Nicorandil改善心肌保存液保存效果的实验研究
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体外循环杂志 2001年第4期第3卷
100037 北京，中国医学科学院阜外心血管病医院麻醉与体外循环研究室 史红宇；周刚；张福亭；林秉铨；孙兆玉；龙村
关键词：HTK液；UW液；尼克地尔；心肌保护
摘要：
目的 目的：在离体鼠心Langendorff灌注模型上，检验心肌保存液中加入Nicorandil对心肌保存液保存效果的影响。
方法：实验分为4组，UW液组、HTK液组、UW液组+Nicorandil组和HTK液+Nicorandil组，每组8只wistar雄性大白鼠。麻醉和抗凝后，快速取下鼠心并悬挂在Langendorff灌注模型上灌注，37℃下测定血流动力学基础值和冠脉流量。分别用四种保存液灌停离体鼠心并低温(4℃)保存4小时。重新复温复灌，再次测定血流动力学值和冠脉流量，留取标本分别测定心肌水含量、心肌酶漏出量、ATP和CP含量和心肌细胞超微结构变化。
, 百拇医药
结果：心肌血流动力学恢复率中HTK液组高于UW液组；UW液+Nicorandil组高于UW液组；HTK液+Nicorandil组高于HTK液组；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组。心肌水含量4组间差异无显著意义。冠脉流量恢复率，在记录的前30分钟HTK液组优于UW液组；HTK液+Nicorandil组优于UW液+Nicorandil组，冠脉流出液心肌酶漏出量，HTK液组低于UW液组；HTK液+Nicorandil组低于HTK液组；UW液+Nicorandil组略低于UW液组。心肌中ATP和CP含量，HTK组高于UW组；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组。心肌细胞超微结构变化，HTK液+Nicorandil组心肌损害最轻，HTK组轻于UW液+Nicorandil组，UW液组心肌损害最严重。
结论：HTK液和UW液都是比较合适的心肌保存液，Nicorandil能够改善心肌保存液的保存效果。
, 百拇医药 1967年人类首例心脏移植成功以来，心脏移植作为治疗终末期心脏疾病的唯一有效手段，其生存率逐年提高，这首先取决于外科技术的不断发展和创新，同时也与供体心脏保存技术的提高、心肌保存液的不断改进有着密切的联系。临床上观察，心脏移植术后30天内死亡的病历数与供心保存不佳有着明显的相关性。目前，在深低温(0～4℃)的条件下，以UW液(Uinversity of Wisconsin solution)和HTK液(histidine-trytophane-ketoglutarate solution)对心肌的保存效果为佳。但当前临床心脏保存安全时限只能达到4～6小时〔1〕，移植后心脏功能都有不同程度的下降。如何进一步提高心肌保存液的保存效果和尽可能的延长心肌保存的时限是我们要解决的重要课题。尼克地尔(nicorandil)是一种ATP-K离子通道开放剂，具有选择性的开放ATP敏感钾离子通道的功能，在心肌保存淮中加入nicorandil有可能提高心肌保存液的保存效果。本实验的目的是在离体鼠心Lnagendorff灌注模型上，检验心肌保存液中加入nicorandil对心肌保存液保存效果的影响。
, 百拇医药
材料和方法
1.主要仪器和设备
ADInstruments生理记录仪和IBM电脑，记录和分析数据，数据处理采用Powerlab 3.4.6软件。德国Stockert Ⅱ型双头滚压泵，恒温循环器，热交换器，各种合适口径塑料管和硅胶管、接头、三通，用于组装Langendorff灌注模型。
2.药品和溶液配制：
(1)UW液，购自美国，用于使心脏停跳和保存心脏(成分见表1)。
(2)HTK液，购自美国，用于使心脏停跳和保存心脏(成分见表1)。
(3)Nicorandil购自日本，分别直接加入UW液和HTK液中，配成浓度为1.0mmol/L的溶液，充分震荡，置于4℃冰箱中静置24小时后用于实验。
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(4)K-H缓冲液自行配制，使用前用95%O2和5%CO2混合气预充20～30分钟。
表1 UW液、HTK液和K-H缓冲液成分(pH:7.4±0.5)
HTKmmol/L
UWmmol/L
K-Hmmol/L
NaCl
15
KH2PO4
25
NaCl
, 百拇医药
118.5
KCl
9
KCl
5
NaHCO3
25.0
MgCl2
4
Adenosine
3
KH2PO4
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1.2
k-Ketogluaration
1
Glutathione
3
KCl
4.8
Histidine
180
MgSO4
5
MgSO4
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1.2
Histidine
18
Raffinose
30
CaCl2
1.8
Histidine
30
Allopurinol
0.01
Glucose
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11.0
k-Lactobionate
100
Pentastarch
5%
3.实验动物和分组：
选用Wistar雄性大白鼠32只，体重300至400克，由北京阜外医院实验动物科提供。根据实验目的，随机分为四组(UW液组、HTK液组、UW液+Nicorandil组、HTK液+Nicorandil组)，每组8只。
4.离体鼠心的切取、灌注和低温保存：
