GDNF及其对脊髓损伤修复的前景
作者：宋海涛 贾连顺
单位：宋海涛(解放军第107中心医院骨科，山东烟台 264002)；贾连顺(第二军医大学附属长征医院骨科)
关键词：
中国矫形外科杂志001218
中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1202-04
胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derved neurotrophic factor,GDNF)是近年 来发现并已克隆其基因的一种蛋白质，最初是由小鼠胶质细胞株B49细胞分离出来， 在体外能激活鼠胚中脑腹侧多巴胺(DA)能神经元摄取DA，并能促进神经元存活。该因子是由 两个单体通过糖基化二硫键结合成的二体，单体由134个氨基酸组成。它的7个半胱氨酸残基 在分子中的构象与转化生长因子(TGF-β)超家族成员相同，而且其序列中有近20%的同源性 ，从结构上看属于TGF-β超家族远亲[1]。近来发现其对损伤运动神经元亦有促 存活作用而受到重视，现将有关文献综述如下。
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1 GDNF受体及其信号传递途径
GDNF效应发挥依赖于与其受体的结合，GDNF受体的存在是对GDNF产生应答的前提。GDNF虽属 TGF-β超家族成员，但其受体却不是跨膜丝/苏氨基酸激酶，而由固定于胞膜外层的GDNFRα(糖基磷脂酰肌醇)和Ret蛋白(孤儿酪氨酸激酶)组成[2，3]。
GDNFRα是由应答GDNF的细胞表达的有468个氨基酸的蛋白，其氨基末端有具有分泌作用的信 号肽，羧基末端有23个疏水氨基酸、3个糖基化位点和30个半胱氨酸残基，构象与细胞激动 素(Cytokine)受体相似。它是与GDNF有高亲和力的细胞表面蛋白，通过GDNFRα附着于细胞 膜外层，因它既没有跨膜部分，亦没有胞内部分，故而它不能发出传导信号。有实验证明GD NF与GDNFRα的交联和结合是特异、可逆的；而且二者结合之后能协同GDNF信号传递，并促 进GDNFRα和Ret结合，诱导Ret酪氨酸的磷酸化[1，2]。
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Ret蛋白是原癌基因c-ret的编码产物，属受体酪氨酸激酶(RTK)超家族成员。爪蟾胚的生物 检测显示，只有同时注入编码Ret和GDNFmRNA的囊胚才能表达GDNF和Ret，单独注入GDNF或Re t或GDNF+RTK族其他成员mRNA均不能启动GDNF生物学效应，表明GDNF特殊活化Ret信号传导途 径，而使GDNF成为Ret特异配体；经孵育Ret卵母细胞检测125I-GDNF与Ret的结合 ，显示比对照组具有特异和直接的结合，表明Ret为GDNF功能性受体[3]。
2 GDNFmRNA在脊髓中的表达
通过组织切片、分子杂交、RNase保护分析及RT-PCR等方法，对大鼠不同发育期间GDNFmRNA 的分布作了较为全面的检测(特别是鼠胚发育期间)，发现许多接受GDNF营养作用的神经元的 靶组织一般都表达GDNFmRNA。鼠胚中枢系统及神经元靶组织如肌肉、皮肤都较高表达GDNFmR NA，提示在发育过程中GDNF对此区域神经元有支持作用。出生后各组织器官GDNFmRNA表达显 著下降，成年大鼠则表达甚微，但中枢系统如大脑黑质、海马、皮层及脊髓仍可检测到GDNF mRNA的表达[4，5]。
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脊髓神经元损伤后能否象其它TNF一样诱发GDNFmRNA表达目前报道尚不多见。有人作过如下 实验：切断坐骨神经，发现神经纤维中GDNFmRNA剧增，同时雪旺氏细胞表达GDNFmRNA [6]。Jongen发现，成年大鼠GDNF是在脊髓神经节内部神经元内产生，然后再顺行运 输到脊髓背侧角表层；进一步研究发现，切断一侧坐骨神经，使GDNF在脊髓背角表达较健侧 5d后减少40%，10d后减少超过80%，并持续100d[7]。脊髓损伤能否诱导脊髓神经元 或周围神经元GDNFmRNA的再表达?增加趋势是否象周围神经一样?能否说明GDNFmRNA的再表达 是一种自发保护反应?这些仍是尚需进一步研究课题。
