免疫荧光法快速检验伯氏柯克斯体的研究
崔红 张雪颖 宫占威 程聪 陈香蕊
关键词：柯克斯体，伯氏；荧光免疫测定；快速免疫法
伯氏柯克斯体(Coxiella burnetii)习惯上称为Q热立克次体，它所引起的Q热是一种人兽共患病。Q热临床表现多以发热、头痛、肌肉酸痛为主, 与其他热性疾病难以鉴别，极易造成误诊。因此，快速检验并鉴定Q热立克次体，是防治Q热的重要环节。通常，实验室对送检的可疑标本做吉姆萨染色，但该法是非特异性的染色方法，难以即时作出判断。为此，本实验室建立了免疫荧光直接检测病原体的方法，并尝试用微波促抗原抗体反应进行快速染色的方法，可以在15 min之内得出初步诊断报告。本方法为研制鉴定Q热立克次体的标准化免疫诊断试剂盒奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
实验所用标准株为C.burnetii(Henzerling-I，七医株II相)，参照株为Rickettsia typhi(Wilmington)，R.canada(C11)，R.sibirica(STT 246)， R.conorii(Simko)，R.montana(BSTR)， R.parkeri(SF110)，R.akari(Kaplan)， R.helongjiangii(054)，R.tsutsugamushi(Karp)，均由WHO提供，在本室长期以鸡胚传代保存。上海种小鼠购自本院实验动物中心，雌性，平均体重16～18 g。鸡胚(7日龄)购自华丰养鸡场。羊抗鼠荧光抗体由本所提供。BX-60荧光显微镜为欧林帕斯公司产品。微波炉为韩国三星公司产品。
1.2 抗原和抗血清制备
鸡胚或细胞传代培养物经吉姆萨染色，立克次体繁殖量在以上者，研磨后制成10%悬液，即为抗原。按常规免疫小鼠，制备抗血清。
, 百拇医药
1.3 常规和微波荧光免疫方法检测病原体的比较
同时采用常规温箱孵育和微波促抗原抗体反应两种方案，并比较结果。待检抗原滴或涂片，同时设阳性对照(已知Q热立克次体抗原)，阴性对照(未感染Q热的同种培养物)，经微波固定1 min，加Q热免疫血清(1∶80)。常规法37℃，孵育30 min；微波法以20%火力加热5 min。PBS或水冲洗3 min，吹干后加二抗，同上孵育或加热。冲洗和吹干后，荧光镜检。
1.4 特异性测定
所制备的Q热立克次体小鼠免疫血清作为一抗和下列各参照株R.prowazekii(E)，R.typhi(Wilmington)，R.rickettsii(R)，R.canada(C11)，R.sibirica(STT 246)，R.conorii(Simko)，R.montana(BSTR)，R.parkeri(SF110)，R.akari(Kaplan)，R.helongjiangii(054)，R.tsutsugamushi(Karp)抗原反应，同时采用微波法和常规法观察Q热抗血清与这些立克次体交叉反应情况。
, 百拇医药
1.5 敏感性测定
两种免疫荧光方法与吉姆萨法同时比较。将Q热立克次体卵膜悬液稀释为10-1至10-8；涂片进行IFA和吉姆萨染色；同时将同样材料0.5 ml接种鸡胚，每个稀释度接种4枚，6 d后观察鸡胚死亡情况；按R-M氏公式计算不同稀释度所含感染剂量；以鸡胚半数致死(CELD50)为计算单位确定IFA法的敏感性。
1.6 人工感染动物检测
用已知浓度的Q热立克次体感染小鼠36只，于24，48，72，96，120，144 h解剖，每次6只；分别取脾脏和血液进行IFA染色，观察IFA法最早检测出感染动物中立克次体的时间。
1.7 人工模拟标本检测
不同浓度的Q热立克次体，加入灭菌牛奶(Q热)、小鼠脏器研磨液、蜱组织研磨液、小鼠血液中；取其沉淀物涂片，进行IFA染色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 抗原和抗血清制备
冻干保存的C.burnetii(Henzerling-I) Ep29，经接种鸡胚，连续传至Ep33时，繁殖量经吉姆萨法检测达到，可作为抗原和下述各项实验用。制备的抗血清经测定效价为1∶5 120, 工作浓度1∶ 80或1∶160。
2.2 常规和微波法的比较
两法均可成功检测到所制备的抗原中的Q热立克次体。相同工作浓度免疫血清染色，常规法要比微波法的背景清晰，非特异反应少，而微波法则相对较多。但微波法速度快，仅需15 min就可以观察结果，而常规法则需要1.5 h左右。
2.3 特异性反应测定
本实验所用Q热立克次体的抗血清与立克次体族中的立克次体属和东方体属均无交叉反应，仅能特异检测出Q热立克次体。常规法和微波法结果一致。
, 百拇医药
2.4 敏感性反应测定
测定的CELD50为10-5。常规法和微波法所测得敏感性相同，均为1个CELD50。吉姆萨法的敏感性为10个CELD50。
