HPLC法测定石杉科植物中石杉碱甲的含量
杨明 姚志伟 赵毅民 栾新慧
摘 要 目的：建立用高效液相色谱法(HPLC)测定石杉科植物中石杉碱甲(huperzine A)含量的方法。方法与结果：按照常规的方法提取出石杉总生物碱，用HPLC对总碱直接进行分析。色谱条件如下：Spherisorb C18分析柱，检测波长231.3 nm；甲醇∶水(85∶15,体积分数)作为流动相，流速1 ml/min。外标法测定。该方法的线性范围是0.41～6.15 mg/L；平均加样回收率为99.72%～100.09%。相对标准差为0.33%～0.45%。结论：建立了用HPLC测定石杉科植物中石杉碱甲含量的方法，该方法快速、灵敏、准确。
关键词：石杉碱甲；色谱法，高效液相；含量测定
, 百拇医药
石杉碱甲(huperzine A)是由徐择邻等于1985年从蕨类植物——石杉科(Huperziaceae)马尾杉属(Phlegmariurus)的华南马尾杉[P.fordii(Baker) Cheing]中首次分离得到[1]。它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂[2]，对重症肌无力、记忆力减退和老年性痴呆具有较好的效果[3]。石杉碱甲的片剂已通过卫生部审批上市。石杉科植物有5个属26个种，我国除了华南马尾杉外，还有蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb)]、长柄石杉[H.longipetiontata(Spring)]、中间石杉[H.serrata f.intermedia (Nakai)]、长白山石杉[H.luciduca var.asiatica Ching]、四川石杉[H.sutchueniana (Herter)]、湖北石杉[H.hupehensis Ching]、闽浙马尾杉[P.mingcheensis Ching]、广东马尾杉[P.guangdongensis Ching]、马尾杉[P.phlegmaria (Linn.) Hulod]、狭叶马尾杉[P.mingcheensis var.angustifolius C.Y.Ma]、龙岩马尾杉[P.longyanensis C.Y.Ma]、矮小马尾杉[P.nanus C.Y.Ma]等13种。从我们的研究结果看，我国的上述植物基本都含有石杉碱甲，它们均是石杉碱甲的药物资源。但以蛇足石杉含量和蕴藏量相对较多。
, 百拇医药
由于蕨类植物生长缓慢，繁殖困难，造成了石杉碱甲的原料药价格昂贵，因此，建立一个石杉碱甲含量的快速检测方法很有必要。本文研究了用高效液相色谱法(HPLC)测定蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法。我们首先用石杉碱甲标准品建立分析方法；然后按照常规方法从蛇足石杉中提取出总生物碱，并在HPLC中确定石杉碱甲峰，同时分析总生物碱中石杉碱甲的含量，进而确定被测定植物中石杉碱甲的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪：美国 SP-100泵；SP-200紫外检测器；SP-4600积分仪。
1.2 试剂及样品
甲醇为北京化学试剂厂产品，分析纯；标准品石杉碱甲及石杉总生物碱均由本室提供，主要是由蛇足石杉、华南马尾衫和闽浙马尾杉等石杉混合品按照常规方法提取而成。
, http://www.100md.com
2 测定条件及方法
2.1 色谱条件
色谱柱：C18，5 μm，4.6 mm×250 mm(Microsorb-MVTM);流动相：甲醇∶水(85∶15)；流速：1 ml/min 。
2.2 检测波长的确定
石杉碱甲紫外静态扫描有三条谱带(图1)，分别是λ1=201.3 nm ,λ2=231.3 nm,λmax=312.7 nm。在此HPLC系统中，用λ1紫外检测基线不稳定；用λmax则有其他杂峰的干扰，我们选定231.3 nm为检测波长。
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图1 石杉碱甲标准品紫外扫描图谱
2.3 计算方法
按照下列公式计算：
X=Ai/Ax (Cs.Vi/Wi).100%
式中：X——石杉碱甲的含量(%); Ai——被测样品的峰面积;Ax——被测标准品的峰面积;Cs——标准品浓度(mg /ml);Vi——被测样品定溶体积(ml); Wi——被测样品质量(mg )。