3 GDNF对神经元的作用及可能机理
实验表明GDNF为多效能的神经营养因子，对感觉、运动及多巴胺能神经元均有营养作用，而 且其效应在个体发育的不同时期是有变化的[8～10]。
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3.1 对运动神经元的营养作用
近几年研究发现GDNF对运动神经元有明显的助存活、促分化、增强代谢的功能。对离体培养 的运动神经元助存活的50%有效浓度(EC50)为BDNF的1/75、CNTF的1/650及白细胞抑制 因子(LIF)的1/2?500[8]。一些实验还表明GDNF对运动神经元还有显著的修复 功能： 切断稚鸡面神经，可使脑核团中90%运动神经元死亡，少数存活者的神经元也萎缩；若在断 端加入GDNF，则可使几乎全部运动神经元存活[9]。Oppenheim的实验表明切断新生 鼠脊髓运动神经元，可使脊髓中40%～50%相应运动神经元死亡，存活者也呈现萎缩；在断端 加入GDNF则可有效阻止神经元死亡和萎缩，存活神经元胞体还有一定程度增大[10] 。以上结果说明，GDNF能打破体内运动神经元发育过程中自然存在的程序化死亡。GDNF对外 周神经系统中神经元的影响有限，不能促进三叉感觉神经元或交感神经元的存活；但用GDNF 处理胚胎发育期的交感神经元可以增加交感神经节内神经元的数目，说明GDNF能保护这些神 经元免遭细胞程序化死亡[9]。
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GDNF还是一种高效神经营养因子。实验表明在体内GDNF、CNTF、BDNF、NT-3和NT-4/5等多 种神经营养因子均影响运动神经元的存活，但其效能则大相径庭。在新生鼠面神经损伤模型 中，损伤后运动神经元的存活率CNTF由19%增加到76%，BDNF由13%增至47%，NT-3从13%增至 28%，NT-4/5则从28%增至70%，而GDNF却由6%增至100%[11，12]。
3.2 对多巴胺神经元的营养作用
最早发现GDNF的功能即是使体外培养的鼠胚中脑腹侧DA能神经元存活延长[1]。Bec k[12]等发现，作为多巴胺存活和分化的高特异性营养因子，GDNF能保护或恢复轴 索损伤或MFTP损伤的DA神经元的功能；黑质重复注射GDNF可明显减少前脑中束轴索损伤引起 的DA神经元的丢失(40%)。用MPTP神经毒注射鼠脑黑质纹状体，形成稳定的帕金森病鼠，之 后病鼠纹状体注射GDNF，观察到病鼠行动迟缓、四肢僵硬、震颤及体态不稳等方面症状均较 对照组明显缓解。免疫组化分析结果显示，经GDNF处理纹状体DA能神经元酪氨酸羟化酶免疫 活性升高，DA含量增加，DA代谢加强，DA神经元胞体增大[13]。
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4 关于GDNF的副作用
早期未见报道，随着GDNF研究的深入，近两年有人作了相关实验研究。GDNF主要副作用体重 下降，而且是剂量依赖性的。Zhang[14]用GDNF脑室注射治疗恒猴Parkinsinian征 ，分别给予10，30，100，300和1?000μgGDNF，结果显示：Parkinsonian征在100～1?000 μg 组有明显改善，但出现持续性体重下降：300μg组Parkinsinian征1月后仍有改善；1?000 μ g组还出现个别动物随意功能障碍。Giehl[15]切断大鼠皮质脊髓束并通过小脑延 髓 池分别注射GDNF 30、100、300μg，各组均发现受损神经元存活，但只有300μg组出现体重 减轻。Miyoshi[16]报道结合多巴胺、Sinemet可缓解体重减轻及多巴胺、Sinem et 的一些副作用。
5 GDNF在脊髓损伤中应用前景
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5.1脊髓损伤修复研究现状
