法乐四联症儿童肥厚右心室细胞瞬间外向钾电流的研究
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体外循环杂志 2001年第3期第3卷
100730 北京同仁医院麻醉科；北京阜外心血管病医院 孙秀梅；胡小琴；张柄熙
关键词：人心肌细胞；细胞分离；瞬间外向钾电流；法乐四联症
摘要：
目的 目的：为观察压力增高导致的肥厚人心室组织的离子通道特性。
方法：酶解分离技术得到单个右室细胞，用膜片钳全细胞记录技术观察了4个月～5岁儿童肥厚心肌的Ito1特征。
结果：将钙电流阻断后，去极化至-20mV～+60mV之间均可记录到Ito1，激活后电流衰减速度不随去极化程度的增强而改变，在0、20、40、60mV时分别为122.59±6.28、131.69±210.64、122.39±5.99、122.47±6.18ms(n=16cells)，去极化至60mV时的 电流密度为2.72±2.80pA·pF-1(n=16cells)，半数最大激活电位为4.13±2.80mV，K为16.73±2.55mV(n=16cells)，半数最大失活电位出现在-41.40±3.71mV，K 为17.99±4.55mV(n=15cells)，失活后再激活的恢复时间常数为82.64±3.64mV(n=ce lls)。这种电流可被10mM4-AP基本抑制。
, 百拇医药
结论：肥厚人右室细胞存在lto1，通道动力学特征与成人心房肌细胞类似。
动物及人心室肌组织均存在瞬间外向钾电流—Ito1，种属不同及不 同病理条件下，Ito1发生明显变化，如高血压、心肌肥厚和心衰时通道特性及功能均 发生明显变化。以前的研究集中在成年病理心室肌〔1～4〕，但对未成年病理心室肌 的通道特性及功能状态报道甚少。未成年法乐四联症(TOF)心脏右室流出道组织显著肥厚， 病理学变化明显。临床上手术矫治后多发作心律失常，甚至心律失常性突然死亡。我们研究了TOF肥厚心室组织的通道特性。
实验材料与方法
1.病儿资料：提供右心室组织的8位TOF儿童病人资料。见表1。
表1 TOF儿童术前资料
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序号
性别 /年龄
诊断
NYHA
心律
彩超
1
女/0.4岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
2
, http://www.100md.com 女/2岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
3
男/3岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
4
男/2岁
TOF
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Ⅱ
窦性
右室肥厚
5
男/5岁
TOF
Ⅲ
窦性
右室肥厚
6
男/3岁
TOF
Ⅰ
窦性
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右室肥厚
7
男/3岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
8
男/3.8岁
TOF
Ⅰ
窦性
右室肥厚
, 百拇医药 2.心肌细胞分离：所有病人的麻醉与体外循环方法及所用药物基本相同。体外循环插管后 、灌注停跳液前取得右心室流出道处组织。
心肌细胞分离方法：参考Crumb〔5〕。将组织块用含氧无钙液(mmol/L，100 NaCl，10KCI，5MgSO4，20 Taurine,20 Glucose,5 Mops)反复冲洗后放入37℃酶液(Collg agenase Ⅰ 1mg/ml，ProteaseⅩⅩⅣ0.5mg/ml)(Sigma Chemic al Co.,St.louis,MO,USA)中温浮约50分钟，将剩余组织块用酶液(只用Collagenase Ⅰ 1mg/ml继续温浮约30分钟，在显微镜下观察细胞状况，当细胞密度满意后，停止温浮。将含有细胞的温浮液滤入含BSA的保存液中(〔Ca2+〕0.6mmol/L。
3.膜片钳全细胞记录技术
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用含钙台氏液灌流，内含CaCl2 0.25mmol/L阻断Ca.2+电流。选取纹理清楚、表面无疱疹的细胞进行记录，整个记录过程在室温(22～25℃)下进行。采用美国AXON-2 00B放大器进行膜片全细胞记录〔6〕。电极尖端直径2～3um，未抛光，充灌电极内液 (mmol/L，KCl 140，MgCl2 0.5，EGTA10，HEPES10，pH7.2 with KOH)后电极 电阻在2～5Ω之间。串联电阻补偿50%～60%，Pclamp70发放刺激脉冲，采集电流信号，测 定细胞电容，记录所得即时储存。
4.统计学处理
