深部真菌感染血清真菌成分检测方法研究进展
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国外医学临床生物化学与检验学分册 2002年第2期第23卷
第三军医大学西南医院皮肤科；400038 廖军(综述)；郝飞(审校)
关键词：血清诊断；烯醇化酶；beta-葡聚糖；甘露糖；Cand-Tec
摘要：烯醇化酶、Beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tec等是真菌胞壁或细胞内的组成成分。文中就其生物学特性及其作为深部真菌感染宿主的特征性标志物在诊断深部真菌感染宿主的特征标志物诊断深部真菌感染中的价值等方面加以综述。
真菌在人体中，与细菌之间起着重要的微生态平衡作用。近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。据统计，近30年深部真菌感染的发病增加了3～5倍，真菌感染已成为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色珠菌、曲菌和隐球菌等。传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养历地太长，且阳性率较低，而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限。近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。目前的血清学检查主要针对真菌胞壁或胞内成分——烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tecr抗原等。
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1、烯醇化酶
烯醇化酶又称2-磷酸-D-甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油盐向磷酸烯醇式丙酮盐转变，同时也在糖异生过程中催化逆赂反应。烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守。它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，近年来已被分离纯化。研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念珠菌一般不会释放该酶。Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标本中的白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活极和血培养加以对照。在组织活检或血培养中阳性的24例肿瘤患者中，抗原阳性18例，146例组织活检或血培养阴性的肿瘤患者中，抗原阳性6例。敏感性和特异性分别为75%和96%。另外，烯醇化酶在体内具有很强的抗原性，导致其在体内清除较快，数量减少，及抗白色念珠菌烯醇化酶抗体与其它念珠菌烯醇化酶有较弱的交叉反应，均可导致烯醇化酶在体内不能检出。Zoller等大免疫健全和免疫缺陷的混合人群中，以血清中是否含有抗烯醇化酶抗体来诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感性分别为96.4%和81.5%。我们可通过监测患者血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度的动态变化来提高烯醇化酶抗体检出率及临床应用价值。
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2、beta-葡聚糖
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%～90%。其中(1→3)beta-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状(1→6)beta-D-葡糖糖残基作为侧链。对于(1→3)beta-葡糖糖在深部真菌感染中的作用，Yoshida M等认为可能与内毒素在革兰氏阴性杆菌感染中的作用类似，但目前暂未明了。由于(1→3)beta-葡糖糖仅广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进行人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1→3)beta-D-葡糖糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液(如尿、脑脊液，腹水，胸水等)中(1→3)beta-D-葡糖糖含一增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除(1→3)beta-D-葡糖糖。而在浅部真菌感染中，(1→3)beta-D-葡糖糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。
20世纪90年代初发现，(1→3)beta-D-葡糖糖可特异性激活自鲎变形细胞溶解产物提取的G因子，从而旁路激活鲎试验，此过程称为G试验。临床上，由于深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致，故可将G试验应用于深部真菌感染的诊断(包括念珠菌感染和曲菌感染等)。为了解G试验在深部真菌感染和真菌性发热中的诊断价值，Obayashi等检测了202例病员标本。(1→3)beta-D-葡糖糖的血浆浓度20pg/ml为界佳，41例确诊病员(以活检和培养阳性为标准)中有37例为阳性，阳性率为90%；59例其他原因所致发热者全部阴性，阴性率为100%；102例不明原因发热有26例阳性；把102例不明原因发热当作非真菌感染的话，则本试验的阳性率为59%，阴性率为97%，有效率为85%。若有一个能区别非真菌和真菌感染的更敏感的金标准的话，则可进一步提高本试验的阳性指标率。(1→3)beta-D-葡糖糖可用于早期诊断深部真菌感染，其缺点是不能能定性，且此法不能检测出隐球菌感染，可能是因为隐球菌具有厚壁胞膜，且在免疫缺陷患者体内生长缓慢，导致试验呈假阴性。Kawayana等检测了92例病员标本以比较深部真菌感染中的血清学方法和培养的临床价值，其中17例为深部真菌确诊病员。在取自17例确诊病员的52份血标本中，45份血标本G试验阳性，与此同时，仅有10份血标本真菌培养阳性，结果显示，G试验在深部真菌感染的早期诊断中具有较高敏感性和特异性。
