类风湿关节炎与骨性关节炎成纤维样滑膜细胞蛋白酪氨酸磷酸化状态的比较
作者：孙铁铮 吕厚山 药立波 寇伯龙 蒋东芳 陈占昆
单位：孙铁铮 吕厚山 寇伯龙 蒋东芳 陈占昆(北京大学人民医院关节病诊疗研究中心 100044)；药立波(西安，第四军医大学生化系)
关键词：关节炎；滑膜；成纤维细胞；电泳
中华骨科杂志001208
【摘要】目的比较类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)与骨性关节炎(osteoarthritis,OA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异。方法滑膜细胞原代培养,流式细胞仪鉴定滑膜细胞型别,提取蛋白进行SDS-PAGE单向电泳和ICE-PAGE双向电泳分离后，应用抗蛋白酪氨酸磷酸化抗体进行westernblot检测。结果滑膜细胞原代培养至第三代时，CD3、CD14、CD20、CD11b、vonWillibrandfactor阳性细胞比例小于1%,RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化程度是OAFLS的4～6倍。结论滑膜细胞原代培养至第三代时即可以获得型别均一的FLS,RAFLS酪氨酸磷酸化程度较OAFLS明显增高。
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Comparison of the status of tyrosine phosphorylation in fibroblast-like synoviocytes between rheumatoid arthritis and osteoarthritis
SUN Tiezheng，LÜ Houshan，YAO Libo
(Arthritis Clinic and Research Center, People's Hospital, Beijing University, Beijing 100044， China)
【Abstract】 Objective To evaluate the changes of tyrosine phosphorylation status in rheumatoid arthritis(RA) fibroblast-like synoviocytes(FLS), and that in osteoarthritis(OA)FLS. Methods RA and OA FLS were primarily cultured. FLS type was defined by flow cytometry. After proteins were isolated from RA FLS and OA FLS, they were fractionated with SDS-PAGE single-dimensional electrophoresis and ICE-PAGE two-dimensional electrophoresis, followed by western blots for the determination of tyrosine phosphorylation status using specific anti-protein tyrosine phosphorylated antibody. Results In passage 3, the positive cells'proportion of CD3, CD14, CD11b, CD20,von Willibrand factor were less than 1% respectively. The extent of protein tyrosine phosphorylation in RA FLS was 4-6 times as high as that of OA FLS. Conclusion Synoviocytes of passage 3 were homogenous populations of fibroblast-like cells, protein tyrosine phosphorylation status in RA FLS increased much higher than that of OA FLS.
, 百拇医药
【Key words】 Arthritis; Synovial membrane; Fibroblasts; Electrophoresis
类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性系统性疾病，它的病情进展综合体现了炎症、自身免疫和滑膜组织增生这三种病理生理过程。异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导致关节畸形和不同程度的功能障碍。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)是滑膜组织的重要组成成分，通过分泌各种蛋白酶类、花生四烯酸代谢产物及其细胞因子，在关节破坏过程中发挥重要作用。最近的研究发现，RAFLS具有转化细胞特征，而在骨性关节炎(osteoarthritis,OA)FLS中未发现该转化现象的存在，这种转化现象可能是RA发病的早期特征之一[1]。蛋白酪氨酸磷酸化在正常细胞中所占比例很小，但是在转化细胞中却可升高10～20倍[2]。本研究通过比较RA和OA关节病变中FLS蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，探讨RAFLS中蛋白酪氨酸激酶活性的改变。