用Pclamp6.0测量电流，对图象进行初步数据化处理，用Origin50、Graph Pad进行统计学处理与作图，绘制曲线。所有结果以X±s表示。用One-way ANOVA及非配对t检验 进行统 计学处理。P<0.05为有显著性统计学差异。
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结 果
1.Ito1的电流-电压曲线 细胞钳制在-80mV，给予一去极化至40mV、持续30ms的短暂刺激以完全灭活Na+，再以10mV的步长将细胞逐步去极化至60mV，持续刺激400ms，可得到快速激活和快速失活的外向电流，此电流未完全失活至零，Ito1幅度为电流峰值与刺激末的持续电流之差。
所有细胞中，将细胞去极化至-20mV～+60mV时，均可记录到明显的Ito1电流。去极化至不同电压时的电流密度。去极化至+60mV时右室肌电流密度为4.72±0.64PA·PF -1(n=16个细胞)。
用单指数方程对电流曲线拟合，得到电流的失活常数，两组的具体常数值和统计结果见图3 。未成年TOF心脏右室肌细胞的电流失活速度无电压依赖性。
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2.Ito1的激活与失活 用持续400ms、步长为10mV的一系列方波，将细胞从-40mV去极化至+60mV，得到不同膜电位时的Ito1值。由公式g=I/(E-Ek)(g,K+通道电导值，I为不同膜电地的电流值，E 为膜电位，Ek代表K+的平衡电位，心肌细胞K+的平衡电位为-65mV)将所记录到的一系列电流值(I)转化为电导值(g)，以电导值(g)与膜电位(E)作图，得到Ito1的激活曲线 (activation curve of Ito1)，该曲线可被Boltzmann方程拟合：g/gmax=1/1+ exp{-(Vm-V1-2)/S}Vm：膜电位，V1/2：半数最大激活电位，S：斜率因子。经拟合后得到TOF右室肌细胞的V1/2=4.13±2.8mV，S=16.73±2.55mV(n=16个细胞)。
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用双脉冲刺激法，观察Ito1的失活动力学特征。将细胞膜钳制在-80mV，以10mV的步长将细胞去极化至+20mV，刺激持续2s(预刺激)，然后将细胞去极化至-40mV，持续15ms 以灭活钠电流，再去极化至+60mV，持续400ms(测试刺激)，可得到Ito1在不同条件 刺激电压时的电流变化。条件刺激膜电位为-10mV时，Ito1电流已基本失活。用I/Imax(I为不同条件刺激电压时记录到的电流，Imax为最大电流)与条件刺激电压做图，得到Ito1电流的失活曲线，成反“S”型，曲线可被Boltzmann方程较好拟合：I/Imax=1/{1+exp[(Vm-V1-2)/S]}，Vm：膜电位；V1/2：半数量大失活电位；S：斜率。 经拟合后得到F4右室肌细胞的半数最大失活电位为-41.40±3.71mV，S为17.99±4.55mV(n=15个细胞)。
3.失活后再激活的恢复过程 用双脉冲刺激观察-80mV时Ito1失活后再激活的恢复过程。细胞钳制在-80mV，给两 个相同的刺激(Pulse 1和Pulse 2)去极化至+40mV，持续200ms，P1～P2的间隔时间从Oms开始以20ms的步长增量逐渐延长至300ms，可记录到一系列不同时间间隔的Ito1值 。以P2峰电流与P1峰电流的比值对应P1～P2的时间间隔作图，得到Ito1的恢复曲线(Recovery Curve of Ito1)该曲线可被单指数方程拟合：
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Y=A+B·exp(-X/τ)
Y：表示P2电流与P1电流的比值；X：P1～P2时间间隔；
τ(tau)：为恢复时间常数(Time Course of Recovery from inactivation)。
经拟合后得到右室肌细胞τ为82.64±3.63ms(n=14个细胞)。
讨 论
结果表明，未成年肥厚心室肌细胞存在Ito1，基本通道动力学特征与动物 〔7〕及人心房肌〔8〕类似，如快速激活、快速失活、快速失活成分与持续性成分(Isus)、电压与时间依赖性及对工具药的敏感性等。因未发现人未成年心室肌Ito1的研究资料，只能将本结果与成年人左心室及动物心室肌资料比较。
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动物及人心房肌组织〔9，10〕均发现存在Ito2，尚未有人心室肌存在Ito2的报道。在灌流液中加入0.3mmol/LCdCl2，电极内液加入EGTA，表明记录所得为Ito1。
