山莨菪碱对肝细胞损伤的治疗作用及机制
作者：朱丽 李跃华 吴翠贞
单位：南京医科大学病理生理教研室210029
关键词：肝细胞损伤；硫代乙酰胺；山莨菪碱
江苏医药001207 【摘要】 目的 探讨山莨菪碱(654-2)对急性肝细胞损伤的治疗作用及作用机制。 方法 以硫代乙酰胺(TAA)损伤体外培养的SD乳鼠肝细胞为模型， 用654-2处理损伤组，观察正常对照组、TAA组、654-2组肝细胞的活性，培养 液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)含量的变化。 结果 654-2组肝细胞活性及培养液中SOD(26.03±0.4 3NU/ml)、NO(827.83±44.46μM)明显高于TAA组肝细胞活性及 培 养液中SOD(17.40±0.41NU/ml)、NO(743.30±25.60μ M)。654-2组培养液中LDH(264.00±21.35U/100ml)，明显低 于TAA组(386.50±69.93U/100ml)。结论 65 4-2对TAA损伤肝细胞有治疗作用，治疗作用可能与654-2的生物膜保护、清除自 由基、改善微循环有关。
, 百拇医药
Therapeutical effect of anisodamine on i njured rat hepatocyte and its potential mechanism
ZHU Li，LI Yuehua，WU Cuizh en.
(Department of Pathophysiology，Nanjin g Medical University，Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To study the therapeutical effect of ani sodamine(654-2) on injured rat hepatocyte and i ts potential mechanism.Methods H epatocytes were administere d with thioacetamide(TAA) to induce inju ry，then were treated with anisodamineto produce treatment.Assay the cellular activity and measure lactate de hydroge nase(LDH) and superoxide dismutase(SOD)a ctivity，nitric oxide(NO)levels.Resul ts SOD(26.03±0.43NU/ml)，NO(827.83±44 . 46μM)and cellular activity in 654- 2-treated group were significantly higher than th ose in TAA injured group，SOD(17.40±0.41N U/ml)，NO(743.30±25.60μM)，LDH(264.00±21.3 5U/100ml)in 654-2-treated group was sign ificatly lowere than LDH(386.50±69.93U/1 00ml)in TAA injured group.Conclusion 654-2 has t herapeutic effect on injured hepatocyte s with TAA by protecting biomembrance，sc avenging free radicals and improving mic rocirculation.
, 百拇医药
【Key words】 Injured hepatocyte Thioacetamide Anisodamine
山莨菪碱(654-2)是我国首先合成的M胆碱受体阻断剂 ，具有松弛平滑肌、镇痛、抑 制腺体分泌等多种作用。近年来的研究表明，该药对多种脏器的损伤均有保护作用，虽有将 654-2试用于实验性大鼠损伤，并探讨其作用机制[1]，但涉及到细胞水平上 的分析 较少，而且并不全面。本文拟观察654-2对硫代乙酰胺(TAA)所致肝细胞损伤的影 响，尝试从另外的角度来阐述654-2对肝细胞的治疗机制。
材料与方法
一、材料：SD乳鼠，鼠龄3～4天，由江苏省实验动物中心提供；胰蛋白酶、R PMI-1640为Sigma公司产品；654-2为江苏天晴制药总厂产品，批号96 01291；TAA由上海化学试剂采购站提供；辅酶I为中国科学院东方仪器设备公司生 化部提供；SOD、NO试剂盒为建成生物工程研究所提供；其余试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
二、方法：
1.细胞培养和活性检测：取SD乳鼠肝脏，制备成肝细胞悬液，台盼兰排除法测定细胞活 力90%以上，用含20%小牛血清的RPMI-1640稀释至106/ml，接种于 培 养板中，置37℃，5%CO2培养箱内培养。待细胞生长24小时，贴壁良好后，加入 各种待测因素继续培养24小时后，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)显色法[2]检 测肝细胞的活性和增殖情况，并计算增生指数。