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材料与方法
一、滑膜细胞的培养
滑膜组织均取材于在北京大学人民医院关节病诊疗研究中心行膝关节置换术或滑膜切除术的患者，其中RA20例，OA20例。所有患者均按国际诊断标准[3]确诊。术中取出滑膜组织，无菌条件下剪碎，1.0×10-3kg/LⅠ型胶原酶(Gibco-BRL)37℃消化4h，离心收集细胞，加入体积分数20%FBS-DMEM(Gibco-BRL)培养液中，置于37℃、体积分数为5%的CO2孵育箱中令其贴壁生长，24h后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗除去悬浮细胞，待细胞贴壁生长至85%汇满时，胰蛋白酶-EDTA消化进行1∶3传代培养。本实验均采用3～5代的滑膜细胞。
二、滑膜细胞类型鉴定
分别取1～3代滑膜细胞，用0.125mmol/LEDTA缓慢消化，PBS洗涤，台盼蓝染色计算活细胞数目，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD20、vonWillibrandfactor(SerotechUK)和PE标记的小鼠抗人CD11b，4℃作用45min；与含有体积分数为1%的马血清的PBS溶液充分混匀作用1h，体积分数为80%的酒精固定。实验均按三个平行管设计，重复6次。每次均以FITC和PE标记的鼠源性抗体作为阴性对照。样品集中用流式细胞仪测定相对荧光强度及各种表面标记阳性细胞比例。
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三、细胞蛋白提取和测定
将3～5代滑膜细胞以5×105的密度接种于60mmCostar平皿中，贴壁生长至85%汇满时，弃去培养液，预冷的PBS冲洗，加入100μl细胞裂解液[20mmol/LTris/Cl(pH值为7.5),0.01kg/LNP-40,150mmol/LNaCl,1×10-3kg/LNaN3,5×10-6kg/LAprotinin,1mmol/LPMSF,1mmol/LEDTA,1mmol/LNa3VO4,25μmol/LPNP',1μmol/L抑胃肽酶A,1μmol/L亮抑制肽]。刮下细胞，冰冻30min，12000r/min离心15min，取上清，-70℃冻存或冻成干粉，采用Bio-RadDCProteinAssay进行总蛋白浓度测定。
四、SDS-PAGE电泳和western印迹杂交
取30μg总蛋白，加入5×上样缓冲液[50mmol/LTris/Cl(pH值为6.8),500mmol/LDTT,0.1kg/LSDS,体积分数为20%的甘油及溴酚蓝]，进行体积分数10%SDS-PAGE电泳，半干转移至硝酸纤维素膜，0.05kg/L脱脂奶粉封闭过夜后，以1∶2000比例加入小鼠抗人蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10(Promega)，室温作用3h，Tween20-PBS洗膜5min×3次，HRP标记羊抗鼠IgG作用2h，同上洗膜3次后，ECL(Amersham)化学增强发光，KodakX线片曝光，显影。
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五、ICE-PAGE双向电泳
取10μg细胞裂解提取物，加入双向电泳上样缓冲液(9.7gUrea、5.5gAmpholytes、1.45gDTT、300μl0.01kg/L溴酚蓝、44.9mlH2O)。采用BicinchoninicAcidProteinAssay(Pierce)，确定总蛋白浓度，加入等量蛋白于第一向中。采用Millipore电泳仪，等电聚焦于18000V/h后，取下胶条，稳压下进行10%SDS-PAGE第二向电泳，稳流转移至硝酸纤维素膜，以后操作同步骤四。
六、图像灰度扫描及统计学处理
将上述发光显影的X线片应用四星Bio-Image软件做图像灰度扫描，结果进行显著性t检验。
结果
原代培养的滑膜细胞,PBS冲洗去除未贴壁的细胞,生长至85%汇满时,经流式细胞仪检测CD3阳性细胞为7.85%;CD14阳性细胞为7.30%;CD20阳性细胞为7.50%;vonWillibrandfactor阳性细胞为0.85%;CD11b阳性细胞为7.80%。当传代至第三代时,以上各种表面标记阳性细胞比例均小于1%。所以,滑膜细胞原代培养至第三代时,即可以获得型别较为均一的FLS,这与国外文献报道的结果相一致[4]。