本实验的Ito1密度明显低于心房肌，与报道的左室内膜类似。人及动物的多项研究证实〔11～16〕，不同部位心室肌细胞(内外膜、中层)Ito1特性存在明显不同，心外膜的Ito1密度明显高于心内膜，心内膜存在明显的频率依赖性，心外膜则不明显，这是否与心室内外膜对外部环境的变化(如缺血缺氧、酸中毒、药物干预等)敏感性不同需进一步研究。本实验标本取自右心室内层，关于右室不同部位Ito1的特征尚未见资料报道 。
本实验的电流衰减速率室温下去极化至+40mV时为122ms，较所报道的人成年心室肌Ito1衰减速度略有延长，如Varro〔17〕报道室温下+50mV时37.6ms，Nabauer〔17〕发现室温下+40mV心室外膜为49ms、内膜45ms及中层55ms，Amos〔18〕报道室温下+40 mV时 为79ms。衰减速度慢可能与以下四方面因素有关：①与未发育成熟有关，因心房肌的衰减速 率存在明显的发育性加快；②与心肌肥厚有关； ③电流幅度小；④受实验对象及条件影响。与其它动物心肌及人心房肌类似， Ito1衰减速度不表现电压依赖性。这种失活特点符合“球-链(ball and chain)”模 型机制。
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Ito1失活后再激活的恢复速度是决定心肌Ito1频率依赖性的主要因素，我们发现未成年肥厚心室肌组织的恢复常数与成年左室肌(24-79ms)心外膜类似，这可能受发育与疾病两方面影响。Nabauer发现晚期心衰的中层心室细胞表现一定程度的频率依赖性，室温 下生理心率范围内Ito1幅值降低30%，肥厚人心室组织的Ito1频率依赖性尚未见报道。
本研究稳态激活与失活曲线表明，F4心室肌细胞的Ito1容易激活与失活，不如成年人心室肌稳定〔19〕，与成年人心室外膜类似〔20〕。
应指出的是，多种病理改变(如心肌肥厚、心衰、缺血、心肌梗塞等)可使mmol·L-1 密度降低〔21〕，而心律失常是这些疾病状态的最常见并发症之一。F4右室肌存在严重缺血与心肌肥厚，需进一步探讨其电生理特点与围术期心律失常的关系，改善术中 心肌保护与术后处理，预防术后并发症，提高手术远期效果。
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儿童肥厚右室肌细胞存在Ito1，电流密度与左室心内膜细胞电流类似，动力学特征表现易激活，易失活，最突出的特点是失活后再恢复常数与成年左室肌心外膜类似，因尚未发现有关人未成年肥厚右室肌细胞Ito1特征报道，须进一步研究以下三方面因素的影响 ，以探讨围术期处理方式及评估手术远期效果：①发育性变化；②心肌肥厚的影响；③心室 肌部位的影响。
参考文献
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关键词：人心肌细胞；细胞分离；瞬间外向钾电流；法乐四联症
摘要：
目的 目的：为观察压力增高导致的肥厚人心室组织的离子通道特性。
方法：酶解分离技术得到单个右室细胞，用膜片钳全细胞记录技术观察了4个月～5岁儿童肥厚心肌的Ito1特征。
结果：将钙电流阻断后，去极化至-20mV～+60mV之间均可记录到Ito1，激活后电流衰减速度不随去极化程度的增强而改变，在0、20、40、60mV时分别为122.59±6.28、131.69±210.64、122.39±5.99、122.47±6.18ms(n=16cells)，去极化至60mV时的 电流密度为2.72±2.80pA·pF-1(n=16cells)，半数最大激活电位为4.13±2.80mV，K为16.73±2.55mV(n=16cells)，半数最大失活电位出现在-41.40±3.71mV，K 为17.99±4.55mV(n=15cells)，失活后再激活的恢复时间常数为82.64±3.64mV(n=ce lls)。这种电流可被10mM4-AP基本抑制。
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结论：肥厚人右室细胞存在lto1，通道动力学特征与成人心房肌细胞类似。
动物及人心室肌组织均存在瞬间外向钾电流—Ito1，种属不同及不 同病理条件下，Ito1发生明显变化，如高血压、心肌肥厚和心衰时通道特性及功能均 发生明显变化。以前的研究集中在成年病理心室肌〔1～4〕，但对未成年病理心室肌 的通道特性及功能状态报道甚少。未成年法乐四联症(TOF)心脏右室流出道组织显著肥厚， 病理学变化明显。临床上手术矫治后多发作心律失常，甚至心律失常性突然死亡。我们研究了TOF肥厚心室组织的通道特性。
实验材料与方法
1.病儿资料：提供右心室组织的8位TOF儿童病人资料。见表1。
表1 TOF儿童术前资料
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序号
性别 /年龄
诊断
NYHA
心律
彩超
1
女/0.4岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
2
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TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