大白鼠称体重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg)麻醉，仰卧固定于操作台上，游离出股静脉，经股静脉内注射肝素3mg/kg。迅速开胸，于主动脉和右锁骨下动脉交界处切断主动脉。取出心脏，立即放入0～4℃ K-H缓冲液中，冲洗掉残留在主动脉内的血液。主动脉插管后，速移至Langendorff灌注装置上，用K-H液灌注，灌注压为75cm,H2O，K-H液经40μm孔径的过滤器过滤，以除去杂质。整个灌注期间用95%O2和5%CO2混合气平衡，灌注温度维持在37℃。肺动脉根部切开，使冠状动脉回流液引流充分。从开胸取心至灌注开始要在50～70秒内完成，尽量减少心肌缺血时间，超过70秒应放弃实验。灌注3分钟后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将带有测压导管的心室球囊送入左心室，测压导管(用生理盐水充满)的另一端连接多导生理记录仪。离体鼠心功能稳定后，往心室球囊内缓慢注射适量生理盐水(40～60μl)，使左心室舒张末压为10mmHg(1mmHg=0.133kPa)。平衡15分钟后，使心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值，包括左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左室压力微分(±dp/dt)和冠脉流量(CF)。
, 百拇医药
降低温度至30℃以下，经主动脉灌注4℃的不同心肌停跳液(UW液、HTK液、UW液+Nicorandil、HTK液+Nicorandil)，根据冠脉流量调节灌注速度，灌注压为75cmH2O，灌注时间控制在180秒以内。心脏停跳后，把恒温循环器温度降至4℃，每只心脏在四种心肌保存液中分别低温保存4小时。为减小实验误差，心脏保存时不从Lnagendorff灌注模装置上取下。
4 小时后，复温至37℃，重新开始灌注。平衡15～20分钟以后，心脏作功达到稳定状态，每隔10分钟测定一次轿流动力学基础值(CF、LVEDP、LVESP、LVDP、+dp/dt、-dp/dt)，连续测定6次。观察并记录心脏停跳前后的心律、停跳时间和复跳时间。留取冠脉流出液，置于-20℃冰箱中保存，以测定心肌酶漏出量。心脏灌注完成后，于左心室上取一块心肌(重要大于200mg)，每次位置尽可能一致，置于液氮罐中保存，以备测定心肌ATP和CP含量。另取一块心肌组织，称湿重后放入100℃的烘箱中烘烤24小时，再次称干重，计算心肌含水量。心肌含水量=〔(湿重-干重)/温重〕×100%。每组中选取一个心脏，留取两块标本，光镜标本用10%甲醛溶液固定；电镜标本用3%戊二醛溶液固定后，置于4℃冰箱中保存，以备光镜和电镜检查。
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5.统计学处理：
四组资料用SPSS 10.0软件处理，组内用均数±标准差表示，两组间用独立t检验，多组间用f检验。
结 果
1.保存后心功能恢复情况
(1)血流动力学恢复率：
从总的趋势来看，HTK液组高于UW液组(P<0.05)；UW液+Nicorandil组高于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组高于HTK液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组恢复高于UW液+Nicorandil组(P<0.05)，见表2。
表2 四组血流动力学恢复率表(n=8)
组别
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LVESP
LVEDP
LVDP
+dp/dt
-dp/dt
U
44.91%±5.93%
53.25%±9.63%
40.75%±5.05%
41.51%±10.61%
43.57%±8.83%
H
, 百拇医药
64.28%±12.25%
80.45%±7.69%
62.85%±13.90%
58.82%±7.48%
73.05%±7.51%
U+N
59.62%±8.84%
58.74%±10.58%
56.57%±9.68%
61.01%±12.66%
62.66%±14.72%
, 百拇医药
H+N
66.62%±10.45%
78.65%±8.76%
68.23%±6.00%
71.72%±10.26%
75.41%±11.09%
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
(2)冠脉流量恢复率： 在记录的前30分钟HTK液高于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组(P<0.05)；后35分钟两组差异无显著意义，见表3。
表3 冠脉流量恢复率表(n=8)
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组别
15分钟
25分钟
35分钟
45分钟
55分钟
65分钟
U
49.05%±19.94%
57.66%±22.22%
63.71%±19.01%
64.85%±19.75%
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66.30%±17.60%
66.08%±17.57%
H
83.2%±12.06%
81.68%±15.11%
79.70%±14.60%
79.94%±15.11%
78.01%±14.18%
79.08%±14.48%
U+N
57.88%±12.17%
, 百拇医药
62.11%±15.31%
65.39%±14.56%
67.28%±14.96%
63.66%±18.03%
65.38%±13.95%
H+N
83.69%±21.53%
82.65%±15.36%
81.74%±13.68%
79.78%±11.99%
71.03%±16.56%
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71.07%±15.46%
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
2.心肌内水含量： 四组见心肌含水量差异无显著意义，见表4。
表4 心肌含水量表(用百分数表示，n=8)