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蛋白质进行SDS-PAGE单向电泳后进行westernblot检测,结果如图1所示,RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化程度明显高于OA,其中相对分子质量为170×103、150×103、110×103、95×103、85×103、70×103、66×103、54×103等条带的差异最为显著。RA灰度扫描值为1074346±8921，OA灰度扫描值为290790±2760，RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化程度约为OAFLS的4(3.8～4.9)倍，两者差异有非常显著性意义(t=2.728,P<0.01)。 蛋白质进行ICE-PAGE双向电泳检测,见图2。RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化位点较OAFLS明显增多,其中以相对分子质量42×103～95×103间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多,这与SDS-PAGE单向电泳结果相一致。但是,被检测出的蛋白酪氨酸磷酸化位点较SDS-PAGE单向电泳明显增多。对双向电泳结果进行灰度扫描,RAFLS灰度扫描值为4227672±8947，OAFLS为663480±7962,RAFLS的灰度扫描值约为OAFLS的6.5倍，两者差异有非常显著性意义
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图1比较RAFLS和OAFLS在SDS-PAGE
和westernblot中蛋白酪氨酸磷酸化程度差异
图2比较RAFLS和OAFLS在ICE-PAGE电泳中蛋白酪氨酸磷酸化程度差异
讨论
类风湿关节炎是一种慢性系统性疾病，全世界发病率为1%，我国发病率为0.3%，发病一年内致残率高达20%，严重影响人类的健康和生活质量。尽管对它的病理过程已经进行广泛研究，但是非免疫因素在RA病情进展中的作用尚未引起人们足够的重视。近来的研究表明，当将RSFLS与软骨共同植入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内时，可以自主性破坏软骨基质，而OAFLS和正常成纤维细胞则不具有这种特性[5]。这表明RAFLS发生不可逆性的改变，即使在脱离炎性环境条件下仍可以保持活化状态。越来越多的证据表明，RAFLS具有转化细胞特征，其表现在:(1)RAFLS细胞核大、苍白，核仁突出；(2)RAFLS在体外培养丧失接触抑制，可以形成类似于肿瘤细胞的巢样改变；(3)RAFLS可以在非贴壁情况下生长。这种转化特性可能是RA疾病发生的始发环节，并在RA病情进展中以非T细胞依赖方式在关节的破坏过程中发挥重要作用。
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1980年,Hunter[6]首先发现酪氨酸激酶(PTK)。现在已经证实，许多生长因子受体(INSR、PDGFR、EGFR、FGFR、TGFR、IGFR、HGFR、CSFR)等都具有PTK活性，一半以上的癌基因产物如c-src、c-neu、c-sis等也具有PTK活性。Hunter分析正常脊椎动物蛋白质磷酸化时发现,丝氨酸占92.19%，苏氨酸占7.78%，酪氨酸占0.03%。酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节[2]。癌基因活化后，PTK活性大大增加。1992年，Williams等[7]研究发现，RA滑膜细胞中的PTK活性远远高于OA。因此我们推测RAFLS的异常增殖和转化特性极可能伴有PTK活性的异常增高，我们在实验中通过SDS-PAGE单向电泳和ICE-PAGE双向电泳两种方法进一步证实了这一点，为RAFLS由于转化特性而呈持续活化状态提供了另一佐证。
研究蛋白质磷酸化最常用的方法是利用32Pi标记的无机磷酸盐进行生物合成标记。在磷酸化氨基酸中，磷酸化酪氨酸含量甚微,因而一般很难用32Pi标记在样品中检出,尤其当样品中含有大量丝氨酸磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难,只能通过电泳分级后进行碱处理,或RNA酶水解的办法提高磷酸化酪氨酸的检出率,步骤繁琐且容易发生放射性污染[8]。抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体,是研究酪氨酸激酶技术领域中的重大发现[6]。它无需借助于生物合成标记方法即可以鉴定磷酸化酪氨酸,而且达到很高的特异性和敏感性。ICE-PAGE双向电泳技术首先将蛋白质按等电点差异分离开来,然后依相对分子质量不同进一步分级,从而较SDS-PAGE单向电泳大大提高了分辨率。因此，在本实验中，SDS-PAGE单向电泳与ICE-PAGE双向电泳结果尽管基本一致,但是后者体现出的蛋白酪氨酸磷酸化位点较前者明显增多。
, 百拇医药
综上所述,RAFLS的PTK活性明显高于OA,这可能是导致RA滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键。因此我们推测,RAFLS很可能存在原癌基因的活化或突变,或多种生长因子受体的持续激活,从而导致转化细胞的外观表现并伴有PTK活性的升高。对于RAFLS转化特性的深入研究必将对RA发病机制提出新的阐述,并为探讨RA的治疗方法开辟一条新路。
(本文编辑:马宏庆)
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(39730430)
参考文献
1，Lin CW, Robbins PD, Georgescu HI, et al. Effects of immortalization upon the induction of matrix metalloproteinases in rabbit synovial fribroblasts. Exp Cell Res, 1996, 223:117-126.