3
男/3岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
4
男/2岁
TOF
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Ⅱ
窦性
右室肥厚
5
男/5岁
TOF
Ⅲ
窦性
右室肥厚
6
男/3岁
TOF
Ⅰ
窦性
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右室肥厚
7
男/3岁
TOF
Ⅱ
窦性
右室肥厚
8
男/3.8岁
TOF
Ⅰ
窦性
右室肥厚
, 百拇医药 2.心肌细胞分离：所有病人的麻醉与体外循环方法及所用药物基本相同。体外循环插管后 、灌注停跳液前取得右心室流出道处组织。
心肌细胞分离方法：参考Crumb〔5〕。将组织块用含氧无钙液(mmol/L，100 NaCl，10KCI，5MgSO4，20 Taurine,20 Glucose,5 Mops)反复冲洗后放入37℃酶液(Collg agenase Ⅰ 1mg/ml，ProteaseⅩⅩⅣ0.5mg/ml)(Sigma Chemic al Co.,St.louis,MO,USA)中温浮约50分钟，将剩余组织块用酶液(只用Collagenase Ⅰ 1mg/ml继续温浮约30分钟，在显微镜下观察细胞状况，当细胞密度满意后，停止温浮。将含有细胞的温浮液滤入含BSA的保存液中(〔Ca2+〕0.6mmol/L。
3.膜片钳全细胞记录技术
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用含钙台氏液灌流，内含CaCl2 0.25mmol/L阻断Ca.2+电流。选取纹理清楚、表面无疱疹的细胞进行记录，整个记录过程在室温(22～25℃)下进行。采用美国AXON-2 00B放大器进行膜片全细胞记录〔6〕。电极尖端直径2～3um，未抛光，充灌电极内液 (mmol/L，KCl 140，MgCl2 0.5，EGTA10，HEPES10，pH7.2 with KOH)后电极 电阻在2～5Ω之间。串联电阻补偿50%～60%，Pclamp70发放刺激脉冲，采集电流信号，测 定细胞电容，记录所得即时储存。
4.统计学处理
用Pclamp6.0测量电流，对图象进行初步数据化处理，用Origin50、Graph Pad进行统计学处理与作图，绘制曲线。所有结果以X±s表示。用One-way ANOVA及非配对t检验 进行统 计学处理。P<0.05为有显著性统计学差异。
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结 果
1.Ito1的电流-电压曲线 细胞钳制在-80mV，给予一去极化至40mV、持续30ms的短暂刺激以完全灭活Na+，再以10mV的步长将细胞逐步去极化至60mV，持续刺激400ms，可得到快速激活和快速失活的外向电流，此电流未完全失活至零，Ito1幅度为电流峰值与刺激末的持续电流之差。
所有细胞中，将细胞去极化至-20mV～+60mV时，均可记录到明显的Ito1电流。去极化至不同电压时的电流密度。去极化至+60mV时右室肌电流密度为4.72±0.64PA·PF -1(n=16个细胞)。
用单指数方程对电流曲线拟合，得到电流的失活常数，两组的具体常数值和统计结果见图3 。未成年TOF心脏右室肌细胞的电流失活速度无电压依赖性。
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2.Ito1的激活与失活 用持续400ms、步长为10mV的一系列方波，将细胞从-40mV去极化至+60mV，得到不同膜电位时的Ito1值。由公式g=I/(E-Ek)(g,K+通道电导值，I为不同膜电地的电流值，E 为膜电位，Ek代表K+的平衡电位，心肌细胞K+的平衡电位为-65mV)将所记录到的一系列电流值(I)转化为电导值(g)，以电导值(g)与膜电位(E)作图，得到Ito1的激活曲线 (activation curve of Ito1)，该曲线可被Boltzmann方程拟合：g/gmax=1/1+ exp{-(Vm-V1-2)/S}Vm：膜电位，V1/2：半数最大激活电位，S：斜率因子。经拟合后得到TOF右室肌细胞的V1/2=4.13±2.8mV，S=16.73±2.55mV(n=16个细胞)。
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用双脉冲刺激法，观察Ito1的失活动力学特征。将细胞膜钳制在-80mV，以10mV的步长将细胞去极化至+20mV，刺激持续2s(预刺激)，然后将细胞去极化至-40mV，持续15ms 以灭活钠电流，再去极化至+60mV，持续400ms(测试刺激)，可得到Ito1在不同条件 刺激电压时的电流变化。条件刺激膜电位为-10mV时，Ito1电流已基本失活。用I/Imax(I为不同条件刺激电压时记录到的电流，Imax为最大电流)与条件刺激电压做图，得到Ito1电流的失活曲线，成反“S”型，曲线可被Boltzmann方程较好拟合：I/Imax=1/{1+exp[(Vm-V1-2)/S]}，Vm：膜电位；V1/2：半数量大失活电位；S：斜率。 经拟合后得到F4右室肌细胞的半数最大失活电位为-41.40±3.71mV，S为17.99±4.55mV(n=15个细胞)。