组别
心肌含水量
U
82.38%±21.18%
H
79.13%±22.85%
U+N
, 百拇医药
80.88%±21.35%
H+N
81.33%±22.09%
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
3.心肌内ATP含量： HTK液组明显高于UW液组(P< 0.01)；HTK液+Nicorandil组高于HTK液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组的高于UW液+Nicorandil组(P<0.01)；UW液+Nicorandil组与UW液组差别无显著意义，见表5。
表5 ATP含量表(n=8)
组别
ATP(ug/g)
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U
30.3150±3.2896
H
34.9025±2.2772
U+N
31.8263±2.8276
H+N
39.3450±1.7927
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
4.心肌内CP含量： HTK液组明显高于UW液组(P<0.01)；HTK液+Nicorandil组明显高于HTK组液(P<0.01)；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组(P<0.01)；UW液+Nicorandil组与UW液组差别无显著意义(P>0.05)，见表6。
, 百拇医药
表6 CP含量表(n=8)
组别
CP(ug/g)
U
89.3075±4.8075
H
99.4600±6.5306
U+N
90.4413±3.0286
H+N
117.025±8.5600
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
, 百拇医药
5.冠脉流出液中心肌酶漏出量：
从总体上看，HTK液组低于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组低于HTK液组(P<0.05)；UW液+Nicorandil组略低于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组与UW液+Nicorandil组差异无显著意义。见表7。
表7 心肌酶漏出量表(单位IU/L，n=8)
组别
GOTz
CKz
CK-MB
LDHz
LDH1
, 百拇医药
ALTc
U
36.38±11.51
74.00±16.17
61.63±20.72
6.750±1.281
63.37±11.00
4.750±1.908
H
12.75±4.432
42.75±3.808
7.025±4.832
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9.375±1.622
44.25±11.90
6.625±1.060
U+N
9.500±2.725
39.00±2.138
1.075±0.532
6.375±2.253
46.00±11382
4.250±0.669
H+N
, 百拇医药 9.025±2.250
38.25±10165
2.375±0.995
6.750±1.480
21.13±3.379
4.688±0.892
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
6.光镜结果：
正常心肌：心内膜未见增厚，心肌排列整齐，粗细均匀，可见小灶状节段性肌浆嗜酸性增强，未见炎性细胞浸润。HTK液组：血管周围及肌纤维间疏松水肿，片状肌浆溶解。UW液组：血管周围及肌纤维间疏松水肿，片状肌浆溶解，间质间少量炎性细胞浸润。HTK液+Nicorandil组：间质轻度水肿，少数区域心肌纤维可见肌浆溶解，横纹消失，病变区域小于HTK组。UW液+Nicorandil组：心肌间轻度疏松水肿，少数区域心肌纤维可见肌浆溶解，横纹消失。
, 百拇医药
7.电镜结果：
正常心肌：心肌结构清楚，心肌纤维排列整齐，肌节清。线粒体、肌质网等细胞器数量及形态未见著变，线粒体嵴排列整齐，未见明显肿胀，糖原未见增多，核及染色质未见著变；HTK液组：心肌结构存在，心肌纤维结构尚好，肌节结构清楚，仅个别区域肌原纤维有破坏。线粒体数量较多，肌质网未见扩张，未见糖原蓄积。核及染色质未见著变；UW液组：心肌结构存在，部分心肌纤维排列整齐，部分缩短，部分肌节破坏，少量肌原纤维结构消失或块状凝聚。线粒体数量较多，个别空泡变性，肌质网扩张，未见糖原蓄积。可见个别次级溶酶；HTK液+Nicorandil组：HTK液组：心肌结构清楚，心肌纤维排列整齐，肌节结构基本清楚，个别区域Z线结构稍有模糊。线粒体、肌质网等细胞器数量及形态未见著变，线粒体嵴排列整齐，未见明显肿胀，个别区域Z线结构稍有模糊。肌质网轻度空泡变性。未见糖原增多，核及染色质未见著变；UW液+Nicorandil组：心肌结构存在，心肌纤维排列有紊乱，肌节结构不清楚，以缩短为主。H带结构不清，部分肌纤维排列较散乱，线粒体等细胞器数量及形态未见著变，部分嵴排列紊乱，肌质网明显扩张，未见糖原增多。
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讨 论
本实验观察了Nicorandi在加入UW液和HTK液后，对心肌保存效果的影响。结果证明Nicorandi在加入UW液和HTK液后，其血流动力学指标、生化指标、形态学指标(尤其是心肌超微结构的改变)均优于HTK液和UW液组。现就Nicorandi对UW液和HTK液的心肌保存效果的影响进行分析。