增生指数＝(实验组OD(570nm))/(对照组OD(570nm))
2.肝细胞损伤模型的制备及抗损伤处理：在培养24小时后贴壁生长良好的肝细胞上清液 中加入不同浓度的TAA(终浓度0.00～0.26mol/L)，继续培养24小时， 测细胞增生指数，选出最适损伤浓度(0.18M)制备损伤模型。另培养肝细胞，选24 小时后生长良好的肝细胞加入0.18M的TAA，继续培养2小时，分别加入不同剂量的 654-2(终浓度120ng/ml、160ng/ml、200ng/ml)，培养2 4小时后，检测增生指数，选出最适治疗浓度(160ng/ml)制备治疗模型。
, http://www.100md.com
3.乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)测定方法：上 清液中LDH的活性测定采用生化比色分析法；上清液中SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法； 上清液中NO测定采用硝酸还原酶法。
4.统计学方法：结果以均数±标准差(
±s)表示，两组比较采用t检 验。
结果
一、TAA对肝细胞的损伤作用(图1)：在TAA终浓度较低时，肝细胞增生活跃，此时 TAA可能具有致癌作用[3，4]。当TAA浓度逐渐加入到0.18M时，肝细 胞增殖明显下降，增生指数<1，TAA开始抑制细胞生长。故选用此浓度复制肝细胞损伤 模型。
, 百拇医药
图1 TAA对体外培养肝细胞的作用 二、654-2对TAA损伤肝细胞的治疗作用(图2)：不同浓度的6 54-2组增生指数均明显高于TAA损伤组，并呈剂量依赖性。选用160ng/ml的 浓度作治疗组。
三、654-2对TAA致肝细胞损伤酶活性的影响(表1)：TAA损 伤组肝细胞LDH漏出增多，培养液中SOD、NO含量与正常组相比均下降，而654- 2治疗组LDH、SOD、NO含量与损伤组相比均有统计学上的显著差别。讨论
本实验证明体外培养肝细胞加入终浓度0.18M的TAA，肝细胞活性明显降低，增 生指数低于正常，上清液中LDH活性增加，说明TAA对肝细胞确有损伤作用。而654-2 治疗组上清液中LDH活性低于TAA损伤组，增生指数高于损伤组，表明其在TAA所致 肝细胞损伤中有明显的治疗作用。
, 百拇医药 图2 654-2对TAA所致肝细胞损伤的保护作 用 C：正常对照组；M：TAA损伤模型组；1：654-2终浓度120ng/ml保 护组； 2：654-2终浓度160ng/ml保护组； 3：654-2终浓度200ng/ml 保护组；各组n＝5，正常对照组和654-2保护组与TAA损伤组相比P均<0.0 1 表1 654-2对TAA致肝细胞损伤酶活性的影响
LDH(U/100ml)
SOD(NU/ml)
NO(μM)
正 常组
280.50±10.55
50.04±0.69
81 6.48±28.43
, 百拇医药
TAA损伤组
386.50±69.93*
17.40±0.41*
743.30±25.60*
654-2保护组
264.00±21.35△
26.03±0.43△
827.83±44.46△
与正常组相比：*P<0.05； 与损伤组相比：△P<0.05
, 百拇医药
近年国内的研究提示，654-2对细胞的保护机制[1，5]有：①增加膜的流动 性 ，改善和保护生物膜的功能；②钙拮抗作用，避免细胞内钙超载；③清除自由基和保护抗氧 化酶系统；④抑制血小板及粒细胞聚集，保护血管内皮细胞，从而改善微循环。本研究发现 ，TAA可导致SOD活力下降，且其发生在LDH升高之前，提示肝细胞的抗氧化能力不 足，对抗自由基引起的脂质过氧化的作用降低，这可能是TAA引起肝细胞损伤的主要原因 之一。应用654-2可使SOD活力明显回升，这表明654-2对肝细胞的治疗作用与 其清除自由基、抗氧化功能有关。正常状态下各种酶是不可能通过细胞质膜漏到胞外的，本 实验发现，TAA损伤后培养液中LDH活性增加，加入654-2治疗后肝细胞培养液中 LDH 活性与正常细胞无显著差别，说明654-2可能通过改变细胞膜的状态，保护细胞膜而起 治疗肝细胞损伤的作用。
Carmen等[6]报道，TAA损伤24小时后，肝细胞释放的NO量明显降 低，本 实验结果与其一致。而654-2作用后，肝细胞释放的NO量明显升高，654-2具有 解除血管收缩、改善微循环的作用[7]，而NO作为一种血管舒张剂时起保护作用 [8] 。这提示654-2可能通过促进NO的生成改善微循环，增加血流量，提供细胞必要的氧 和营养物质，增强细胞的抵抗力而起细胞保护作用。有研究表明，TAA致肝损伤的机制之 一与GSH大量消耗有关。GSH是自由基清除剂，GSH减少，使体内自由基增加，从而 导致肝细胞脂质过氧化性损害[9]。NO能作为一种抗氧化剂与超氧阴离子自由基 或其它 自由基反应，产生低毒性物质，这进一步表明了654-2清除自由基，抗氧化的能力。
, 百拇医药
我们在实验过程中曾在正常细胞中加入160ng/ml的654-2，发现654-2对 肝细胞的增生指数没有任何改变，但在加入TAA后再加入654-2，却发现肝细胞的增 生指数远远超过正常肝细胞的增生指数，是否TAA和654-2联合有刺激细胞增生的作 用，还有待进一步研究。
参考文献
1.邢卉春，赵龙凤，王守义.山莨菪碱对大鼠急性肝损伤的保护作用及其机制 .中国危重病急救医学，1998，10：658-660.