近二十年来，大量的研究工作证实损伤的中枢神经元具有可塑性，也能再生；而且在NTFs作 用下再生速度及质量都有显著增强[17～19]。以往人们用来治疗脊髓损伤(SCI)的 方法包括胎髓移植、给予髓鞘相关蛋白抗体、外周神经移植搭桥及给予促轴突生长基质等， 但神经的功能恢复不尽人意。Kiernan[20]将中枢神经轴突再生失败归结为以下三 点：(1)轴突及轴突再生所必须的非神经细胞之间是否存在特殊的相容性；(2)围绕轴突生长 锥的细胞外空间是否存在血浆蛋白；(3)有否有效的特殊神经生长因子支持。Fawcett[ 21]将促进中枢系统再生方法归纳为两个方面：使环境更适于神经元生长及增加其再生潜 能，具体途径有：(1)阻断抑制分子，如抑制分子NI250被其抗体IN-1所阻断；(2)去 除抑制分子；(3)用合适的细胞充填损伤神经周围，如周围神经细胞、雪旺氏细胞能诱导轴 突再生；(4)应用营养因子刺激神经元再生，如各种NTFs，而且上述途径均可被不同的NTFs 所增强[22]。
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5.2 GDNF应用的理论基础
GDNF是一种神经营养因子NTFs。对NTFs(Neurotrophic Factors)的研究表明，脊髓损伤后NT Fs及其受体表达增加，表现自我保护作用。Wrathall[23]等研究结果表明，鼠中断 胸髓损伤后BDNF、NT3等首先在损伤部位明显增加，同时内源性NTFs分泌，自发挽救神经 的退化、死亡。这提示NTFs是治疗SCI的有效成分。虽然脊髓损伤后外周靶组织和损伤神经 元能产生有限和微量NTFs，但由于轴突受损，神经元失去与靶组织的联系，NTFs就不能再经 轴突转运到神经元胞体；加之大量神经元相互竞争NTFs，这就使不能得到足够NTFs的神经元 发生程序性死亡[24]。这为外源性GDNF治疗脊髓损伤提供了理论依据。尽管GDNF在 组织中含量极少，但由于近年基因工程技术的不断提高和完善，高纯度GDNF蛋白合成已不成 问题，为动物实验及亚临床应用奠定了物质基础。
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5.3 GDNF应用的可能方法
GDNF是一种蛋白，不能通过血脑屏障及脊髓屏障，亦不能通过消化道给药，必须通过有效方 法使其进入脊髓或其周围，才能发挥其最佳生物效应。目前的给药方法有：(1)直接或间接 灌注：具体途径有脑室内、小脑延髓池内及创缘给药，由于这种方法在操作上较为复杂及能 增加感染、加重脊髓损伤，而使其应用受到限制；(2)基因治疗：其方法是向脊髓损伤部位 移植产生GDNF的遗传修饰细胞如胶质细胞、成纤维细胞等，以提供促进神经元生长的微环境 ，该方法效果明显优于灌注方法[25]。
6 问题和展望
和其它NTFs一样，GDNF亦是一种小分子多肽，在神经损伤的保护和修复过程中发挥重要作用 ，这为脊髓损伤的治疗提供了新的药物和新的思路。由于它的多功能性、对靶细胞的选择性 ，在SCI后神经元再生瀑布式事件过程中可能仅作用于某一环节，而且多种NTFs必然相互影 响。故需要进一步探讨其在神经损伤中的分子机制，包括：(1)什么信号启动GDNF表达?损伤 是否是唯一的启动信号?(2)损伤和正常生理情况下GDNF的作用机制是否相同?(3)在何种情况 下GDNF才能充分发挥其神经营养和保护。还有，GDNF的毒副作用及作用剂量的研究尚少。
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总之，只有更深入地了解神经营养因子的功能和作用机制，才能更有效地利用神经营养因子 进行SCI的治疗。
作者简介：宋海涛(1964-)，男，主治医师，医学硕士。研究 方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0535)6531424-33348
参考文献：
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(收稿：2000-02-29 修回：2000-09-01), 百拇医药