1975年，德国人Bretsheneiderr〔2〕领导的小组研制成功了HTK液，并发现其对心肌保存效果良好。1985年，HTK液开始用于心脏移植的心脏保存。HTK液是一种由低钠(钠离子浓度为15mmol/L)，稍高钾(钾离子浓度为10mmol/L)和组氨酸为缓冲剂(组氨酸浓度为180mmol/L)组成的等渗性液体。HTK液最主要特点是加入了组织相容性的，在一个广泛温度范围内具有强大缓冲能力的组氨酸缓冲系统，可以有效的防止细胞水肿。HTK液具有良好的心肌保护功能主要归功于其组氨酸缓冲系统。心肌细胞缺血缺氧时，心肌内的储能物质，特别是CP和ATP分解增加，使心肌细胞内的CP和ATP含量急剧下降，解除了对糖酵解的抑制解除。同时由于ATP减少，ADP、AMP和无机磷酸盐增加，使磷酸果糖激酶活性增加，加速了糖酵解的产能过程。在严重缺血时，细胞内的乳酸堆积，形成严重的酸中毒反而抑制糖酵解的过程。糖酵解产生的ATP虽少(1克分子葡萄糖在无氧时酵解可净产生2克分子的ATP，而1克分子葡萄糖在有氧时酵解可净产生36克分子的ATP)，却是缺血心肌的最重要的能量来源，对维持细胞活性有着重要的意义。HTK液有效的抑制了酸中毒、减少氢离子的堆积，解除了糖酵解的抑制，使ATP有较大的生存率，使心肌细胞得到保护。2000年，Saitoh Y,Hashimoto M〔3〕等用离体鼠心工作模型，在4℃下保存离体鼠心8小时后复灌，结果表明HTK液对鼠心肌具有良好的保存效果，且优于UW液。
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1988年美国威斯康星大学的Belzer和他的研制小组研究成功UW液，极大地延长了移植器官对低温缺血的耐受时间。最初，UW液主要用于保存肾脏、肝脏、胰腺等腹腔器官，其对肾脏、肝脏、胰腺的保存时间限明显长于心脏，肾脏的保存时间可达72小时〔4〕，肝脏保存可达48小时〔5〕，但对心脏的保存一般不能超过4～6小时。实验证明，UW液对心肌有较好的保存效果，但比HTK液保存效果稍差。Oppell和Peiffer〔6〕等实验证明，UW液对冠状血管内皮细胞有损害，对心肌细胞的保护效果不如HTK液，并推测UW液的高钾(125mmol/L)特点可能是其对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成损害的直接原因，本实验的结果也支持上述观点，UW液过高的钾离子浓度对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成了一定程度的损害。另外，UW液中加入了羟乙基淀粉、乳糖醛酸和蜜三糖等新成分，使UW液粘滞性很高，也可能对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成损害。
Nicorandil是一种硝酸盐化合物和K-ATP通道开放剂(PCO)，可以用来治疗心绞痛、高血压、哮喘、泌尿系统功能不全和中枢神经系统疾病等，并具有保护心肌细胞的作用。K-ATP通道是钾离子通道的一种，已经在体内多种组织中发现，如胰腺、脑、心脏、血管和平滑肌等。K-ATP通道是一类受细胞内ATP生理浓度抑制的钾离子通道，ATP与细胞内膜结合，缩短K-ATP通道开放的时间，当细胞内的ATP浓度降低到一定程度，K-ATP通道开放。在缺氧、缺血、代谢障碍以及特殊钾离子通道开放剂(常用钾离子通道开放剂的包括nicorandil,pinacidil,aprikalim,cromakalim等)作用下，都可以使K-ATP通道开放〔7〕。一些研究认为PCO是通过降低K-ATP通道对细胞内ATP的敏感性而发挥作用的〔8〕。PCO激活K-ATP通道，引起心肌细胞的动作电位明显缩短，血管平滑肌超级化。K-ATP通道开放和动作电位缩短可减少钙离子内流，防止钙超载，继而抑制心肌和平滑肌细胞收缩，减少ATP消耗，ATP作用于K-ATP通道抑制动作电位进一步缩短。另外，nicorandil对冠状血管平滑肌有舒张作用。nicorandil对心肌细胞的保护作用具有浓度依赖性，随着nicorandil浓度的增加，其对心肌细胞的保护的效果越好，一般其浓度可达到1.0mmol/L，但高剂量的nicorandil也会产生毒性反应。K-ATP通道开放剂的作用可以被磺尿类药物(如glibemclamide)阻断。
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随着对K-ATP通道的研究不断深入，钾离子通道开放剂在心肌保护中的重要作用也逐渐为人们所认识，一些学者逐步将钾离子通馘剂引入心脏外科手术的心肌保护中。本实验结果证明HTK液和UW液加入nicorandil(1.0mmol/L)明显提高了HTK液和UW液对心肌的保护结果。心肌的ATP和CP含量、冠脉流出液心肌酶漏出量、血流动力学恢复率以及形态学等改变均有明显改善。HTK液和UW液加入nicorandil可明显缩短离体鼠心的停跳时间和复跳时间，可能是高钾去极化停搏机制和超级化机制的叠加效应。HTK液+nicorandil组对心肌的保护效果明显好于UW液+nicorandil组，其原因主要在于UW液过高的钾离子浓度和高粘滞性对心肌细胞及冠状血管内皮细胞有一定程度的损害。Cu K,Kin S等的实验表明只有在细胞外低钾(K+<24mmol/L)的情况下，nicorandil才能充分发挥K-ATP通道开放剂的作用。本实验得出得结论是nicorandil提高了HTK液和UW液对心肌的保护效果，且nicorandil对HTK液的作用优于UW液。
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参考文献
1.Thomas FT,Szentpetery SS.Long distance transportation of human hearts for transplantation.Ann Thorac Surg,1978,26:244-50.
2.Bretschneider HJ.Myocardial protection.Thorac Cardiovasc Surg,1980,28:295.
3.Yuhei MD,Micio PhD.Heart preservatation in HTK solution:role of coronary vasculature in recovery of cardia function.Ann Thorac Surg,2000,69:107-112.