2.4 标准品的配制
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精密称取石杉碱甲标准品20.50 mg,溶解于0.02 mol/L的盐酸水溶液中并定容于100 ml(为备用液)。
3 方法学考察
3.1 线性关系的考察
以外标法定量。分别取备用液2.0，4.0，6.0，10.0，15.0，20.0及30.0 ml置于50 ml容量瓶中，并用流动相稀释至刻度。分别进样同体积测定积分面积，记录并储存色谱图。以石杉碱甲的峰面积Y为纵坐标，对进样量X为横坐标进行回归，得到线性回归方程：Y =920699X+1448，r=0.999 8。其线性范围在0.410～6.150 mg/L之间。数据见表1。
表1 石杉碱甲校正曲线的数据
样品量(m/μg)
, 百拇医药 峰面积
CV(%)
0.410 0
381 335
4.27
0.820 0
754 032
0.92
2.300 0
1 137 853
0.95
2.050 0
1 880 634
, 百拇医药
1.81
3.075 0
2 821 824
0.27
4.100 0
3 769 948
0.31
6.150 0
5 642 586
1.30
n=3
3.2 精密度实验
, http://www.100md.com
按照上述方法、步骤进行操作，测得该方法的日内精密度及日间精密度(表2、3)。
表2 石杉碱甲日内精密度结果
进样浓度
(ρB/mg.ml-1)
实测浓度
(ρB/mg.ml-1)
RSD
(%)
CV
(%)
, 百拇医药
0.410 0
0.415 5
1.89
4.55
1.230 0
1.217 8
1.44
1.17
2.050 0
2.041 1
4.54
2.22
3.075 0
, http://www.100md.com
3.074 6
2.66
0.86
6.150 0
6.119 8
0.56
0.09
n=3表3 石杉碱甲日间精密度结果
进样浓度
(ρB/mg.ml-1)
实测量浓度
, 百拇医药 (ρB/mg.*ml-1)
RSD
(%)
CV
(%)
0.615 0
0.608 1
1.08
1.78
0.820 0
0.817 4
0.75
, http://www.100md.com
0.92
1.025 0
1.022 7
1.02
1.00
4.100 0
4.092 9
1.54
0.38
n=3
3.3 加样回收率实验
结果见表4。
, 百拇医药 表4 石杉碱甲加样回收率结果
样品浓度
(mg.ml-1)
标准品浓度
(mg.ml-1)
测得浓度
(mg.ml-1)
回收率
(%)
RSD
(%)
, http://www.100md.com
3.386 7
2.000 0
3.382 0
99.88
0.33
5.568 3
3.000 0
5.563 3
100.09
0.41
6.312 4
4.000 0
, http://www.100md.com
6.294 7
99.72
0.45
4 石杉总生物碱样品的测定
4.1 石杉碱甲峰的确定
在石杉总生物碱中，有50多个生物碱成分。确定总碱在此HPLC系统中的石杉碱甲，则是含量测定的基础。我们经过正向柱(SiO2)、反相柱(C18)与不同的检测波长、不同的流动相、石杉碱甲峰的动态和静态扫描比较等，确定了石杉总生物碱中的石杉碱甲峰(图2)。在反相柱条件下，石杉碱甲峰的保留时间是tR=6.95 min ,紫外动态扫描吸收波长λ2=231.3 nm ,与石杉碱甲标准品的静态扫描的紫外吸收波长λ2=231.3 nm 完全一致，从而确定了此系统中的石杉碱甲峰。
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图2 石杉总生物碱HPLC图谱
4.2 保留时间
在该HPLC系统中，石杉总生物碱中的石杉碱甲峰的保留时间是tR=(6.96±0.12 )min，n=20。
4.3 待分析样品的处理
分别取批号9501,9502,9503,9504和9505的石杉总生物碱50 mg，放入60℃烘箱中恒重24 h。然后分别称取石杉总生物碱9501批20.00 mg，9502批12.2 mg，9503批7.50 mg，9504批10.70 mg和9505批17.21 mg，分别置于10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，备用。