2.5 人工动物感染标本检测
在以10 000个CELD50立克次体感染小鼠的脾印片中，在感染后第48小时可检出立克次体，检出阳性率为50%(3/6)，第72小时检出阳性率为83.3%(5/6)。
2.6 人工模拟标本检测
两种IFA法对模拟标本检测的敏感性均下降，且对不同模拟标本敏感性不同。其中对牛奶、脏器标本可检出1 000个CELD50的立克次体，对血液标本可检出100个CELD50的立克次体。蜱组织研磨液因非特异反应较多，不适用于做IFA法标本，应取用蜱血淋巴进行涂片染色。
, 百拇医药
3 讨论
免疫荧光技术是用于立克次体检验、鉴定的一种较成熟方法。一般用于检测特异性抗体，达不到早期诊断的目的[1]。我们尝试用免疫荧光技术来检测Q热病原体，并初次报道了用微波促抗原抗体反应的快速免疫荧光方法，该方法大大加快了反应速度，缩短了反应时间，可在15 min内得出结果，非常适于Q热立克次体的快速检验。
微波促抗原抗体反应的免疫荧光方法，已在本实验室多种立克次体中如斑点热群、斑疹伤寒群、恙虫病、Q热等进行了实验，取得了较好的效果，而且操作简便，省时省力，实用性强。从本实验的结果看，其敏感性和特异性与常规法没有区别，唯一需要注意的是在镜下，其非特异的荧光本底高于常规法，需要训练有素的专业人员进行观察并判断结果。
[作者简介] 崔红(1966-)，女，陕西蓝田人，博士，助理研究员。
崔红(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
, 百拇医药
张雪颖(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
宫占威(兰州军区后勤部军事医学研究所，兰州 730020)
程聪(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
陈香蕊(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
参考文献
[1] Scola BL, Raoult D. Laboratory diagnosis of rickettsiosis: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases[J]. J Clin Microbiol, 1997, 35(11): 2715., 百拇医药
关键词：柯克斯体，伯氏；荧光免疫测定；快速免疫法
伯氏柯克斯体(Coxiella burnetii)习惯上称为Q热立克次体，它所引起的Q热是一种人兽共患病。Q热临床表现多以发热、头痛、肌肉酸痛为主, 与其他热性疾病难以鉴别，极易造成误诊。因此，快速检验并鉴定Q热立克次体，是防治Q热的重要环节。通常，实验室对送检的可疑标本做吉姆萨染色，但该法是非特异性的染色方法，难以即时作出判断。为此，本实验室建立了免疫荧光直接检测病原体的方法，并尝试用微波促抗原抗体反应进行快速染色的方法，可以在15 min之内得出初步诊断报告。本方法为研制鉴定Q热立克次体的标准化免疫诊断试剂盒奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
实验所用标准株为C.burnetii(Henzerling-I，七医株II相)，参照株为Rickettsia typhi(Wilmington)，R.canada(C11)，R.sibirica(STT 246)， R.conorii(Simko)，R.montana(BSTR)， R.parkeri(SF110)，R.akari(Kaplan)， R.helongjiangii(054)，R.tsutsugamushi(Karp)，均由WHO提供，在本室长期以鸡胚传代保存。上海种小鼠购自本院实验动物中心，雌性，平均体重16～18 g。鸡胚(7日龄)购自华丰养鸡场。羊抗鼠荧光抗体由本所提供。BX-60荧光显微镜为欧林帕斯公司产品。微波炉为韩国三星公司产品。
1.2 抗原和抗血清制备
鸡胚或细胞传代培养物经吉姆萨染色，立克次体繁殖量在以上者，研磨后制成10%悬液，即为抗原。按常规免疫小鼠，制备抗血清。
, 百拇医药
1.3 常规和微波荧光免疫方法检测病原体的比较
同时采用常规温箱孵育和微波促抗原抗体反应两种方案，并比较结果。待检抗原滴或涂片，同时设阳性对照(已知Q热立克次体抗原)，阴性对照(未感染Q热的同种培养物)，经微波固定1 min，加Q热免疫血清(1∶80)。常规法37℃，孵育30 min；微波法以20%火力加热5 min。PBS或水冲洗3 min，吹干后加二抗，同上孵育或加热。冲洗和吹干后，荧光镜检。
1.4 特异性测定