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6.Oppell UO,Peiffer S.Endothelial cell toxicity of solid-organ preservation solution.Ann 1990,50:902.
7.Esande D,Cavero O.K channel openers and “natural” cardioprotection.Trends Pharmacol Sic,1992,13:269-272.
8.Thuringer D,Escande D.Apparent competition between ATP and potassium channel opener RP 49356 on ATP sensitive-K+ channel of cardil myocytes.Mol, http://www.100md.com
关键词：HTK液；UW液；尼克地尔；心肌保护
摘要：
目的 目的：在离体鼠心Langendorff灌注模型上，检验心肌保存液中加入Nicorandil对心肌保存液保存效果的影响。
方法：实验分为4组，UW液组、HTK液组、UW液组+Nicorandil组和HTK液+Nicorandil组，每组8只wistar雄性大白鼠。麻醉和抗凝后，快速取下鼠心并悬挂在Langendorff灌注模型上灌注，37℃下测定血流动力学基础值和冠脉流量。分别用四种保存液灌停离体鼠心并低温(4℃)保存4小时。重新复温复灌，再次测定血流动力学值和冠脉流量，留取标本分别测定心肌水含量、心肌酶漏出量、ATP和CP含量和心肌细胞超微结构变化。
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结果：心肌血流动力学恢复率中HTK液组高于UW液组；UW液+Nicorandil组高于UW液组；HTK液+Nicorandil组高于HTK液组；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组。心肌水含量4组间差异无显著意义。冠脉流量恢复率，在记录的前30分钟HTK液组优于UW液组；HTK液+Nicorandil组优于UW液+Nicorandil组，冠脉流出液心肌酶漏出量，HTK液组低于UW液组；HTK液+Nicorandil组低于HTK液组；UW液+Nicorandil组略低于UW液组。心肌中ATP和CP含量，HTK组高于UW组；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组。心肌细胞超微结构变化，HTK液+Nicorandil组心肌损害最轻，HTK组轻于UW液+Nicorandil组，UW液组心肌损害最严重。
结论：HTK液和UW液都是比较合适的心肌保存液，Nicorandil能够改善心肌保存液的保存效果。
, 百拇医药 1967年人类首例心脏移植成功以来，心脏移植作为治疗终末期心脏疾病的唯一有效手段，其生存率逐年提高，这首先取决于外科技术的不断发展和创新，同时也与供体心脏保存技术的提高、心肌保存液的不断改进有着密切的联系。临床上观察，心脏移植术后30天内死亡的病历数与供心保存不佳有着明显的相关性。目前，在深低温(0～4℃)的条件下，以UW液(Uinversity of Wisconsin solution)和HTK液(histidine-trytophane-ketoglutarate solution)对心肌的保存效果为佳。但当前临床心脏保存安全时限只能达到4～6小时〔1〕，移植后心脏功能都有不同程度的下降。如何进一步提高心肌保存液的保存效果和尽可能的延长心肌保存的时限是我们要解决的重要课题。尼克地尔(nicorandil)是一种ATP-K离子通道开放剂，具有选择性的开放ATP敏感钾离子通道的功能，在心肌保存淮中加入nicorandil有可能提高心肌保存液的保存效果。本实验的目的是在离体鼠心Lnagendorff灌注模型上，检验心肌保存液中加入nicorandil对心肌保存液保存效果的影响。
, 百拇医药
材料和方法
1.主要仪器和设备
ADInstruments生理记录仪和IBM电脑，记录和分析数据，数据处理采用Powerlab 3.4.6软件。德国Stockert Ⅱ型双头滚压泵，恒温循环器，热交换器，各种合适口径塑料管和硅胶管、接头、三通，用于组装Langendorff灌注模型。
2.药品和溶液配制：
(1)UW液，购自美国，用于使心脏停跳和保存心脏(成分见表1)。
(2)HTK液，购自美国，用于使心脏停跳和保存心脏(成分见表1)。
(3)Nicorandil购自日本，分别直接加入UW液和HTK液中，配成浓度为1.0mmol/L的溶液，充分震荡，置于4℃冰箱中静置24小时后用于实验。
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(4)K-H缓冲液自行配制，使用前用95%O2和5%CO2混合气预充20～30分钟。
表1 UW液、HTK液和K-H缓冲液成分(pH:7.4±0.5)
HTKmmol/L
UWmmol/L
K-Hmmol/L
NaCl
15
KH2PO4
25
NaCl
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118.5
KCl
9
KCl
5
NaHCO3
25.0
MgCl2
4
Adenosine
3
KH2PO4
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1.2
k-Ketogluaration
1
Glutathione
3
KCl
4.8
Histidine
180
MgSO4
5
MgSO4
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1.2
Histidine
18
Raffinose
30
CaCl2
1.8
Histidine
30
Allopurinol
0.01
Glucose