2.吴翠贞，王祝鸣，徐柯，等.大鼠再生肝中肝细胞生长因子的纯化和生物活性的研究. 江苏医药，1994，20：298-299.
3.Duivenvoorden WC，Maier P.Nongenotoxic carcinogens shift culture rat hepatocyte s into Gl cell cycle phase：influence o f tissue oxygentension on cells with diff erent ploidy.Europ J Cell Biol，1994，64：3 68-375.
, 百拇医药
4.Osada J，AylaGas H，Sanchez-Vegaz I.Effe ct of S-adenosyl-L-Methionine on Thioace tamide-induced Liver Damage in Rats.Toxi cal Letters，1986，32：97-106.
5.常青.山莨菪碱对内毒素血症大鼠肠系膜血管内皮细胞与白细胞粘附力的影响.中国病 理生理学杂志，1995，11：471-474.
6.Carmen DF，Nuria S，Alberto MA， et al.In f luence of aminoguanidine on parament of liver injury and regeneration induced in rats by a necrogenic dose of thioacetam ide.Br J Pharmacol，1998，125：102-108.
, http://www.100md.com
7.戴顺龄，薛全福，王树山，等.山莨菪碱及川芎嗪预防大鼠肺水肿的实验研究.中国病 理生理学杂志，1989，5：354-357.
8.Clemens MG.Nitric oxide in liver injur y.Hepatology，1999，30：1-5.
9.Mesa ML，Carrizosa R，Martinez-Honduvil la C，et al.Changes in rat liver gene exp eression induced by thioacetamide：protec tive role of S-Adenosyl-L-Methionine by a glutathione-dependent mechanism.Hepato logy，1996，23：600-606.
(收稿：2000-06-01 修回：2000-08-20), http://www.100md.com
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关键词：肝细胞损伤；硫代乙酰胺；山莨菪碱
江苏医药001207 【摘要】 目的 探讨山莨菪碱(654-2)对急性肝细胞损伤的治疗作用及作用机制。 方法 以硫代乙酰胺(TAA)损伤体外培养的SD乳鼠肝细胞为模型， 用654-2处理损伤组，观察正常对照组、TAA组、654-2组肝细胞的活性，培养 液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)含量的变化。 结果 654-2组肝细胞活性及培养液中SOD(26.03±0.4 3NU/ml)、NO(827.83±44.46μM)明显高于TAA组肝细胞活性及 培 养液中SOD(17.40±0.41NU/ml)、NO(743.30±25.60μ M)。654-2组培养液中LDH(264.00±21.35U/100ml)，明显低 于TAA组(386.50±69.93U/100ml)。结论 65 4-2对TAA损伤肝细胞有治疗作用，治疗作用可能与654-2的生物膜保护、清除自 由基、改善微循环有关。
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Therapeutical effect of anisodamine on i njured rat hepatocyte and its potential mechanism
ZHU Li，LI Yuehua，WU Cuizh en.
(Department of Pathophysiology，Nanjin g Medical University，Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To study the therapeutical effect of ani sodamine(654-2) on injured rat hepatocyte and i ts potential mechanism.Methods H epatocytes were administere d with thioacetamide(TAA) to induce inju ry，then were treated with anisodamineto produce treatment.Assay the cellular activity and measure lactate de hydroge nase(LDH) and superoxide dismutase(SOD)a ctivity，nitric oxide(NO)levels.Resul ts SOD(26.03±0.43NU/ml)，NO(827.83±44 . 46μM)and cellular activity in 654- 2-treated group were significantly higher than th ose in TAA injured group，SOD(17.40±0.41N U/ml)，NO(743.30±25.60μM)，LDH(264.00±21.3 5U/100ml)in 654-2-treated group was sign ificatly lowere than LDH(386.50±69.93U/1 00ml)in TAA injured group.Conclusion 654-2 has t herapeutic effect on injured hepatocyte s with TAA by protecting biomembrance，sc avenging free radicals and improving mic rocirculation.
