Northern印迹杂交检测胃癌组织中uPA和uPAR mRNA表达及其意义
杨春花 谷志远 郝好杰 李琦
摘 要：目的：检测胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPAR mRNA表达水平，并探讨它们与胃癌的侵袭、转移之间的关系。方法：运用cDNA-mRNA Northern印迹杂交方法定性和定量地检测了 20 例胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPAR mRNA的表达水平。结果：在检测的20例胃癌组织中分别有 13 例uPA和 15 例uPAR mRNA表达显著高于相应的癌旁组织 (P<0.01)，其中12例uPA和uPAR mRNA协同高于相应癌旁组织；11例伴有淋巴结转移的胃癌组织中uPA和uPAR mRNA表达水平显著高于 9 例无淋巴结转移者。结论：uPA、uPAR mRNA在胃癌组织中表达增强，并且与胃癌侵袭、转移密切相关。
关键词：尿激酶型纤溶酶原激活剂；受体；表达；胃癌；杂交
肿瘤侵袭和转移是一个涉及到多因素、多步骤的复杂过程，肿瘤细胞分泌多种蛋白酶，降解胞外基质，是肿瘤侵袭和转移的首要步骤和分子基础。肿瘤细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator, uPA)与其特异性受体(uPAR)结合后，降解肿瘤细胞外基质和基底膜成分，在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，如何阻断胃癌细胞的浸润和转移，一直是人们研究的重点。已有大量研究表明，多种肿瘤的恶性程度、预后及转移能力与uPA及uPA表达水平密切相关[1～2]。本研究从基因转录水平运用cDNA-mRNA Northen印迹杂交方法定性和定量地检测了20例胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPARmRNA的表达水平，并分析临床意义。
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1 材料和方法
1.1 标本采集 20例胃癌和相应癌旁组织(距癌组织5～10cm)均取自解放军总医院1995年8月至1996年8月间外科手术切除标本，按《第一届全国胃癌协作会议》通过的胃癌分期标准，采集的标本立即置液氮中冷冻保存，全部经病理组织学确诊。
1.2 探针制备 uPA和uPARcDNA探针来自载有人uPAcDNA387bpAccⅠ-BgLⅡ片段的PGEM-4Z重组质粒和载有人uPARcDNA585bpBamHⅠ片段的PGEM-3Z重组质粒(澳大利亚国立大学王耀教授惠赠)。β-acincDNA探针(1.0kb)购于华美生物工程公司。采用随机引物法(Promaga试剂盒)，用[α-32P]dCTP(北京市亚辉生物医学工程公司)标记探针。
1.3 组织总RNA提取 采用异硫氰酸胍一步法提取全部胃癌和癌旁组织总RNA[3]。RNA纯度为：OD260/OD280>1.8。
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1.4 Northern印迹杂交 将提取的胃癌和相应的癌旁组织总RNA30μg通过1%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离，吸印转移到尼龙膜上，于80℃干烤2h，按Sambrook等[4]的方法进行预杂交、杂交、洗膜及放射自显影，放射自显影底片通过QTM970计算机图像分析仪扫描得到每个样品的积分光密度值(IOD值)。
1.5 统计学方法 采用Student′t检验判断显著性。
2 结 果
2.1 总RNA鉴定 选取部分胃癌和癌旁组织中提取的总RNA进行了琼脂糖凝胶电泳和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，RNA呈三条明显带，分别代表28s、18s和5srRNA，表明我们提取的RNA质量符合要求，可用于Northern印迹杂交实验(图1)。
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图1 组织总RNA鉴定电泳
上图：1%琼脂糖凝胶电泳；下图：1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
2.2 Norther印迹杂交结果 提取的组织总RNA，运用uPA、uPARcDMA探针进行cDNA-mRNANorthern印迹杂交，并采用β-actin探针作为内标校正加样量的误差。依据公式计算胃癌和癌旁组织中uPA和uPARmRNA表达差异。结果显示，在20例胃癌组织中，有13例(占65.0%)uPARmRNA表达高于癌旁组织，平均高4.2倍。15例(占75.0%)uPARmRNA表达高于癌旁组织，平均高5.6倍(图2)；出现uPA、uPARmRNA高表达的胃癌组织中有12例二者协同高表达，其中11例伴有淋巴结转移。在这11例伴有淋巴结转移的胃癌组织中，uPA和uPARmRNA表达水平均显著高于9例无淋巴结转移者，其中uPA平均高4.7倍(P<0.05)，uPAR平均高6.3倍(P<0.01)。
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图2 uPA和uPARmRNANorthern杂交
T.胃癌组织；N.相应癌旁组织
3 讨 论
目前各国学者对多种人类恶性肿瘤与uPA/uPAR系统的相关性进行了研究，其中包括肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤、黑色素瘤、恶性胶质瘤以及一些肿瘤细胞系[5]。研究结果显示，uPA/uPAR系统不仅参与了肿瘤的形成，而且在肿瘤的侵袭和转移中扮演着重要角角。