, http://www.100md.com
2，乐志培，尹桂山，李国梁.生物信息胞内传递分子机理.第1版.北京:世界图书出版公司北京公司,1997.71-74.
3，Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988, 31:315-324.
4，Kawakami A, Eguchi K, Matsuoka N, et al. Inhibitory effects of interleukin-10 on synovial cells of rheumatoid arthritis.Immunology,1997, 91:252-259.
5，Muller-ladneru U, Kriegsmann J, Franklin BN, et al. Synovial fibroblasts of patients with rheumatoid arthritis attach to and invade normal human cartilage when engrafted into SCID mice. Am J Pathol, 1996, 149： 1607-1615.
, 百拇医药
6，Hunter T. Tyrosine phosphorylation: past,present and future. Biochem Soc Trans, 1996, 24:307-327.
7，Williams WV, VonFeldt JM, Ramanujam T, et al. Tyrosine kinase signal transduction in rheumatoid synovitis. Semin Arthritis Rheum, 1992, 21:317-329.
8，Frederick MA, Roger B, Robert EK, eds. Short protocols in molecular biology.3rd ed. Boston： John Wiley ＆ Sons Inc, 1995. 808-809.
(收稿日期:1999-09-27), 百拇医药
单位：孙铁铮 吕厚山 寇伯龙 蒋东芳 陈占昆(北京大学人民医院关节病诊疗研究中心 100044)；药立波(西安，第四军医大学生化系)
关键词：关节炎；滑膜；成纤维细胞；电泳
中华骨科杂志001208
【摘要】目的比较类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)与骨性关节炎(osteoarthritis,OA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异。方法滑膜细胞原代培养,流式细胞仪鉴定滑膜细胞型别,提取蛋白进行SDS-PAGE单向电泳和ICE-PAGE双向电泳分离后，应用抗蛋白酪氨酸磷酸化抗体进行westernblot检测。结果滑膜细胞原代培养至第三代时，CD3、CD14、CD20、CD11b、vonWillibrandfactor阳性细胞比例小于1%,RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化程度是OAFLS的4～6倍。结论滑膜细胞原代培养至第三代时即可以获得型别均一的FLS,RAFLS酪氨酸磷酸化程度较OAFLS明显增高。
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Comparison of the status of tyrosine phosphorylation in fibroblast-like synoviocytes between rheumatoid arthritis and osteoarthritis
SUN Tiezheng，LÜ Houshan，YAO Libo
(Arthritis Clinic and Research Center, People's Hospital, Beijing University, Beijing 100044， China)
【Abstract】 Objective To evaluate the changes of tyrosine phosphorylation status in rheumatoid arthritis(RA) fibroblast-like synoviocytes(FLS), and that in osteoarthritis(OA)FLS. Methods RA and OA FLS were primarily cultured. FLS type was defined by flow cytometry. After proteins were isolated from RA FLS and OA FLS, they were fractionated with SDS-PAGE single-dimensional electrophoresis and ICE-PAGE two-dimensional electrophoresis, followed by western blots for the determination of tyrosine phosphorylation status using specific anti-protein tyrosine phosphorylated antibody. Results In passage 3, the positive cells'proportion of CD3, CD14, CD11b, CD20,von Willibrand factor were less than 1% respectively. The extent of protein tyrosine phosphorylation in RA FLS was 4-6 times as high as that of OA FLS. Conclusion Synoviocytes of passage 3 were homogenous populations of fibroblast-like cells, protein tyrosine phosphorylation status in RA FLS increased much higher than that of OA FLS.