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3、甘露糖
甘露糖是目前研究最为广泛的一种抗原，它对热稳定，广泛存在于真菌胞壁中，是真菌胞壁的重要组成成分，它的主要结构为D-甘露糖，由N-LPRU(90%)和O-连接(10%)的寡糖组成，N-连接的甘露糖以一个外展性α-1，6寡甘露糖为骨架，α-1，2-和α-1，3-连接的寡甘露糖为侧链。O-甘露糖由短的、线性α-1，2和α-1，3-连接的寡甘露糖组成。甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不变的，常常受周围环境的营养状态和细胞形态的影响。其在真菌致病过程中参与了免疫调节、防御，且抗甘露糖抗体具有保护性作用。已有多种血清学方法用于光碳氢化合物电泳等。Kume等使用Pastorex法检测深部念珠菌血症得到其特异性和敏感性分别为28.6%和91.7%。但它并不与克柔念珠菌的甘露糖发生反应，故不能应用于克柔念珠菌病的诊断。由于甘露糖广泛存在于各真菌细胞中，导致此检测方法特异性很低，限制了它的临床应用。FACE法是一种用于检测寡糖的免疫荧光碳氢化合物电泳方法，由于甘露糖由大量的寡糖组成，Goins等应用FACE法将不同大小的寡糖分离开来，可帮助鉴别不同菌株的念珠菌，包括克柔念珠菌，所以此法是一种易行的、敏感的定量方法，并可用于研究寡糖在真菌致病过程中的作用。
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4、Cand-Tec抗原
Cand-Tec抗原是指可用念珠菌属检测系统(Cand Tec，一种颗粒凝集试验系统)检测的一类念珠菌蛋白抗原，它对热不稳定，至少包含3种成分。Tananka等将100例病员根据Cand-Tec乳腺凝集反应的反应滴度分为两组。滴度低于1∶2的为CI组，高于1∶4的为C2组。结果显示，当没度高于1∶4时，对于不明原因的发热进行预防性抗真菌治疗是有利的。Iwasaki等检测了12例急性白血病病员在治疗后发生的12次发热，相对于化疗前，化疗后的Cand-Tec抗原滴度有明显增高，而在进行抗真菌治疗后有9次发热抗真菌治疗有效，同时Cand-Tec抗原滴度明显降低或恢复政治；2例抗真菌治疗无效且其Cand-Tec抗原滴度也无降低。结果提示此种方法是一种可用于早期诊断深部念珠菌病的快速、有效的方法，可用于决定进行抗真菌治疗的时间。
Mitsutake等比较上述四种方法，他们以免疫凝集反应检测烯醇化酶，以Cand-Tec系统检测Cand-Tec抗原，G试验检测beta-葡聚糖，Pastorex法检测甘露糖，39例病员中包括10例浅表念珠菌感染，10例深部真菌感染。结果分别为；烯醇化酶、Cand-Tec抗原、beta-葡聚糖和甘露糖的特异性和敏感性分别为100%和71.8%、76.9%和87.5%、84.4%、和87.5%、25.6%和100%。结果显示，深部真菌感染的血清真菌成分检查快速、有效，当患者经抗真菌治疗病情好转后，血清滴度可逐渐降低，但尚无一种方法的敏感性和特异性令人满意，如能结合两种以上方法进行检测，则可明显提高诊断的准确性。, 百拇医药
关键词：血清诊断；烯醇化酶；beta-葡聚糖；甘露糖；Cand-Tec
摘要：烯醇化酶、Beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tec等是真菌胞壁或细胞内的组成成分。文中就其生物学特性及其作为深部真菌感染宿主的特征性标志物在诊断深部真菌感染宿主的特征标志物诊断深部真菌感染中的价值等方面加以综述。
真菌在人体中，与细菌之间起着重要的微生态平衡作用。近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。据统计，近30年深部真菌感染的发病增加了3～5倍，真菌感染已成为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色珠菌、曲菌和隐球菌等。传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养历地太长，且阳性率较低，而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限。近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。目前的血清学检查主要针对真菌胞壁或胞内成分——烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tecr抗原等。
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1、烯醇化酶
烯醇化酶又称2-磷酸-D-甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油盐向磷酸烯醇式丙酮盐转变，同时也在糖异生过程中催化逆赂反应。烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守。它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，近年来已被分离纯化。研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念珠菌一般不会释放该酶。Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标本中的白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活极和血培养加以对照。在组织活检或血培养中阳性的24例肿瘤患者中，抗原阳性18例，146例组织活检或血培养阴性的肿瘤患者中，抗原阳性6例。敏感性和特异性分别为75%和96%。另外，烯醇化酶在体内具有很强的抗原性，导致其在体内清除较快，数量减少，及抗白色念珠菌烯醇化酶抗体与其它念珠菌烯醇化酶有较弱的交叉反应，均可导致烯醇化酶在体内不能检出。Zoller等大免疫健全和免疫缺陷的混合人群中，以血清中是否含有抗烯醇化酶抗体来诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感性分别为96.4%和81.5%。我们可通过监测患者血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度的动态变化来提高烯醇化酶抗体检出率及临床应用价值。