本研究通过Northern印迹杂交方法检测20例胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPARmRNA表达水平。结果，胃癌和癌旁组织均出现单一转录带，转录带长度分别为2.5kb和1.4kb，符合文献报道的uPA和uPARmRNA分子量大小，表明该杂交检出的uPA和uPARmRNA是特异的。
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在被检测的20例胃癌及相应癌旁组织中，分别有13例和15例uPA、uPARmRNA表达水平均明显高于其相应的癌旁组织。其它学者利用ELISA和免疫组织化学方法检测uPA、uPAR蛋白表达水平时，亦发现癌中心、癌边缘和正常组织中uPA、uPAR蛋白活性逐渐减低，这与本研究得到的结果基本相一致[6～7]。这说明随着细胞恶性程度的增高，无论是蛋白水平还是mRNA水平，uPA和/或uPAR的表达均呈增高趋势。
本研究还发现11例伴有淋巴结转移的胃癌组织中uPA和uPARmRNA表达水平显著高于9例无淋巴结转移者，进一步证实了uPA/uPAR系统参与了胃癌的侵袭和转移过程，这可能是因为高表达uPA和uPAR基因的癌细胞降解胞外基质和基底膜成分的能力增强，使这部分细胞更易向组织深层和淋巴管浸润，并导致远处转移。
在uPA诱发肿瘤基质和基底膜的一系列降解作用中，肿瘤细胞表面的uPAR极为关键，它不仅使uPA浓集于细胞表面，而且协助活化的uPA将纤溶酶原激活为纤溶酶，引起细胞外基质蛋白水解。因此，在探讨uPA系统与胃癌侵袭转移相关性时，同时观察uPAR基因表达的作用，这对确切论证以uPA为中心，uPAR介导的纤溶酶原激活系统在肿瘤侵袭、转移过程中的作用是非常必要的。本研究结果显示，出现uPA、uPARmRNA高表达的胃癌组织中有12例二者呈协同高表达。其它研究亦发现uPAR常常伴随着uPA在癌细胞浸润性位点表达[8～9]。这进一步说明在大多肿瘤组织中uPA和uPAR基因表达具有协同高表达趋势。
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由于uPA系统在胃癌的形成和侵袭、转移过程中发挥重要作用，干扰uPA系统的不同作用途径：通过直接抑制uPA的活性或阻断uPA与uPAR的结合来达到抑制肿瘤的浸润和转移，这有可能成为临床抗肿瘤治疗的有效途径之一。■
作者简介：杨春花，女，1968-02-15生，湖北省浠水县人，汉族，1992年同济医科大学毕业，1997年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院风湿科医师；发表论文5篇。电话：(010)66936651
作者单位：杨春花(解放军总医院基础所分子生物学室硕士研究生(解放军总医院风湿科，北
京 100853)；)
谷志远(解放军总医院基础所分子生物学研究室)
郝好杰(解放军总医院基础所分子生物学研究室)
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李琦(解放军总医院基础所分子生物学研究室)
参考文献：
[1]Testa, JE, Quigley JP. The role of urokinase-type plasminogen activator in aggressive tumor cell behavior [J]. Cancer Metastasis Rev, 1990,9:353-357.
[2]Fazioli F, Blasi F. Urokinase-type plasminogen activator and its receptor: new targets for anti-metastatic therapy [J]. Tips-Januarary, 1994, 15:25-29.
[3]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction [J]. Anal Biochem, 1987,162:156-159.
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[4]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manua [C]. 2nd. Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.366-489.
[5]Kwaan HC. The plasminogen-plasmin system in malignancy [J]. Cancer Metastasis Rev, 1992, 11(3,4):291-296.
[6]Tanaka N, Fukao H, Ueshima S et al. Plasminogen activator inhibitor in human carcinoma tissues [J]. Int J Cancer, 1991,48:481-485.
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[7]Cho JY, Chung HC, Noh SH et al. High level of urokinase-type plasminogen activator is a new prognostic marker in patients with gastric carcinoma[J]. Cance, 1997,79(5):878-882.
[8]Plebani M, Herszenyi L, Carraro P et al. Urokinase-type plasminogen activator receptor in gastric cancer: tissue expression and prognostic role [J]. Clin Exp Metastasis, 1997,15:418-422.
