起
表4 NGF抗体组及贲门癌培养液对照组长出突起的
背根节比例(
±s)组 别
背根神经节
交感神经节
100 ng/mlNGF抗体组
0.49±0.076* ###
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0.44±0.048* ###
200 ng/ml NGF抗体组
0.51±0.061###
0.45±0.066###
单纯贲门癌培养液对照组
0.72±0.067
0.60±0.095
* 两种浓度NGF抗体组背根节之间和交感节之间比较，P均大于0.05；说明两个NGF抗体浓度组作用之间的差异无显著性意义；
### 100 ng/ml和200 ng/ml NGF抗体组分别与贲门癌培养液组背根节之间和交感节之间比较，P均小于0.01；说明两种浓度的NGF抗体组与单纯贲门癌培养液对照组相比，长出突起的背根节及交感节比例的差异均有非常显著性意义
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3 讨论
神经与肿瘤的关系早已为神经学家和肿瘤病理学家所关注[5，6]，但苦于无突破口，这方面的研究一直未有明显进展。近年来，随着神经活性物质，主要是神经肽的发现，又引起了人们探讨神经与肿瘤关系的兴趣。作者所在实验室曾发现包括贲门癌在内的多种肿瘤组织中存在多种肽能神经纤维[1，2]；神经纤维与肿瘤细胞密切接触；与支配肿瘤起源组织的神经纤维相比，肿瘤中神经纤维的化学性质发生明显改变。这些初步研究可能为探讨神经纤维在局部如何影响肿瘤的生长、分化提供了突破口。本实验用肿瘤与神经节共培养的方法，探讨肿瘤与神经相互作用的关系；用贲门癌组织和(或)原代培养细胞及肿瘤培养液与背根神经节和(或)交感神经节共培养，以及加入NGF抗血清的阻断实验，初步探讨肿瘤组织如何影响神经生长，从而为肿瘤组织内神经纤维的来源提供证据。在以前的研究中，不少作者曾经探讨过肿瘤对神经的影响，据我们掌握的文献看，我们是首先将肿瘤组织和(或)原代肿瘤细胞与神经节共培养进行探讨研究的。神经节神经元培养对培养条件要求较苛刻，在无血清培养液中难以生长分化，我们在研究中也得到同样的结论。但是用肿瘤组织或细胞，甚至肿瘤培养液与鸡胚背根神经节和(或)交感神经节共培养，发现肿瘤组织或细胞及肿瘤培养液均能促进神经节突起的生长。据此我们推测，贲门癌组织内确实存在能够影响神经节神经元生长分化的物质。
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在确定贲门癌组织和(或)原代肿瘤细胞甚至培养液能够影响神经节神经元生长分化的基础上，我们还对肿瘤组织如何影响神经节神经元生长进行了探讨。据文献报道，NGF可能是存在于肿瘤组织中的主要促生长物质。NGF最早就是从小鼠肉瘤组织中发现的。近年来又不断在前列腺癌组织中发现有NGF的存在[7]，在胰腺癌中有NT-3的表达[8]等。然而，据我们掌握的文献，尚未有关于贲门癌、胃癌存在NGF 或NGF受体的报告。我们用肿瘤组织或细胞培养液与神经节共培养的方法，证明肿瘤内促神经生长的物质可被分泌到培养液内，进而采用阻断实验，在肿瘤培养液中加入NGF抗血清后再与神经节共培养来探讨肿瘤对神经节突起的促生长作用是否是通过NGF实现的。结果发现，与单纯贲门癌培养液组相比，加入NGF抗血清组对神经节突起生长的影响明显减弱，说明NGF在其中确实起相当作用；但NGF抗血清阻断实验组与无血清DMEM培养液对照组相比也有显著差异，表明NGF抗体只能起到部分阻断作用。在抗体阻断实验组中，加入抗血清浓度100 ng/ml组和200 ng/ml组无任何区别，表明这种部分阻断作用并非由于抗体剂量不足造成，可能除NGF外，癌组织培养液中还存在其他能促神经生长的物质。在对肿瘤组织培养液做SDS电泳中我们也观察到其中存在与NGF相对分子质量相同的条带(待发表)。从这些研究可以推断，肿瘤内的神经纤维可能是受肿瘤分泌的NGF和其他促神经生长物质影响，而从周围正常组织长入肿瘤的。此研究部分解释了我们在另一组实验中发现的肿瘤组织中大量肽能神经纤维的来源。
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除了促进神经生长外，促神经生长物质还能作为促有丝分裂剂促进肿瘤细胞的分裂，如在前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、胰腺癌[11]中；或者抑制增殖，促进分化，如对PC12细胞[12]等。因为肿瘤组织块及原代培养的肿瘤细胞中并非只有单一的肿瘤细胞，贲门癌组织中的促神经生长物质可能由肿瘤细胞或基质细胞分泌，参与调节肿瘤的生长与分化。
[作者简介]吕双红(1972-)，女，甘肃徽县人，第四军医大学硕士生。
吕双红(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
林树新(第四军医大学病理生理学教研室，西安 710032)
周岩(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
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阙海萍(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
胡良平(军事医学科学院情报研究所，北京 100850)
刘少君(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)
参考文献
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[2]刘少君,杨 萍,张世忠等.脑膜瘤内的肽能神经支配[J].第四军医大学学报,1993,14(1):14.
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