4.4 样品的测定
按照标准曲线的方法进行含量测定。结果见表5。样品放置一周后再次测定含量没有变化，说明石杉碱甲在此体系中较为稳定。
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表5 总碱中石杉碱甲的含量
批
石杉碱甲在总
总碱在植物中
石杉碱甲在植
号
碱中含量(%)
的提取率(%)
物中含量(%)
9501
14.67
0.11
0.016
, 百拇医药
9502
3.38
0.18
0.006
9503
6.20
0.48
0.030
9504
6.89
0.33
0.022
9505
, 百拇医药
2.86
0.42
0.120
6 讨论
我们建立了用HPLC反相柱从石杉总碱中直接测定石杉碱甲的方法，该方法线性与精密度良好，平均回收率为99.89%,平均RSD为 0.40% 。用此方法测定了5批石杉总碱样品，重复性好。该数据的可靠性，在生产石杉碱甲的工作中得到了证实。
从石杉碱甲原植物中提取总生物碱，是一个常规和稳定的方法。通过测定总碱中石杉碱甲的含量，便可以推算出原植物中石杉碱甲的含量。该方法已经成为检定原植物的方法并应用于工作中。
[作者简介]杨明(1958-)，男，河北秦皇岛人，实验师，硕士。
, 百拇医药 杨明(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
姚志伟(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
赵毅民(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
栾新慧(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
参考文献
[1]徐择邻,储宾孟,栾新慧.福定碱的结构测定[J].解放军医学杂志 1985；10：263.
[2]王月娥.石杉碱甲的抗胆碱酯酶的作用[J].中国药理学报 1986；7(17)：110.
[3]程源深,吕传真,应智林.石杉碱甲治疗重症肌无力症候28例[J].新药与临床 1986；5(4)：197., http://www.100md.com
摘 要 目的：建立用高效液相色谱法(HPLC)测定石杉科植物中石杉碱甲(huperzine A)含量的方法。方法与结果：按照常规的方法提取出石杉总生物碱，用HPLC对总碱直接进行分析。色谱条件如下：Spherisorb C18分析柱，检测波长231.3 nm；甲醇∶水(85∶15,体积分数)作为流动相，流速1 ml/min。外标法测定。该方法的线性范围是0.41～6.15 mg/L；平均加样回收率为99.72%～100.09%。相对标准差为0.33%～0.45%。结论：建立了用HPLC测定石杉科植物中石杉碱甲含量的方法，该方法快速、灵敏、准确。
关键词：石杉碱甲；色谱法，高效液相；含量测定
, 百拇医药
石杉碱甲(huperzine A)是由徐择邻等于1985年从蕨类植物——石杉科(Huperziaceae)马尾杉属(Phlegmariurus)的华南马尾杉[P.fordii(Baker) Cheing]中首次分离得到[1]。它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂[2]，对重症肌无力、记忆力减退和老年性痴呆具有较好的效果[3]。石杉碱甲的片剂已通过卫生部审批上市。石杉科植物有5个属26个种，我国除了华南马尾杉外，还有蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb)]、长柄石杉[H.longipetiontata(Spring)]、中间石杉[H.serrata f.intermedia (Nakai)]、长白山石杉[H.luciduca var.asiatica Ching]、四川石杉[H.sutchueniana (Herter)]、湖北石杉[H.hupehensis Ching]、闽浙马尾杉[P.mingcheensis Ching]、广东马尾杉[P.guangdongensis Ching]、马尾杉[P.phlegmaria (Linn.) Hulod]、狭叶马尾杉[P.mingcheensis var.angustifolius C.Y.Ma]、龙岩马尾杉[P.longyanensis C.Y.Ma]、矮小马尾杉[P.nanus C.Y.Ma]等13种。从我们的研究结果看，我国的上述植物基本都含有石杉碱甲，它们均是石杉碱甲的药物资源。但以蛇足石杉含量和蕴藏量相对较多。