[9]Noguchi-Takino M, Endo Y, Yonemura Y et al. Relationship between expression of plasminogen activator system and metastatic ability in human cancers [J]. Int Oncol, 1996,8:97-100., 百拇医药
摘 要：目的：检测胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPAR mRNA表达水平，并探讨它们与胃癌的侵袭、转移之间的关系。方法：运用cDNA-mRNA Northern印迹杂交方法定性和定量地检测了 20 例胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPAR mRNA的表达水平。结果：在检测的20例胃癌组织中分别有 13 例uPA和 15 例uPAR mRNA表达显著高于相应的癌旁组织 (P<0.01)，其中12例uPA和uPAR mRNA协同高于相应癌旁组织；11例伴有淋巴结转移的胃癌组织中uPA和uPAR mRNA表达水平显著高于 9 例无淋巴结转移者。结论：uPA、uPAR mRNA在胃癌组织中表达增强，并且与胃癌侵袭、转移密切相关。
关键词：尿激酶型纤溶酶原激活剂；受体；表达；胃癌；杂交
肿瘤侵袭和转移是一个涉及到多因素、多步骤的复杂过程，肿瘤细胞分泌多种蛋白酶，降解胞外基质，是肿瘤侵袭和转移的首要步骤和分子基础。肿瘤细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator, uPA)与其特异性受体(uPAR)结合后，降解肿瘤细胞外基质和基底膜成分，在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，如何阻断胃癌细胞的浸润和转移，一直是人们研究的重点。已有大量研究表明，多种肿瘤的恶性程度、预后及转移能力与uPA及uPA表达水平密切相关[1～2]。本研究从基因转录水平运用cDNA-mRNA Northen印迹杂交方法定性和定量地检测了20例胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPARmRNA的表达水平，并分析临床意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本采集 20例胃癌和相应癌旁组织(距癌组织5～10cm)均取自解放军总医院1995年8月至1996年8月间外科手术切除标本，按《第一届全国胃癌协作会议》通过的胃癌分期标准，采集的标本立即置液氮中冷冻保存，全部经病理组织学确诊。
1.2 探针制备 uPA和uPARcDNA探针来自载有人uPAcDNA387bpAccⅠ-BgLⅡ片段的PGEM-4Z重组质粒和载有人uPARcDNA585bpBamHⅠ片段的PGEM-3Z重组质粒(澳大利亚国立大学王耀教授惠赠)。β-acincDNA探针(1.0kb)购于华美生物工程公司。采用随机引物法(Promaga试剂盒)，用[α-32P]dCTP(北京市亚辉生物医学工程公司)标记探针。
1.3 组织总RNA提取 采用异硫氰酸胍一步法提取全部胃癌和癌旁组织总RNA[3]。RNA纯度为：OD260/OD280>1.8。
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1.4 Northern印迹杂交 将提取的胃癌和相应的癌旁组织总RNA30μg通过1%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离，吸印转移到尼龙膜上，于80℃干烤2h，按Sambrook等[4]的方法进行预杂交、杂交、洗膜及放射自显影，放射自显影底片通过QTM970计算机图像分析仪扫描得到每个样品的积分光密度值(IOD值)。
1.5 统计学方法 采用Student′t检验判断显著性。
2 结 果
2.1 总RNA鉴定 选取部分胃癌和癌旁组织中提取的总RNA进行了琼脂糖凝胶电泳和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，RNA呈三条明显带，分别代表28s、18s和5srRNA，表明我们提取的RNA质量符合要求，可用于Northern印迹杂交实验(图1)。
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图1 组织总RNA鉴定电泳
上图：1%琼脂糖凝胶电泳；下图：1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
2.2 Norther印迹杂交结果 提取的组织总RNA，运用uPA、uPARcDMA探针进行cDNA-mRNANorthern印迹杂交，并采用β-actin探针作为内标校正加样量的误差。依据公式计算胃癌和癌旁组织中uPA和uPARmRNA表达差异。结果显示，在20例胃癌组织中，有13例(占65.0%)uPARmRNA表达高于癌旁组织，平均高4.2倍。15例(占75.0%)uPARmRNA表达高于癌旁组织，平均高5.6倍(图2)；出现uPA、uPARmRNA高表达的胃癌组织中有12例二者协同高表达，其中11例伴有淋巴结转移。在这11例伴有淋巴结转移的胃癌组织中，uPA和uPARmRNA表达水平均显著高于9例无淋巴结转移者，其中uPA平均高4.7倍(P<0.05)，uPAR平均高6.3倍(P<0.01)。
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图2 uPA和uPARmRNANorthern杂交