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11.0
k-Lactobionate
100
Pentastarch
5%
3.实验动物和分组：
选用Wistar雄性大白鼠32只，体重300至400克，由北京阜外医院实验动物科提供。根据实验目的，随机分为四组(UW液组、HTK液组、UW液+Nicorandil组、HTK液+Nicorandil组)，每组8只。
4.离体鼠心的切取、灌注和低温保存：
大白鼠称体重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg)麻醉，仰卧固定于操作台上，游离出股静脉，经股静脉内注射肝素3mg/kg。迅速开胸，于主动脉和右锁骨下动脉交界处切断主动脉。取出心脏，立即放入0～4℃ K-H缓冲液中，冲洗掉残留在主动脉内的血液。主动脉插管后，速移至Langendorff灌注装置上，用K-H液灌注，灌注压为75cm,H2O，K-H液经40μm孔径的过滤器过滤，以除去杂质。整个灌注期间用95%O2和5%CO2混合气平衡，灌注温度维持在37℃。肺动脉根部切开，使冠状动脉回流液引流充分。从开胸取心至灌注开始要在50～70秒内完成，尽量减少心肌缺血时间，超过70秒应放弃实验。灌注3分钟后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将带有测压导管的心室球囊送入左心室，测压导管(用生理盐水充满)的另一端连接多导生理记录仪。离体鼠心功能稳定后，往心室球囊内缓慢注射适量生理盐水(40～60μl)，使左心室舒张末压为10mmHg(1mmHg=0.133kPa)。平衡15分钟后，使心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值，包括左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左室压力微分(±dp/dt)和冠脉流量(CF)。
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降低温度至30℃以下，经主动脉灌注4℃的不同心肌停跳液(UW液、HTK液、UW液+Nicorandil、HTK液+Nicorandil)，根据冠脉流量调节灌注速度，灌注压为75cmH2O，灌注时间控制在180秒以内。心脏停跳后，把恒温循环器温度降至4℃，每只心脏在四种心肌保存液中分别低温保存4小时。为减小实验误差，心脏保存时不从Lnagendorff灌注模装置上取下。
4 小时后，复温至37℃，重新开始灌注。平衡15～20分钟以后，心脏作功达到稳定状态，每隔10分钟测定一次轿流动力学基础值(CF、LVEDP、LVESP、LVDP、+dp/dt、-dp/dt)，连续测定6次。观察并记录心脏停跳前后的心律、停跳时间和复跳时间。留取冠脉流出液，置于-20℃冰箱中保存，以测定心肌酶漏出量。心脏灌注完成后，于左心室上取一块心肌(重要大于200mg)，每次位置尽可能一致，置于液氮罐中保存，以备测定心肌ATP和CP含量。另取一块心肌组织，称湿重后放入100℃的烘箱中烘烤24小时，再次称干重，计算心肌含水量。心肌含水量=〔(湿重-干重)/温重〕×100%。每组中选取一个心脏，留取两块标本，光镜标本用10%甲醛溶液固定；电镜标本用3%戊二醛溶液固定后，置于4℃冰箱中保存，以备光镜和电镜检查。
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5.统计学处理：
四组资料用SPSS 10.0软件处理，组内用均数±标准差表示，两组间用独立t检验，多组间用f检验。
结 果
1.保存后心功能恢复情况
(1)血流动力学恢复率：
从总的趋势来看，HTK液组高于UW液组(P<0.05)；UW液+Nicorandil组高于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组高于HTK液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组恢复高于UW液+Nicorandil组(P<0.05)，见表2。
表2 四组血流动力学恢复率表(n=8)
组别
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LVESP
LVEDP
LVDP
+dp/dt
-dp/dt
U
44.91%±5.93%
53.25%±9.63%
40.75%±5.05%
41.51%±10.61%
43.57%±8.83%
H
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64.28%±12.25%
80.45%±7.69%
62.85%±13.90%
58.82%±7.48%
73.05%±7.51%
U+N
59.62%±8.84%
58.74%±10.58%
56.57%±9.68%
61.01%±12.66%
62.66%±14.72%
, 百拇医药
H+N
66.62%±10.45%
78.65%±8.76%
68.23%±6.00%
71.72%±10.26%
75.41%±11.09%
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
(2)冠脉流量恢复率： 在记录的前30分钟HTK液高于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组(P<0.05)；后35分钟两组差异无显著意义，见表3。
表3 冠脉流量恢复率表(n=8)
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组别
15分钟
25分钟
35分钟
45分钟
55分钟
65分钟
U
49.05%±19.94%
57.66%±22.22%
63.71%±19.01%
64.85%±19.75%
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66.30%±17.60%
66.08%±17.57%