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【Key words】 Injured hepatocyte Thioacetamide Anisodamine
山莨菪碱(654-2)是我国首先合成的M胆碱受体阻断剂 ，具有松弛平滑肌、镇痛、抑 制腺体分泌等多种作用。近年来的研究表明，该药对多种脏器的损伤均有保护作用，虽有将 654-2试用于实验性大鼠损伤，并探讨其作用机制[1]，但涉及到细胞水平上 的分析 较少，而且并不全面。本文拟观察654-2对硫代乙酰胺(TAA)所致肝细胞损伤的影 响，尝试从另外的角度来阐述654-2对肝细胞的治疗机制。
材料与方法
一、材料：SD乳鼠，鼠龄3～4天，由江苏省实验动物中心提供；胰蛋白酶、R PMI-1640为Sigma公司产品；654-2为江苏天晴制药总厂产品，批号96 01291；TAA由上海化学试剂采购站提供；辅酶I为中国科学院东方仪器设备公司生 化部提供；SOD、NO试剂盒为建成生物工程研究所提供；其余试剂均为国产分析纯。
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二、方法：
1.细胞培养和活性检测：取SD乳鼠肝脏，制备成肝细胞悬液，台盼兰排除法测定细胞活 力90%以上，用含20%小牛血清的RPMI-1640稀释至106/ml，接种于 培 养板中，置37℃，5%CO2培养箱内培养。待细胞生长24小时，贴壁良好后，加入 各种待测因素继续培养24小时后，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)显色法[2]检 测肝细胞的活性和增殖情况，并计算增生指数。
增生指数＝(实验组OD(570nm))/(对照组OD(570nm))
2.肝细胞损伤模型的制备及抗损伤处理：在培养24小时后贴壁生长良好的肝细胞上清液 中加入不同浓度的TAA(终浓度0.00～0.26mol/L)，继续培养24小时， 测细胞增生指数，选出最适损伤浓度(0.18M)制备损伤模型。另培养肝细胞，选24 小时后生长良好的肝细胞加入0.18M的TAA，继续培养2小时，分别加入不同剂量的 654-2(终浓度120ng/ml、160ng/ml、200ng/ml)，培养2 4小时后，检测增生指数，选出最适治疗浓度(160ng/ml)制备治疗模型。
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3.乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)测定方法：上 清液中LDH的活性测定采用生化比色分析法；上清液中SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法； 上清液中NO测定采用硝酸还原酶法。
4.统计学方法：结果以均数±标准差(
±s)表示，两组比较采用t检 验。结果
一、TAA对肝细胞的损伤作用(图1)：在TAA终浓度较低时，肝细胞增生活跃，此时 TAA可能具有致癌作用[3，4]。当TAA浓度逐渐加入到0.18M时，肝细 胞增殖明显下降，增生指数<1，TAA开始抑制细胞生长。故选用此浓度复制肝细胞损伤 模型。
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图1 TAA对体外培养肝细胞的作用 二、654-2对TAA损伤肝细胞的治疗作用(图2)：不同浓度的6 54-2组增生指数均明显高于TAA损伤组，并呈剂量依赖性。选用160ng/ml的 浓度作治疗组。
三、654-2对TAA致肝细胞损伤酶活性的影响(表1)：TAA损 伤组肝细胞LDH漏出增多，培养液中SOD、NO含量与正常组相比均下降，而654- 2治疗组LDH、SOD、NO含量与损伤组相比均有统计学上的显著差别。讨论
本实验证明体外培养肝细胞加入终浓度0.18M的TAA，肝细胞活性明显降低，增 生指数低于正常，上清液中LDH活性增加，说明TAA对肝细胞确有损伤作用。而654-2 治疗组上清液中LDH活性低于TAA损伤组，增生指数高于损伤组，表明其在TAA所致 肝细胞损伤中有明显的治疗作用。
, 百拇医药 图2 654-2对TAA所致肝细胞损伤的保护作 用 C：正常对照组；M：TAA损伤模型组；1：654-2终浓度120ng/ml保 护组； 2：654-2终浓度160ng/ml保护组； 3：654-2终浓度200ng/ml 保护组；各组n＝5，正常对照组和654-2保护组与TAA损伤组相比P均<0.0 1 表1 654-2对TAA致肝细胞损伤酶活性的影响
LDH(U/100ml)
SOD(NU/ml)
NO(μM)
正 常组
280.50±10.55
50.04±0.69
81 6.48±28.43
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TAA损伤组
386.50±69.93*
17.40±0.41*
743.30±25.60*
654-2保护组
264.00±21.35△
26.03±0.43△
827.83±44.46△