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2、beta-葡聚糖
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%～90%。其中(1→3)beta-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状(1→6)beta-D-葡糖糖残基作为侧链。对于(1→3)beta-葡糖糖在深部真菌感染中的作用，Yoshida M等认为可能与内毒素在革兰氏阴性杆菌感染中的作用类似，但目前暂未明了。由于(1→3)beta-葡糖糖仅广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进行人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1→3)beta-D-葡糖糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液(如尿、脑脊液，腹水，胸水等)中(1→3)beta-D-葡糖糖含一增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除(1→3)beta-D-葡糖糖。而在浅部真菌感染中，(1→3)beta-D-葡糖糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。
20世纪90年代初发现，(1→3)beta-D-葡糖糖可特异性激活自鲎变形细胞溶解产物提取的G因子，从而旁路激活鲎试验，此过程称为G试验。临床上，由于深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致，故可将G试验应用于深部真菌感染的诊断(包括念珠菌感染和曲菌感染等)。为了解G试验在深部真菌感染和真菌性发热中的诊断价值，Obayashi等检测了202例病员标本。(1→3)beta-D-葡糖糖的血浆浓度20pg/ml为界佳，41例确诊病员(以活检和培养阳性为标准)中有37例为阳性，阳性率为90%；59例其他原因所致发热者全部阴性，阴性率为100%；102例不明原因发热有26例阳性；把102例不明原因发热当作非真菌感染的话，则本试验的阳性率为59%，阴性率为97%，有效率为85%。若有一个能区别非真菌和真菌感染的更敏感的金标准的话，则可进一步提高本试验的阳性指标率。(1→3)beta-D-葡糖糖可用于早期诊断深部真菌感染，其缺点是不能能定性，且此法不能检测出隐球菌感染，可能是因为隐球菌具有厚壁胞膜，且在免疫缺陷患者体内生长缓慢，导致试验呈假阴性。Kawayana等检测了92例病员标本以比较深部真菌感染中的血清学方法和培养的临床价值，其中17例为深部真菌确诊病员。在取自17例确诊病员的52份血标本中，45份血标本G试验阳性，与此同时，仅有10份血标本真菌培养阳性，结果显示，G试验在深部真菌感染的早期诊断中具有较高敏感性和特异性。
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3、甘露糖
甘露糖是目前研究最为广泛的一种抗原，它对热稳定，广泛存在于真菌胞壁中，是真菌胞壁的重要组成成分，它的主要结构为D-甘露糖，由N-LPRU(90%)和O-连接(10%)的寡糖组成，N-连接的甘露糖以一个外展性α-1，6寡甘露糖为骨架，α-1，2-和α-1，3-连接的寡甘露糖为侧链。O-甘露糖由短的、线性α-1，2和α-1，3-连接的寡甘露糖组成。甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不变的，常常受周围环境的营养状态和细胞形态的影响。其在真菌致病过程中参与了免疫调节、防御，且抗甘露糖抗体具有保护性作用。已有多种血清学方法用于光碳氢化合物电泳等。Kume等使用Pastorex法检测深部念珠菌血症得到其特异性和敏感性分别为28.6%和91.7%。但它并不与克柔念珠菌的甘露糖发生反应，故不能应用于克柔念珠菌病的诊断。由于甘露糖广泛存在于各真菌细胞中，导致此检测方法特异性很低，限制了它的临床应用。FACE法是一种用于检测寡糖的免疫荧光碳氢化合物电泳方法，由于甘露糖由大量的寡糖组成，Goins等应用FACE法将不同大小的寡糖分离开来，可帮助鉴别不同菌株的念珠菌，包括克柔念珠菌，所以此法是一种易行的、敏感的定量方法，并可用于研究寡糖在真菌致病过程中的作用。
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4、Cand-Tec抗原
Cand-Tec抗原是指可用念珠菌属检测系统(Cand Tec，一种颗粒凝集试验系统)检测的一类念珠菌蛋白抗原，它对热不稳定，至少包含3种成分。Tananka等将100例病员根据Cand-Tec乳腺凝集反应的反应滴度分为两组。滴度低于1∶2的为CI组，高于1∶4的为C2组。结果显示，当没度高于1∶4时，对于不明原因的发热进行预防性抗真菌治疗是有利的。Iwasaki等检测了12例急性白血病病员在治疗后发生的12次发热，相对于化疗前，化疗后的Cand-Tec抗原滴度有明显增高，而在进行抗真菌治疗后有9次发热抗真菌治疗有效，同时Cand-Tec抗原滴度明显降低或恢复政治；2例抗真菌治疗无效且其Cand-Tec抗原滴度也无降低。结果提示此种方法是一种可用于早期诊断深部念珠菌病的快速、有效的方法，可用于决定进行抗真菌治疗的时间。
Mitsutake等比较上述四种方法，他们以免疫凝集反应检测烯醇化酶，以Cand-Tec系统检测Cand-Tec抗原，G试验检测beta-葡聚糖，Pastorex法检测甘露糖，39例病员中包括10例浅表念珠菌感染，10例深部真菌感染。结果分别为；烯醇化酶、Cand-Tec抗原、beta-葡聚糖和甘露糖的特异性和敏感性分别为100%和71.8%、76.9%和87.5%、84.4%、和87.5%、25.6%和100%。结果显示，深部真菌感染的血清真菌成分检查快速、有效，当患者经抗真菌治疗病情好转后，血清滴度可逐渐降低，但尚无一种方法的敏感性和特异性令人满意，如能结合两种以上方法进行检测，则可明显提高诊断的准确性。, 百拇医药