, 百拇医药
由于蕨类植物生长缓慢，繁殖困难，造成了石杉碱甲的原料药价格昂贵，因此，建立一个石杉碱甲含量的快速检测方法很有必要。本文研究了用高效液相色谱法(HPLC)测定蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法。我们首先用石杉碱甲标准品建立分析方法；然后按照常规方法从蛇足石杉中提取出总生物碱，并在HPLC中确定石杉碱甲峰，同时分析总生物碱中石杉碱甲的含量，进而确定被测定植物中石杉碱甲的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪：美国 SP-100泵；SP-200紫外检测器；SP-4600积分仪。
1.2 试剂及样品
甲醇为北京化学试剂厂产品，分析纯；标准品石杉碱甲及石杉总生物碱均由本室提供，主要是由蛇足石杉、华南马尾衫和闽浙马尾杉等石杉混合品按照常规方法提取而成。
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2 测定条件及方法
2.1 色谱条件
色谱柱：C18，5 μm，4.6 mm×250 mm(Microsorb-MVTM);流动相：甲醇∶水(85∶15)；流速：1 ml/min 。
2.2 检测波长的确定
石杉碱甲紫外静态扫描有三条谱带(图1)，分别是λ1=201.3 nm ,λ2=231.3 nm,λmax=312.7 nm。在此HPLC系统中，用λ1紫外检测基线不稳定；用λmax则有其他杂峰的干扰，我们选定231.3 nm为检测波长。
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图1 石杉碱甲标准品紫外扫描图谱
2.3 计算方法
按照下列公式计算：
X=Ai/Ax (Cs.Vi/Wi).100%
式中：X——石杉碱甲的含量(%); Ai——被测样品的峰面积;Ax——被测标准品的峰面积;Cs——标准品浓度(mg /ml);Vi——被测样品定溶体积(ml); Wi——被测样品质量(mg )。
2.4 标准品的配制
, http://www.100md.com
精密称取石杉碱甲标准品20.50 mg,溶解于0.02 mol/L的盐酸水溶液中并定容于100 ml(为备用液)。
3 方法学考察
3.1 线性关系的考察
以外标法定量。分别取备用液2.0，4.0，6.0，10.0，15.0，20.0及30.0 ml置于50 ml容量瓶中，并用流动相稀释至刻度。分别进样同体积测定积分面积，记录并储存色谱图。以石杉碱甲的峰面积Y为纵坐标，对进样量X为横坐标进行回归，得到线性回归方程：Y =920699X+1448，r=0.999 8。其线性范围在0.410～6.150 mg/L之间。数据见表1。
表1 石杉碱甲校正曲线的数据
样品量(m/μg)
, 百拇医药 峰面积
CV(%)
0.410 0
381 335
4.27
0.820 0
754 032
0.92
2.300 0
1 137 853
0.95
2.050 0
1 880 634
, 百拇医药
1.81
3.075 0
2 821 824
0.27
4.100 0
3 769 948
0.31
6.150 0
5 642 586
1.30
n=3
3.2 精密度实验
, http://www.100md.com
按照上述方法、步骤进行操作，测得该方法的日内精密度及日间精密度(表2、3)。
表2 石杉碱甲日内精密度结果
进样浓度
(ρB/mg.ml-1)
实测浓度
(ρB/mg.ml-1)
RSD
(%)
CV
(%)
, 百拇医药
0.410 0
0.415 5
1.89
4.55
1.230 0
1.217 8
1.44
1.17
2.050 0
2.041 1
4.54
2.22
3.075 0
, http://www.100md.com
3.074 6
2.66
0.86
6.150 0
6.119 8
0.56
0.09
n=3表3 石杉碱甲日间精密度结果
进样浓度
(ρB/mg.ml-1)
实测量浓度
, 百拇医药 (ρB/mg.*ml-1)
RSD
(%)
CV
(%)
0.615 0
0.608 1
1.08
1.78
0.820 0
0.817 4