单位：宋海涛(解放军第107中心医院骨科，山东烟台 264002)；贾连顺(第二军医大学附属长征医院骨科)
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中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1202-04
胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derved neurotrophic factor,GDNF)是近年 来发现并已克隆其基因的一种蛋白质，最初是由小鼠胶质细胞株B49细胞分离出来， 在体外能激活鼠胚中脑腹侧多巴胺(DA)能神经元摄取DA，并能促进神经元存活。该因子是由 两个单体通过糖基化二硫键结合成的二体，单体由134个氨基酸组成。它的7个半胱氨酸残基 在分子中的构象与转化生长因子(TGF-β)超家族成员相同，而且其序列中有近20%的同源性 ，从结构上看属于TGF-β超家族远亲[1]。近来发现其对损伤运动神经元亦有促 存活作用而受到重视，现将有关文献综述如下。
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1 GDNF受体及其信号传递途径
GDNF效应发挥依赖于与其受体的结合，GDNF受体的存在是对GDNF产生应答的前提。GDNF虽属 TGF-β超家族成员，但其受体却不是跨膜丝/苏氨基酸激酶，而由固定于胞膜外层的GDNFRα(糖基磷脂酰肌醇)和Ret蛋白(孤儿酪氨酸激酶)组成[2，3]。
GDNFRα是由应答GDNF的细胞表达的有468个氨基酸的蛋白，其氨基末端有具有分泌作用的信 号肽，羧基末端有23个疏水氨基酸、3个糖基化位点和30个半胱氨酸残基，构象与细胞激动 素(Cytokine)受体相似。它是与GDNF有高亲和力的细胞表面蛋白，通过GDNFRα附着于细胞 膜外层，因它既没有跨膜部分，亦没有胞内部分，故而它不能发出传导信号。有实验证明GD NF与GDNFRα的交联和结合是特异、可逆的；而且二者结合之后能协同GDNF信号传递，并促 进GDNFRα和Ret结合，诱导Ret酪氨酸的磷酸化[1，2]。
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Ret蛋白是原癌基因c-ret的编码产物，属受体酪氨酸激酶(RTK)超家族成员。爪蟾胚的生物 检测显示，只有同时注入编码Ret和GDNFmRNA的囊胚才能表达GDNF和Ret，单独注入GDNF或Re t或GDNF+RTK族其他成员mRNA均不能启动GDNF生物学效应，表明GDNF特殊活化Ret信号传导途 径，而使GDNF成为Ret特异配体；经孵育Ret卵母细胞检测125I-GDNF与Ret的结合 ，显示比对照组具有特异和直接的结合，表明Ret为GDNF功能性受体[3]。
2 GDNFmRNA在脊髓中的表达
通过组织切片、分子杂交、RNase保护分析及RT-PCR等方法，对大鼠不同发育期间GDNFmRNA 的分布作了较为全面的检测(特别是鼠胚发育期间)，发现许多接受GDNF营养作用的神经元的 靶组织一般都表达GDNFmRNA。鼠胚中枢系统及神经元靶组织如肌肉、皮肤都较高表达GDNFmR NA，提示在发育过程中GDNF对此区域神经元有支持作用。出生后各组织器官GDNFmRNA表达显 著下降，成年大鼠则表达甚微，但中枢系统如大脑黑质、海马、皮层及脊髓仍可检测到GDNF mRNA的表达[4，5]。
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脊髓神经元损伤后能否象其它TNF一样诱发GDNFmRNA表达目前报道尚不多见。有人作过如下 实验：切断坐骨神经，发现神经纤维中GDNFmRNA剧增，同时雪旺氏细胞表达GDNFmRNA [6]。Jongen发现，成年大鼠GDNF是在脊髓神经节内部神经元内产生，然后再顺行运 输到脊髓背侧角表层；进一步研究发现，切断一侧坐骨神经，使GDNF在脊髓背角表达较健侧 5d后减少40%，10d后减少超过80%，并持续100d[7]。脊髓损伤能否诱导脊髓神经元 或周围神经元GDNFmRNA的再表达?增加趋势是否象周围神经一样?能否说明GDNFmRNA的再表达 是一种自发保护反应?这些仍是尚需进一步研究课题。