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【Key words】 Arthritis; Synovial membrane; Fibroblasts; Electrophoresis
类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性系统性疾病，它的病情进展综合体现了炎症、自身免疫和滑膜组织增生这三种病理生理过程。异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导致关节畸形和不同程度的功能障碍。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)是滑膜组织的重要组成成分，通过分泌各种蛋白酶类、花生四烯酸代谢产物及其细胞因子，在关节破坏过程中发挥重要作用。最近的研究发现，RAFLS具有转化细胞特征，而在骨性关节炎(osteoarthritis,OA)FLS中未发现该转化现象的存在，这种转化现象可能是RA发病的早期特征之一[1]。蛋白酪氨酸磷酸化在正常细胞中所占比例很小，但是在转化细胞中却可升高10～20倍[2]。本研究通过比较RA和OA关节病变中FLS蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，探讨RAFLS中蛋白酪氨酸激酶活性的改变。
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材料与方法
一、滑膜细胞的培养
滑膜组织均取材于在北京大学人民医院关节病诊疗研究中心行膝关节置换术或滑膜切除术的患者，其中RA20例，OA20例。所有患者均按国际诊断标准[3]确诊。术中取出滑膜组织，无菌条件下剪碎，1.0×10-3kg/LⅠ型胶原酶(Gibco-BRL)37℃消化4h，离心收集细胞，加入体积分数20%FBS-DMEM(Gibco-BRL)培养液中，置于37℃、体积分数为5%的CO2孵育箱中令其贴壁生长，24h后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗除去悬浮细胞，待细胞贴壁生长至85%汇满时，胰蛋白酶-EDTA消化进行1∶3传代培养。本实验均采用3～5代的滑膜细胞。
二、滑膜细胞类型鉴定
分别取1～3代滑膜细胞，用0.125mmol/LEDTA缓慢消化，PBS洗涤，台盼蓝染色计算活细胞数目，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD20、vonWillibrandfactor(SerotechUK)和PE标记的小鼠抗人CD11b，4℃作用45min；与含有体积分数为1%的马血清的PBS溶液充分混匀作用1h，体积分数为80%的酒精固定。实验均按三个平行管设计，重复6次。每次均以FITC和PE标记的鼠源性抗体作为阴性对照。样品集中用流式细胞仪测定相对荧光强度及各种表面标记阳性细胞比例。
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三、细胞蛋白提取和测定
将3～5代滑膜细胞以5×105的密度接种于60mmCostar平皿中，贴壁生长至85%汇满时，弃去培养液，预冷的PBS冲洗，加入100μl细胞裂解液[20mmol/LTris/Cl(pH值为7.5),0.01kg/LNP-40,150mmol/LNaCl,1×10-3kg/LNaN3,5×10-6kg/LAprotinin,1mmol/LPMSF,1mmol/LEDTA,1mmol/LNa3VO4,25μmol/LPNP',1μmol/L抑胃肽酶A,1μmol/L亮抑制肽]。刮下细胞，冰冻30min，12000r/min离心15min，取上清，-70℃冻存或冻成干粉，采用Bio-RadDCProteinAssay进行总蛋白浓度测定。
四、SDS-PAGE电泳和western印迹杂交
取30μg总蛋白，加入5×上样缓冲液[50mmol/LTris/Cl(pH值为6.8),500mmol/LDTT,0.1kg/LSDS,体积分数为20%的甘油及溴酚蓝]，进行体积分数10%SDS-PAGE电泳，半干转移至硝酸纤维素膜，0.05kg/L脱脂奶粉封闭过夜后，以1∶2000比例加入小鼠抗人蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10(Promega)，室温作用3h，Tween20-PBS洗膜5min×3次，HRP标记羊抗鼠IgG作用2h，同上洗膜3次后，ECL(Amersham)化学增强发光，KodakX线片曝光，显影。
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五、ICE-PAGE双向电泳