与正常组相比：*P<0.05； 与损伤组相比：△P<0.05
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近年国内的研究提示，654-2对细胞的保护机制[1，5]有：①增加膜的流动 性 ，改善和保护生物膜的功能；②钙拮抗作用，避免细胞内钙超载；③清除自由基和保护抗氧 化酶系统；④抑制血小板及粒细胞聚集，保护血管内皮细胞，从而改善微循环。本研究发现 ，TAA可导致SOD活力下降，且其发生在LDH升高之前，提示肝细胞的抗氧化能力不 足，对抗自由基引起的脂质过氧化的作用降低，这可能是TAA引起肝细胞损伤的主要原因 之一。应用654-2可使SOD活力明显回升，这表明654-2对肝细胞的治疗作用与 其清除自由基、抗氧化功能有关。正常状态下各种酶是不可能通过细胞质膜漏到胞外的，本 实验发现，TAA损伤后培养液中LDH活性增加，加入654-2治疗后肝细胞培养液中 LDH 活性与正常细胞无显著差别，说明654-2可能通过改变细胞膜的状态，保护细胞膜而起 治疗肝细胞损伤的作用。
Carmen等[6]报道，TAA损伤24小时后，肝细胞释放的NO量明显降 低，本 实验结果与其一致。而654-2作用后，肝细胞释放的NO量明显升高，654-2具有 解除血管收缩、改善微循环的作用[7]，而NO作为一种血管舒张剂时起保护作用 [8] 。这提示654-2可能通过促进NO的生成改善微循环，增加血流量，提供细胞必要的氧 和营养物质，增强细胞的抵抗力而起细胞保护作用。有研究表明，TAA致肝损伤的机制之 一与GSH大量消耗有关。GSH是自由基清除剂，GSH减少，使体内自由基增加，从而 导致肝细胞脂质过氧化性损害[9]。NO能作为一种抗氧化剂与超氧阴离子自由基 或其它 自由基反应，产生低毒性物质，这进一步表明了654-2清除自由基，抗氧化的能力。
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我们在实验过程中曾在正常细胞中加入160ng/ml的654-2，发现654-2对 肝细胞的增生指数没有任何改变，但在加入TAA后再加入654-2，却发现肝细胞的增 生指数远远超过正常肝细胞的增生指数，是否TAA和654-2联合有刺激细胞增生的作 用，还有待进一步研究。
参考文献
1.邢卉春，赵龙凤，王守义.山莨菪碱对大鼠急性肝损伤的保护作用及其机制 .中国危重病急救医学，1998，10：658-660.
2.吴翠贞，王祝鸣，徐柯，等.大鼠再生肝中肝细胞生长因子的纯化和生物活性的研究. 江苏医药，1994，20：298-299.
3.Duivenvoorden WC，Maier P.Nongenotoxic carcinogens shift culture rat hepatocyte s into Gl cell cycle phase：influence o f tissue oxygentension on cells with diff erent ploidy.Europ J Cell Biol，1994，64：3 68-375.
, 百拇医药
4.Osada J，AylaGas H，Sanchez-Vegaz I.Effe ct of S-adenosyl-L-Methionine on Thioace tamide-induced Liver Damage in Rats.Toxi cal Letters，1986，32：97-106.
5.常青.山莨菪碱对内毒素血症大鼠肠系膜血管内皮细胞与白细胞粘附力的影响.中国病 理生理学杂志，1995，11：471-474.
6.Carmen DF，Nuria S，Alberto MA， et al.In f luence of aminoguanidine on parament of liver injury and regeneration induced in rats by a necrogenic dose of thioacetam ide.Br J Pharmacol，1998，125：102-108.
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7.戴顺龄，薛全福，王树山，等.山莨菪碱及川芎嗪预防大鼠肺水肿的实验研究.中国病 理生理学杂志，1989，5：354-357.
8.Clemens MG.Nitric oxide in liver injur y.Hepatology，1999，30：1-5.
9.Mesa ML，Carrizosa R，Martinez-Honduvil la C，et al.Changes in rat liver gene exp eression induced by thioacetamide：protec tive role of S-Adenosyl-L-Methionine by a glutathione-dependent mechanism.Hepato logy，1996，23：600-606.
(收稿：2000-06-01 修回：2000-08-20), http://www.100md.com