H
83.2%±12.06%
81.68%±15.11%
79.70%±14.60%
79.94%±15.11%
78.01%±14.18%
79.08%±14.48%
U+N
57.88%±12.17%
, 百拇医药
62.11%±15.31%
65.39%±14.56%
67.28%±14.96%
63.66%±18.03%
65.38%±13.95%
H+N
83.69%±21.53%
82.65%±15.36%
81.74%±13.68%
79.78%±11.99%
71.03%±16.56%
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71.07%±15.46%
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
2.心肌内水含量： 四组见心肌含水量差异无显著意义，见表4。
表4 心肌含水量表(用百分数表示，n=8)
组别
心肌含水量
U
82.38%±21.18%
H
79.13%±22.85%
U+N
, 百拇医药
80.88%±21.35%
H+N
81.33%±22.09%
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
3.心肌内ATP含量： HTK液组明显高于UW液组(P< 0.01)；HTK液+Nicorandil组高于HTK液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组的高于UW液+Nicorandil组(P<0.01)；UW液+Nicorandil组与UW液组差别无显著意义，见表5。
表5 ATP含量表(n=8)
组别
ATP(ug/g)
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U
30.3150±3.2896
H
34.9025±2.2772
U+N
31.8263±2.8276
H+N
39.3450±1.7927
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
4.心肌内CP含量： HTK液组明显高于UW液组(P<0.01)；HTK液+Nicorandil组明显高于HTK组液(P<0.01)；HTK液+Nicorandil组高于UW液+Nicorandil组(P<0.01)；UW液+Nicorandil组与UW液组差别无显著意义(P>0.05)，见表6。
, 百拇医药
表6 CP含量表(n=8)
组别
CP(ug/g)
U
89.3075±4.8075
H
99.4600±6.5306
U+N
90.4413±3.0286
H+N
117.025±8.5600
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
, 百拇医药
5.冠脉流出液中心肌酶漏出量：
从总体上看，HTK液组低于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组低于HTK液组(P<0.05)；UW液+Nicorandil组略低于UW液组(P<0.05)；HTK液+Nicorandil组与UW液+Nicorandil组差异无显著意义。见表7。
表7 心肌酶漏出量表(单位IU/L，n=8)
组别
GOTz
CKz
CK-MB
LDHz
LDH1
, 百拇医药
ALTc
U
36.38±11.51
74.00±16.17
61.63±20.72
6.750±1.281
63.37±11.00
4.750±1.908
H
12.75±4.432
42.75±3.808
7.025±4.832
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9.375±1.622
44.25±11.90
6.625±1.060
U+N
9.500±2.725
39.00±2.138
1.075±0.532
6.375±2.253
46.00±11382
4.250±0.669
H+N
, 百拇医药 9.025±2.250
38.25±10165
2.375±0.995
6.750±1.480
21.13±3.379
4.688±0.892
注：U=UW液；H=HTK液；N=Nicorandil
6.光镜结果：
正常心肌：心内膜未见增厚，心肌排列整齐，粗细均匀，可见小灶状节段性肌浆嗜酸性增强，未见炎性细胞浸润。HTK液组：血管周围及肌纤维间疏松水肿，片状肌浆溶解。UW液组：血管周围及肌纤维间疏松水肿，片状肌浆溶解，间质间少量炎性细胞浸润。HTK液+Nicorandil组：间质轻度水肿，少数区域心肌纤维可见肌浆溶解，横纹消失，病变区域小于HTK组。UW液+Nicorandil组：心肌间轻度疏松水肿，少数区域心肌纤维可见肌浆溶解，横纹消失。
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7.电镜结果：
正常心肌：心肌结构清楚，心肌纤维排列整齐，肌节清。线粒体、肌质网等细胞器数量及形态未见著变，线粒体嵴排列整齐，未见明显肿胀，糖原未见增多，核及染色质未见著变；HTK液组：心肌结构存在，心肌纤维结构尚好，肌节结构清楚，仅个别区域肌原纤维有破坏。线粒体数量较多，肌质网未见扩张，未见糖原蓄积。核及染色质未见著变；UW液组：心肌结构存在，部分心肌纤维排列整齐，部分缩短，部分肌节破坏，少量肌原纤维结构消失或块状凝聚。线粒体数量较多，个别空泡变性，肌质网扩张，未见糖原蓄积。可见个别次级溶酶；HTK液+Nicorandil组：HTK液组：心肌结构清楚，心肌纤维排列整齐，肌节结构基本清楚，个别区域Z线结构稍有模糊。线粒体、肌质网等细胞器数量及形态未见著变，线粒体嵴排列整齐，未见明显肿胀，个别区域Z线结构稍有模糊。肌质网轻度空泡变性。未见糖原增多，核及染色质未见著变；UW液+Nicorandil组：心肌结构存在，心肌纤维排列有紊乱，肌节结构不清楚，以缩短为主。H带结构不清，部分肌纤维排列较散乱，线粒体等细胞器数量及形态未见著变，部分嵴排列紊乱，肌质网明显扩张，未见糖原增多。