取10μg细胞裂解提取物，加入双向电泳上样缓冲液(9.7gUrea、5.5gAmpholytes、1.45gDTT、300μl0.01kg/L溴酚蓝、44.9mlH2O)。采用BicinchoninicAcidProteinAssay(Pierce)，确定总蛋白浓度，加入等量蛋白于第一向中。采用Millipore电泳仪，等电聚焦于18000V/h后，取下胶条，稳压下进行10%SDS-PAGE第二向电泳，稳流转移至硝酸纤维素膜，以后操作同步骤四。
六、图像灰度扫描及统计学处理
将上述发光显影的X线片应用四星Bio-Image软件做图像灰度扫描，结果进行显著性t检验。
结果
原代培养的滑膜细胞,PBS冲洗去除未贴壁的细胞,生长至85%汇满时,经流式细胞仪检测CD3阳性细胞为7.85%;CD14阳性细胞为7.30%;CD20阳性细胞为7.50%;vonWillibrandfactor阳性细胞为0.85%;CD11b阳性细胞为7.80%。当传代至第三代时,以上各种表面标记阳性细胞比例均小于1%。所以,滑膜细胞原代培养至第三代时,即可以获得型别较为均一的FLS,这与国外文献报道的结果相一致[4]。
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蛋白质进行SDS-PAGE单向电泳后进行westernblot检测,结果如图1所示,RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化程度明显高于OA,其中相对分子质量为170×103、150×103、110×103、95×103、85×103、70×103、66×103、54×103等条带的差异最为显著。RA灰度扫描值为1074346±8921，OA灰度扫描值为290790±2760，RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化程度约为OAFLS的4(3.8～4.9)倍，两者差异有非常显著性意义(t=2.728,P<0.01)。 蛋白质进行ICE-PAGE双向电泳检测,见图2。RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化位点较OAFLS明显增多,其中以相对分子质量42×103～95×103间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多,这与SDS-PAGE单向电泳结果相一致。但是,被检测出的蛋白酪氨酸磷酸化位点较SDS-PAGE单向电泳明显增多。对双向电泳结果进行灰度扫描,RAFLS灰度扫描值为4227672±8947，OAFLS为663480±7962,RAFLS的灰度扫描值约为OAFLS的6.5倍，两者差异有非常显著性意义
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图1比较RAFLS和OAFLS在SDS-PAGE
和westernblot中蛋白酪氨酸磷酸化程度差异
图2比较RAFLS和OAFLS在ICE-PAGE电泳中蛋白酪氨酸磷酸化程度差异
讨论
类风湿关节炎是一种慢性系统性疾病，全世界发病率为1%，我国发病率为0.3%，发病一年内致残率高达20%，严重影响人类的健康和生活质量。尽管对它的病理过程已经进行广泛研究，但是非免疫因素在RA病情进展中的作用尚未引起人们足够的重视。近来的研究表明，当将RSFLS与软骨共同植入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内时，可以自主性破坏软骨基质，而OAFLS和正常成纤维细胞则不具有这种特性[5]。这表明RAFLS发生不可逆性的改变，即使在脱离炎性环境条件下仍可以保持活化状态。越来越多的证据表明，RAFLS具有转化细胞特征，其表现在:(1)RAFLS细胞核大、苍白，核仁突出；(2)RAFLS在体外培养丧失接触抑制，可以形成类似于肿瘤细胞的巢样改变；(3)RAFLS可以在非贴壁情况下生长。这种转化特性可能是RA疾病发生的始发环节，并在RA病情进展中以非T细胞依赖方式在关节的破坏过程中发挥重要作用。
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1980年,Hunter[6]首先发现酪氨酸激酶(PTK)。现在已经证实，许多生长因子受体(INSR、PDGFR、EGFR、FGFR、TGFR、IGFR、HGFR、CSFR)等都具有PTK活性，一半以上的癌基因产物如c-src、c-neu、c-sis等也具有PTK活性。Hunter分析正常脊椎动物蛋白质磷酸化时发现,丝氨酸占92.19%，苏氨酸占7.78%，酪氨酸占0.03%。酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节[2]。癌基因活化后，PTK活性大大增加。1992年，Williams等[7]研究发现，RA滑膜细胞中的PTK活性远远高于OA。因此我们推测RAFLS的异常增殖和转化特性极可能伴有PTK活性的异常增高，我们在实验中通过SDS-PAGE单向电泳和ICE-PAGE双向电泳两种方法进一步证实了这一点，为RAFLS由于转化特性而呈持续活化状态提供了另一佐证。