3.失活后再激活的恢复过程 用双脉冲刺激观察-80mV时Ito1失活后再激活的恢复过程。细胞钳制在-80mV，给两 个相同的刺激(Pulse 1和Pulse 2)去极化至+40mV，持续200ms，P1～P2的间隔时间从Oms开始以20ms的步长增量逐渐延长至300ms，可记录到一系列不同时间间隔的Ito1值 。以P2峰电流与P1峰电流的比值对应P1～P2的时间间隔作图，得到Ito1的恢复曲线(Recovery Curve of Ito1)该曲线可被单指数方程拟合：
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Y=A+B·exp(-X/τ)
Y：表示P2电流与P1电流的比值；X：P1～P2时间间隔；
τ(tau)：为恢复时间常数(Time Course of Recovery from inactivation)。
经拟合后得到右室肌细胞τ为82.64±3.63ms(n=14个细胞)。
讨 论
结果表明，未成年肥厚心室肌细胞存在Ito1，基本通道动力学特征与动物 〔7〕及人心房肌〔8〕类似，如快速激活、快速失活、快速失活成分与持续性成分(Isus)、电压与时间依赖性及对工具药的敏感性等。因未发现人未成年心室肌Ito1的研究资料，只能将本结果与成年人左心室及动物心室肌资料比较。
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动物及人心房肌组织〔9，10〕均发现存在Ito2，尚未有人心室肌存在Ito2的报道。在灌流液中加入0.3mmol/LCdCl2，电极内液加入EGTA，表明记录所得为Ito1。
本实验的Ito1密度明显低于心房肌，与报道的左室内膜类似。人及动物的多项研究证实〔11～16〕，不同部位心室肌细胞(内外膜、中层)Ito1特性存在明显不同，心外膜的Ito1密度明显高于心内膜，心内膜存在明显的频率依赖性，心外膜则不明显，这是否与心室内外膜对外部环境的变化(如缺血缺氧、酸中毒、药物干预等)敏感性不同需进一步研究。本实验标本取自右心室内层，关于右室不同部位Ito1的特征尚未见资料报道 。
本实验的电流衰减速率室温下去极化至+40mV时为122ms，较所报道的人成年心室肌Ito1衰减速度略有延长，如Varro〔17〕报道室温下+50mV时37.6ms，Nabauer〔17〕发现室温下+40mV心室外膜为49ms、内膜45ms及中层55ms，Amos〔18〕报道室温下+40 mV时 为79ms。衰减速度慢可能与以下四方面因素有关：①与未发育成熟有关，因心房肌的衰减速 率存在明显的发育性加快；②与心肌肥厚有关； ③电流幅度小；④受实验对象及条件影响。与其它动物心肌及人心房肌类似， Ito1衰减速度不表现电压依赖性。这种失活特点符合“球-链(ball and chain)”模 型机制。
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Ito1失活后再激活的恢复速度是决定心肌Ito1频率依赖性的主要因素，我们发现未成年肥厚心室肌组织的恢复常数与成年左室肌(24-79ms)心外膜类似，这可能受发育与疾病两方面影响。Nabauer发现晚期心衰的中层心室细胞表现一定程度的频率依赖性，室温 下生理心率范围内Ito1幅值降低30%，肥厚人心室组织的Ito1频率依赖性尚未见报道。
本研究稳态激活与失活曲线表明，F4心室肌细胞的Ito1容易激活与失活，不如成年人心室肌稳定〔19〕，与成年人心室外膜类似〔20〕。
应指出的是，多种病理改变(如心肌肥厚、心衰、缺血、心肌梗塞等)可使mmol·L-1 密度降低〔21〕，而心律失常是这些疾病状态的最常见并发症之一。F4右室肌存在严重缺血与心肌肥厚，需进一步探讨其电生理特点与围术期心律失常的关系，改善术中 心肌保护与术后处理，预防术后并发症，提高手术远期效果。
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儿童肥厚右室肌细胞存在Ito1，电流密度与左室心内膜细胞电流类似，动力学特征表现易激活，易失活，最突出的特点是失活后再恢复常数与成年左室肌心外膜类似，因尚未发现有关人未成年肥厚右室肌细胞Ito1特征报道，须进一步研究以下三方面因素的影响 ，以探讨围术期处理方式及评估手术远期效果：①发育性变化；②心肌肥厚的影响；③心室 肌部位的影响。
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