所制备的Q热立克次体小鼠免疫血清作为一抗和下列各参照株R.prowazekii(E)，R.typhi(Wilmington)，R.rickettsii(R)，R.canada(C11)，R.sibirica(STT 246)，R.conorii(Simko)，R.montana(BSTR)，R.parkeri(SF110)，R.akari(Kaplan)，R.helongjiangii(054)，R.tsutsugamushi(Karp)抗原反应，同时采用微波法和常规法观察Q热抗血清与这些立克次体交叉反应情况。
, 百拇医药
1.5 敏感性测定
两种免疫荧光方法与吉姆萨法同时比较。将Q热立克次体卵膜悬液稀释为10-1至10-8；涂片进行IFA和吉姆萨染色；同时将同样材料0.5 ml接种鸡胚，每个稀释度接种4枚，6 d后观察鸡胚死亡情况；按R-M氏公式计算不同稀释度所含感染剂量；以鸡胚半数致死(CELD50)为计算单位确定IFA法的敏感性。
1.6 人工感染动物检测
用已知浓度的Q热立克次体感染小鼠36只，于24，48，72，96，120，144 h解剖，每次6只；分别取脾脏和血液进行IFA染色，观察IFA法最早检测出感染动物中立克次体的时间。
1.7 人工模拟标本检测
不同浓度的Q热立克次体，加入灭菌牛奶(Q热)、小鼠脏器研磨液、蜱组织研磨液、小鼠血液中；取其沉淀物涂片，进行IFA染色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 抗原和抗血清制备
冻干保存的C.burnetii(Henzerling-I) Ep29，经接种鸡胚，连续传至Ep33时，繁殖量经吉姆萨法检测达到，可作为抗原和下述各项实验用。制备的抗血清经测定效价为1∶5 120, 工作浓度1∶ 80或1∶160。
2.2 常规和微波法的比较
两法均可成功检测到所制备的抗原中的Q热立克次体。相同工作浓度免疫血清染色，常规法要比微波法的背景清晰，非特异反应少，而微波法则相对较多。但微波法速度快，仅需15 min就可以观察结果，而常规法则需要1.5 h左右。
2.3 特异性反应测定
本实验所用Q热立克次体的抗血清与立克次体族中的立克次体属和东方体属均无交叉反应，仅能特异检测出Q热立克次体。常规法和微波法结果一致。
, 百拇医药
2.4 敏感性反应测定
测定的CELD50为10-5。常规法和微波法所测得敏感性相同，均为1个CELD50。吉姆萨法的敏感性为10个CELD50。
2.5 人工动物感染标本检测
在以10 000个CELD50立克次体感染小鼠的脾印片中，在感染后第48小时可检出立克次体，检出阳性率为50%(3/6)，第72小时检出阳性率为83.3%(5/6)。
2.6 人工模拟标本检测
两种IFA法对模拟标本检测的敏感性均下降，且对不同模拟标本敏感性不同。其中对牛奶、脏器标本可检出1 000个CELD50的立克次体，对血液标本可检出100个CELD50的立克次体。蜱组织研磨液因非特异反应较多，不适用于做IFA法标本，应取用蜱血淋巴进行涂片染色。
, 百拇医药
3 讨论
免疫荧光技术是用于立克次体检验、鉴定的一种较成熟方法。一般用于检测特异性抗体，达不到早期诊断的目的[1]。我们尝试用免疫荧光技术来检测Q热病原体，并初次报道了用微波促抗原抗体反应的快速免疫荧光方法，该方法大大加快了反应速度，缩短了反应时间，可在15 min内得出结果，非常适于Q热立克次体的快速检验。
微波促抗原抗体反应的免疫荧光方法，已在本实验室多种立克次体中如斑点热群、斑疹伤寒群、恙虫病、Q热等进行了实验，取得了较好的效果，而且操作简便，省时省力，实用性强。从本实验的结果看，其敏感性和特异性与常规法没有区别，唯一需要注意的是在镜下，其非特异的荧光本底高于常规法，需要训练有素的专业人员进行观察并判断结果。
[作者简介] 崔红(1966-)，女，陕西蓝田人，博士，助理研究员。
崔红(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
, 百拇医药
张雪颖(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
宫占威(兰州军区后勤部军事医学研究所，兰州 730020)
程聪(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
陈香蕊(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 100071)
参考文献
[1] Scola BL, Raoult D. Laboratory diagnosis of rickettsiosis: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases[J]. J Clin Microbiol, 1997, 35(11): 2715., 百拇医药