研究蛋白质磷酸化最常用的方法是利用32Pi标记的无机磷酸盐进行生物合成标记。在磷酸化氨基酸中，磷酸化酪氨酸含量甚微,因而一般很难用32Pi标记在样品中检出,尤其当样品中含有大量丝氨酸磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难,只能通过电泳分级后进行碱处理,或RNA酶水解的办法提高磷酸化酪氨酸的检出率,步骤繁琐且容易发生放射性污染[8]。抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体,是研究酪氨酸激酶技术领域中的重大发现[6]。它无需借助于生物合成标记方法即可以鉴定磷酸化酪氨酸,而且达到很高的特异性和敏感性。ICE-PAGE双向电泳技术首先将蛋白质按等电点差异分离开来,然后依相对分子质量不同进一步分级,从而较SDS-PAGE单向电泳大大提高了分辨率。因此，在本实验中，SDS-PAGE单向电泳与ICE-PAGE双向电泳结果尽管基本一致,但是后者体现出的蛋白酪氨酸磷酸化位点较前者明显增多。
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综上所述,RAFLS的PTK活性明显高于OA,这可能是导致RA滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键。因此我们推测,RAFLS很可能存在原癌基因的活化或突变,或多种生长因子受体的持续激活,从而导致转化细胞的外观表现并伴有PTK活性的升高。对于RAFLS转化特性的深入研究必将对RA发病机制提出新的阐述,并为探讨RA的治疗方法开辟一条新路。
(本文编辑:马宏庆)
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(39730430)
参考文献
1，Lin CW, Robbins PD, Georgescu HI, et al. Effects of immortalization upon the induction of matrix metalloproteinases in rabbit synovial fribroblasts. Exp Cell Res, 1996, 223:117-126.
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2，乐志培，尹桂山，李国梁.生物信息胞内传递分子机理.第1版.北京:世界图书出版公司北京公司,1997.71-74.
3，Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988, 31:315-324.
4，Kawakami A, Eguchi K, Matsuoka N, et al. Inhibitory effects of interleukin-10 on synovial cells of rheumatoid arthritis.Immunology,1997, 91:252-259.
5，Muller-ladneru U, Kriegsmann J, Franklin BN, et al. Synovial fibroblasts of patients with rheumatoid arthritis attach to and invade normal human cartilage when engrafted into SCID mice. Am J Pathol, 1996, 149： 1607-1615.
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6，Hunter T. Tyrosine phosphorylation: past,present and future. Biochem Soc Trans, 1996, 24:307-327.
7，Williams WV, VonFeldt JM, Ramanujam T, et al. Tyrosine kinase signal transduction in rheumatoid synovitis. Semin Arthritis Rheum, 1992, 21:317-329.
8，Frederick MA, Roger B, Robert EK, eds. Short protocols in molecular biology.3rd ed. Boston： John Wiley ＆ Sons Inc, 1995. 808-809.
(收稿日期:1999-09-27), 百拇医药