0.75
, http://www.100md.com
0.92
1.025 0
1.022 7
1.02
1.00
4.100 0
4.092 9
1.54
0.38
n=3
3.3 加样回收率实验
结果见表4。
, 百拇医药 表4 石杉碱甲加样回收率结果
样品浓度
(mg.ml-1)
标准品浓度
(mg.ml-1)
测得浓度
(mg.ml-1)
回收率
(%)
RSD
(%)
, http://www.100md.com
3.386 7
2.000 0
3.382 0
99.88
0.33
5.568 3
3.000 0
5.563 3
100.09
0.41
6.312 4
4.000 0
, http://www.100md.com
6.294 7
99.72
0.45
4 石杉总生物碱样品的测定
4.1 石杉碱甲峰的确定
在石杉总生物碱中，有50多个生物碱成分。确定总碱在此HPLC系统中的石杉碱甲，则是含量测定的基础。我们经过正向柱(SiO2)、反相柱(C18)与不同的检测波长、不同的流动相、石杉碱甲峰的动态和静态扫描比较等，确定了石杉总生物碱中的石杉碱甲峰(图2)。在反相柱条件下，石杉碱甲峰的保留时间是tR=6.95 min ,紫外动态扫描吸收波长λ2=231.3 nm ,与石杉碱甲标准品的静态扫描的紫外吸收波长λ2=231.3 nm 完全一致，从而确定了此系统中的石杉碱甲峰。
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图2 石杉总生物碱HPLC图谱
4.2 保留时间
在该HPLC系统中，石杉总生物碱中的石杉碱甲峰的保留时间是tR=(6.96±0.12 )min，n=20。
4.3 待分析样品的处理
分别取批号9501,9502,9503,9504和9505的石杉总生物碱50 mg，放入60℃烘箱中恒重24 h。然后分别称取石杉总生物碱9501批20.00 mg，9502批12.2 mg，9503批7.50 mg，9504批10.70 mg和9505批17.21 mg，分别置于10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，备用。
4.4 样品的测定
按照标准曲线的方法进行含量测定。结果见表5。样品放置一周后再次测定含量没有变化，说明石杉碱甲在此体系中较为稳定。
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表5 总碱中石杉碱甲的含量
批
石杉碱甲在总
总碱在植物中
石杉碱甲在植
号
碱中含量(%)
的提取率(%)
物中含量(%)
9501
14.67
0.11
0.016
, 百拇医药
9502
3.38
0.18
0.006
9503
6.20
0.48
0.030
9504
6.89
0.33
0.022
9505
, 百拇医药
2.86
0.42
0.120
6 讨论
我们建立了用HPLC反相柱从石杉总碱中直接测定石杉碱甲的方法，该方法线性与精密度良好，平均回收率为99.89%,平均RSD为 0.40% 。用此方法测定了5批石杉总碱样品，重复性好。该数据的可靠性，在生产石杉碱甲的工作中得到了证实。
从石杉碱甲原植物中提取总生物碱，是一个常规和稳定的方法。通过测定总碱中石杉碱甲的含量，便可以推算出原植物中石杉碱甲的含量。该方法已经成为检定原植物的方法并应用于工作中。
[作者简介]杨明(1958-)，男，河北秦皇岛人，实验师，硕士。
, 百拇医药 杨明(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
姚志伟(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
赵毅民(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
栾新慧(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
参考文献
[1]徐择邻,储宾孟,栾新慧.福定碱的结构测定[J].解放军医学杂志 1985；10：263.
[2]王月娥.石杉碱甲的抗胆碱酯酶的作用[J].中国药理学报 1986；7(17)：110.
[3]程源深,吕传真,应智林.石杉碱甲治疗重症肌无力症候28例[J].新药与临床 1986；5(4)：197., http://www.100md.com