3 GDNF对神经元的作用及可能机理
实验表明GDNF为多效能的神经营养因子，对感觉、运动及多巴胺能神经元均有营养作用，而 且其效应在个体发育的不同时期是有变化的[8～10]。
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3.1 对运动神经元的营养作用
近几年研究发现GDNF对运动神经元有明显的助存活、促分化、增强代谢的功能。对离体培养 的运动神经元助存活的50%有效浓度(EC50)为BDNF的1/75、CNTF的1/650及白细胞抑制 因子(LIF)的1/2?500[8]。一些实验还表明GDNF对运动神经元还有显著的修复 功能： 切断稚鸡面神经，可使脑核团中90%运动神经元死亡，少数存活者的神经元也萎缩；若在断 端加入GDNF，则可使几乎全部运动神经元存活[9]。Oppenheim的实验表明切断新生 鼠脊髓运动神经元，可使脊髓中40%～50%相应运动神经元死亡，存活者也呈现萎缩；在断端 加入GDNF则可有效阻止神经元死亡和萎缩，存活神经元胞体还有一定程度增大[10] 。以上结果说明，GDNF能打破体内运动神经元发育过程中自然存在的程序化死亡。GDNF对外 周神经系统中神经元的影响有限，不能促进三叉感觉神经元或交感神经元的存活；但用GDNF 处理胚胎发育期的交感神经元可以增加交感神经节内神经元的数目，说明GDNF能保护这些神 经元免遭细胞程序化死亡[9]。
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GDNF还是一种高效神经营养因子。实验表明在体内GDNF、CNTF、BDNF、NT-3和NT-4/5等多 种神经营养因子均影响运动神经元的存活，但其效能则大相径庭。在新生鼠面神经损伤模型 中，损伤后运动神经元的存活率CNTF由19%增加到76%，BDNF由13%增至47%，NT-3从13%增至 28%，NT-4/5则从28%增至70%，而GDNF却由6%增至100%[11，12]。
3.2 对多巴胺神经元的营养作用
最早发现GDNF的功能即是使体外培养的鼠胚中脑腹侧DA能神经元存活延长[1]。Bec k[12]等发现，作为多巴胺存活和分化的高特异性营养因子，GDNF能保护或恢复轴 索损伤或MFTP损伤的DA神经元的功能；黑质重复注射GDNF可明显减少前脑中束轴索损伤引起 的DA神经元的丢失(40%)。用MPTP神经毒注射鼠脑黑质纹状体，形成稳定的帕金森病鼠，之 后病鼠纹状体注射GDNF，观察到病鼠行动迟缓、四肢僵硬、震颤及体态不稳等方面症状均较 对照组明显缓解。免疫组化分析结果显示，经GDNF处理纹状体DA能神经元酪氨酸羟化酶免疫 活性升高，DA含量增加，DA代谢加强，DA神经元胞体增大[13]。
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4 关于GDNF的副作用
早期未见报道，随着GDNF研究的深入，近两年有人作了相关实验研究。GDNF主要副作用体重 下降，而且是剂量依赖性的。Zhang[14]用GDNF脑室注射治疗恒猴Parkinsinian征 ，分别给予10，30，100，300和1?000μgGDNF，结果显示：Parkinsonian征在100～1?000 μg 组有明显改善，但出现持续性体重下降：300μg组Parkinsinian征1月后仍有改善；1?000 μ g组还出现个别动物随意功能障碍。Giehl[15]切断大鼠皮质脊髓束并通过小脑延 髓 池分别注射GDNF 30、100、300μg，各组均发现受损神经元存活，但只有300μg组出现体重 减轻。Miyoshi[16]报道结合多巴胺、Sinemet可缓解体重减轻及多巴胺、Sinem et 的一些副作用。
5 GDNF在脊髓损伤中应用前景
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5.1脊髓损伤修复研究现状