T.胃癌组织；N.相应癌旁组织
3 讨 论
目前各国学者对多种人类恶性肿瘤与uPA/uPAR系统的相关性进行了研究，其中包括肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤、黑色素瘤、恶性胶质瘤以及一些肿瘤细胞系[5]。研究结果显示，uPA/uPAR系统不仅参与了肿瘤的形成，而且在肿瘤的侵袭和转移中扮演着重要角角。
本研究通过Northern印迹杂交方法检测20例胃癌和相应癌旁组织中uPA和uPARmRNA表达水平。结果，胃癌和癌旁组织均出现单一转录带，转录带长度分别为2.5kb和1.4kb，符合文献报道的uPA和uPARmRNA分子量大小，表明该杂交检出的uPA和uPARmRNA是特异的。
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在被检测的20例胃癌及相应癌旁组织中，分别有13例和15例uPA、uPARmRNA表达水平均明显高于其相应的癌旁组织。其它学者利用ELISA和免疫组织化学方法检测uPA、uPAR蛋白表达水平时，亦发现癌中心、癌边缘和正常组织中uPA、uPAR蛋白活性逐渐减低，这与本研究得到的结果基本相一致[6～7]。这说明随着细胞恶性程度的增高，无论是蛋白水平还是mRNA水平，uPA和/或uPAR的表达均呈增高趋势。
本研究还发现11例伴有淋巴结转移的胃癌组织中uPA和uPARmRNA表达水平显著高于9例无淋巴结转移者，进一步证实了uPA/uPAR系统参与了胃癌的侵袭和转移过程，这可能是因为高表达uPA和uPAR基因的癌细胞降解胞外基质和基底膜成分的能力增强，使这部分细胞更易向组织深层和淋巴管浸润，并导致远处转移。
在uPA诱发肿瘤基质和基底膜的一系列降解作用中，肿瘤细胞表面的uPAR极为关键，它不仅使uPA浓集于细胞表面，而且协助活化的uPA将纤溶酶原激活为纤溶酶，引起细胞外基质蛋白水解。因此，在探讨uPA系统与胃癌侵袭转移相关性时，同时观察uPAR基因表达的作用，这对确切论证以uPA为中心，uPAR介导的纤溶酶原激活系统在肿瘤侵袭、转移过程中的作用是非常必要的。本研究结果显示，出现uPA、uPARmRNA高表达的胃癌组织中有12例二者呈协同高表达。其它研究亦发现uPAR常常伴随着uPA在癌细胞浸润性位点表达[8～9]。这进一步说明在大多肿瘤组织中uPA和uPAR基因表达具有协同高表达趋势。
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由于uPA系统在胃癌的形成和侵袭、转移过程中发挥重要作用，干扰uPA系统的不同作用途径：通过直接抑制uPA的活性或阻断uPA与uPAR的结合来达到抑制肿瘤的浸润和转移，这有可能成为临床抗肿瘤治疗的有效途径之一。■
作者简介：杨春花，女，1968-02-15生，湖北省浠水县人，汉族，1992年同济医科大学毕业，1997年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院风湿科医师；发表论文5篇。电话：(010)66936651
作者单位：杨春花(解放军总医院基础所分子生物学室硕士研究生(解放军总医院风湿科，北
京 100853)；)
谷志远(解放军总医院基础所分子生物学研究室)
郝好杰(解放军总医院基础所分子生物学研究室)
, http://www.100md.com
李琦(解放军总医院基础所分子生物学研究室)
参考文献：
[1]Testa, JE, Quigley JP. The role of urokinase-type plasminogen activator in aggressive tumor cell behavior [J]. Cancer Metastasis Rev, 1990,9:353-357.
[2]Fazioli F, Blasi F. Urokinase-type plasminogen activator and its receptor: new targets for anti-metastatic therapy [J]. Tips-Januarary, 1994, 15:25-29.
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[6]Tanaka N, Fukao H, Ueshima S et al. Plasminogen activator inhibitor in human carcinoma tissues [J]. Int J Cancer, 1991,48:481-485.
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[8]Plebani M, Herszenyi L, Carraro P et al. Urokinase-type plasminogen activator receptor in gastric cancer: tissue expression and prognostic role [J]. Clin Exp Metastasis, 1997,15:418-422.
[9]Noguchi-Takino M, Endo Y, Yonemura Y et al. Relationship between expression of plasminogen activator system and metastatic ability in human cancers [J]. Int Oncol, 1996,8:97-100., 百拇医药