, 百拇医药
讨 论
本实验观察了Nicorandi在加入UW液和HTK液后，对心肌保存效果的影响。结果证明Nicorandi在加入UW液和HTK液后，其血流动力学指标、生化指标、形态学指标(尤其是心肌超微结构的改变)均优于HTK液和UW液组。现就Nicorandi对UW液和HTK液的心肌保存效果的影响进行分析。
1975年，德国人Bretsheneiderr〔2〕领导的小组研制成功了HTK液，并发现其对心肌保存效果良好。1985年，HTK液开始用于心脏移植的心脏保存。HTK液是一种由低钠(钠离子浓度为15mmol/L)，稍高钾(钾离子浓度为10mmol/L)和组氨酸为缓冲剂(组氨酸浓度为180mmol/L)组成的等渗性液体。HTK液最主要特点是加入了组织相容性的，在一个广泛温度范围内具有强大缓冲能力的组氨酸缓冲系统，可以有效的防止细胞水肿。HTK液具有良好的心肌保护功能主要归功于其组氨酸缓冲系统。心肌细胞缺血缺氧时，心肌内的储能物质，特别是CP和ATP分解增加，使心肌细胞内的CP和ATP含量急剧下降，解除了对糖酵解的抑制解除。同时由于ATP减少，ADP、AMP和无机磷酸盐增加，使磷酸果糖激酶活性增加，加速了糖酵解的产能过程。在严重缺血时，细胞内的乳酸堆积，形成严重的酸中毒反而抑制糖酵解的过程。糖酵解产生的ATP虽少(1克分子葡萄糖在无氧时酵解可净产生2克分子的ATP，而1克分子葡萄糖在有氧时酵解可净产生36克分子的ATP)，却是缺血心肌的最重要的能量来源，对维持细胞活性有着重要的意义。HTK液有效的抑制了酸中毒、减少氢离子的堆积，解除了糖酵解的抑制，使ATP有较大的生存率，使心肌细胞得到保护。2000年，Saitoh Y,Hashimoto M〔3〕等用离体鼠心工作模型，在4℃下保存离体鼠心8小时后复灌，结果表明HTK液对鼠心肌具有良好的保存效果，且优于UW液。
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1988年美国威斯康星大学的Belzer和他的研制小组研究成功UW液，极大地延长了移植器官对低温缺血的耐受时间。最初，UW液主要用于保存肾脏、肝脏、胰腺等腹腔器官，其对肾脏、肝脏、胰腺的保存时间限明显长于心脏，肾脏的保存时间可达72小时〔4〕，肝脏保存可达48小时〔5〕，但对心脏的保存一般不能超过4～6小时。实验证明，UW液对心肌有较好的保存效果，但比HTK液保存效果稍差。Oppell和Peiffer〔6〕等实验证明，UW液对冠状血管内皮细胞有损害，对心肌细胞的保护效果不如HTK液，并推测UW液的高钾(125mmol/L)特点可能是其对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成损害的直接原因，本实验的结果也支持上述观点，UW液过高的钾离子浓度对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成了一定程度的损害。另外，UW液中加入了羟乙基淀粉、乳糖醛酸和蜜三糖等新成分，使UW液粘滞性很高，也可能对心肌细胞和冠状血管内皮细胞造成损害。
Nicorandil是一种硝酸盐化合物和K-ATP通道开放剂(PCO)，可以用来治疗心绞痛、高血压、哮喘、泌尿系统功能不全和中枢神经系统疾病等，并具有保护心肌细胞的作用。K-ATP通道是钾离子通道的一种，已经在体内多种组织中发现，如胰腺、脑、心脏、血管和平滑肌等。K-ATP通道是一类受细胞内ATP生理浓度抑制的钾离子通道，ATP与细胞内膜结合，缩短K-ATP通道开放的时间，当细胞内的ATP浓度降低到一定程度，K-ATP通道开放。在缺氧、缺血、代谢障碍以及特殊钾离子通道开放剂(常用钾离子通道开放剂的包括nicorandil,pinacidil,aprikalim,cromakalim等)作用下，都可以使K-ATP通道开放〔7〕。一些研究认为PCO是通过降低K-ATP通道对细胞内ATP的敏感性而发挥作用的〔8〕。PCO激活K-ATP通道，引起心肌细胞的动作电位明显缩短，血管平滑肌超级化。K-ATP通道开放和动作电位缩短可减少钙离子内流，防止钙超载，继而抑制心肌和平滑肌细胞收缩，减少ATP消耗，ATP作用于K-ATP通道抑制动作电位进一步缩短。另外，nicorandil对冠状血管平滑肌有舒张作用。nicorandil对心肌细胞的保护作用具有浓度依赖性，随着nicorandil浓度的增加，其对心肌细胞的保护的效果越好，一般其浓度可达到1.0mmol/L，但高剂量的nicorandil也会产生毒性反应。K-ATP通道开放剂的作用可以被磺尿类药物(如glibemclamide)阻断。
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随着对K-ATP通道的研究不断深入，钾离子通道开放剂在心肌保护中的重要作用也逐渐为人们所认识，一些学者逐步将钾离子通馘剂引入心脏外科手术的心肌保护中。本实验结果证明HTK液和UW液加入nicorandil(1.0mmol/L)明显提高了HTK液和UW液对心肌的保护结果。心肌的ATP和CP含量、冠脉流出液心肌酶漏出量、血流动力学恢复率以及形态学等改变均有明显改善。HTK液和UW液加入nicorandil可明显缩短离体鼠心的停跳时间和复跳时间，可能是高钾去极化停搏机制和超级化机制的叠加效应。HTK液+nicorandil组对心肌的保护效果明显好于UW液+nicorandil组，其原因主要在于UW液过高的钾离子浓度和高粘滞性对心肌细胞及冠状血管内皮细胞有一定程度的损害。Cu K,Kin S等的实验表明只有在细胞外低钾(K+<24mmol/L)的情况下，nicorandil才能充分发挥K-ATP通道开放剂的作用。本实验得出得结论是nicorandil提高了HTK液和UW液对心肌的保护效果，且nicorandil对HTK液的作用优于UW液。
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参考文献
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