近二十年来，大量的研究工作证实损伤的中枢神经元具有可塑性，也能再生；而且在NTFs作 用下再生速度及质量都有显著增强[17～19]。以往人们用来治疗脊髓损伤(SCI)的 方法包括胎髓移植、给予髓鞘相关蛋白抗体、外周神经移植搭桥及给予促轴突生长基质等， 但神经的功能恢复不尽人意。Kiernan[20]将中枢神经轴突再生失败归结为以下三 点：(1)轴突及轴突再生所必须的非神经细胞之间是否存在特殊的相容性；(2)围绕轴突生长 锥的细胞外空间是否存在血浆蛋白；(3)有否有效的特殊神经生长因子支持。Fawcett[ 21]将促进中枢系统再生方法归纳为两个方面：使环境更适于神经元生长及增加其再生潜 能，具体途径有：(1)阻断抑制分子，如抑制分子NI250被其抗体IN-1所阻断；(2)去 除抑制分子；(3)用合适的细胞充填损伤神经周围，如周围神经细胞、雪旺氏细胞能诱导轴 突再生；(4)应用营养因子刺激神经元再生，如各种NTFs，而且上述途径均可被不同的NTFs 所增强[22]。
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5.2 GDNF应用的理论基础
GDNF是一种神经营养因子NTFs。对NTFs(Neurotrophic Factors)的研究表明，脊髓损伤后NT Fs及其受体表达增加，表现自我保护作用。Wrathall[23]等研究结果表明，鼠中断 胸髓损伤后BDNF、NT3等首先在损伤部位明显增加，同时内源性NTFs分泌，自发挽救神经 的退化、死亡。这提示NTFs是治疗SCI的有效成分。虽然脊髓损伤后外周靶组织和损伤神经 元能产生有限和微量NTFs，但由于轴突受损，神经元失去与靶组织的联系，NTFs就不能再经 轴突转运到神经元胞体；加之大量神经元相互竞争NTFs，这就使不能得到足够NTFs的神经元 发生程序性死亡[24]。这为外源性GDNF治疗脊髓损伤提供了理论依据。尽管GDNF在 组织中含量极少，但由于近年基因工程技术的不断提高和完善，高纯度GDNF蛋白合成已不成 问题，为动物实验及亚临床应用奠定了物质基础。
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5.3 GDNF应用的可能方法
GDNF是一种蛋白，不能通过血脑屏障及脊髓屏障，亦不能通过消化道给药，必须通过有效方 法使其进入脊髓或其周围，才能发挥其最佳生物效应。目前的给药方法有：(1)直接或间接 灌注：具体途径有脑室内、小脑延髓池内及创缘给药，由于这种方法在操作上较为复杂及能 增加感染、加重脊髓损伤，而使其应用受到限制；(2)基因治疗：其方法是向脊髓损伤部位 移植产生GDNF的遗传修饰细胞如胶质细胞、成纤维细胞等，以提供促进神经元生长的微环境 ，该方法效果明显优于灌注方法[25]。
6 问题和展望
和其它NTFs一样，GDNF亦是一种小分子多肽，在神经损伤的保护和修复过程中发挥重要作用 ，这为脊髓损伤的治疗提供了新的药物和新的思路。由于它的多功能性、对靶细胞的选择性 ，在SCI后神经元再生瀑布式事件过程中可能仅作用于某一环节，而且多种NTFs必然相互影 响。故需要进一步探讨其在神经损伤中的分子机制，包括：(1)什么信号启动GDNF表达?损伤 是否是唯一的启动信号?(2)损伤和正常生理情况下GDNF的作用机制是否相同?(3)在何种情况 下GDNF才能充分发挥其神经营养和保护。还有，GDNF的毒副作用及作用剂量的研究尚少。
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总之，只有更深入地了解神经营养因子的功能和作用机制，才能更有效地利用神经营养因子 进行SCI的治疗。
作者简介：宋海涛(1964-)，男，主治医师，医学硕士。研究 方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0535)6531424-33348
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(收稿：2000-02-29 修回：2000-09-01), 百拇医药