活体脑片钙离子荧光强度的测定对脑缺血损伤的评价
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体外循环杂志 2001年第1期第3卷
100029 首都医科大学附属北京安贞医院体外循环科 管玉龙；董培青；杨璟
关键词：钙离子荧光强度；脑损伤
摘要：
目的 目的：通过应用激光共聚焦显微镜检测活体脑片Ca2+荧光强度，对脑损伤的机制进行探讨。
方法：16只小型幼猪分别经过单纯深低温停循环(DHCA)或上腔静脉逆行灌注(RCP)90分钟后复灌120分钟。制备活体脑片，检测脑片Ca2+荧光强度，并进行组织病理和电子显微镜检查。
结果：RCP组Ca2+荧光强度明显低于DHCA组。相关分析显示活体脑片Ca2+荧光强度与中重度嗜酸性变性有相关性(r＝0.861，P<0.05)。
, 百拇医药
结论：Ca2+超载参与了DHCA后神经细胞的损伤过程，RCP能明显减轻Ca2+超载，对脑组织起到保护作用。
在累及主动脉弓部的大血管手术中，深低温停循环经上腔静脉逆行灌注(RCP)已成为一种脑保护方法渐为学者所接受，Ueda、Takamoto、Dong、Lin等均有成功的临床报告。 但有关RCP的基础研究尚不够深入，其保护机制尚未得到较公认的解释。实验研究认为Ca2+超载是脑缺血再灌注损伤的最基本原因。但由于技术因素尚未得到直接的证据。本实验应用激光共聚焦显微镜(LCSM)检测深低温停循环(DHCA)及RCP后2小时活体脑片Ca2+荧光强度，对脑损伤的机制进行探讨。
资料与方法
研究对象 1998年10月～12月选取16只健康小型幼猪(北京农业大学培育)，体重18～20kg，随机分为两组：实验组(n＝8)RCP组；对照组(n＝8)DHCA组。
, 百拇医药
研究方法 对幼猪采取硫喷妥钠30～50mg/kg-1腹腔注射，气管切开插管，呼吸机辅助呼吸。 正中劈开胸骨建立CPB，转流降温至鼻咽温达18℃，肛温达20℃，停CPB。对照组行单纯DHCA ，实验组经上腔静脉行RCP。90分钟后恢复CPB并复温，120分钟后鼻咽温达37℃，肛温达35 ℃，停CPB。采用小脑幕上开颅术，取小脑半球组织300～500mg。摘除眼球，剥离视网膜组织。
活体脑片的制备及Ca2+荧光强度的测定 将小脑组织、视网膜放入pH为7.4的人工脑脊液中，在4℃环境中以95%O2-5%CO2混合气体充灌5分钟，将小脑组织进行冠状切片，厚度为400±10um，立即将脑片放入人工脑脊液中在室温下孵育30分钟后移至含有5umol/L Fluo -3/AM的人工脑脊液中，室温下避光负载45分钟，洗涤2～3次后移入不含Flou -3/AM的脑脊液中孵育30分钟。使用激光共聚焦显微镜(Leica TCS-NT，德国)观察脑片的Ca2+荧光强度，使用共聚焦图象分析仪(Leica Q550IW，德国)进行定量分析。
, 百拇医药
对小脑组织和视网膜进行组织病理和电子显微镜检查。
统计学处理 数据用ˉx±s表示，用SPSS10.0软件处理，采用t检验进行组间 对照分析，并对Ca2+荧光强度与组织病理进行相关分析。
结 果
1.活体脑片细胞内Ca2+荧光强度
实验组和对照组小脑组织及视网膜组织的Ca2+镜下荧光显像定量分析显示实验互助Ca2+荧光强度明显低于对照组(表1)。
表1 两组脑片Ca2+荧光强度
小脑
, http://www.100md.com 视网膜
实验组
9.16±3.98***
21.48±14.27*
对照组
31.97±20.59
44.07±21.01
注：*P<0.05***P <0.001
2.组织病理检查
脑组织病理改变程度不等，部分细胞可见缺血性改变。根据Greenfield's neuropathology 神经元缺血缺氧病变分型进行40倍镜下视野锥体细胞观察，并对病变锥体神经细胞进行定量 分析(病变细胞占细胞总数的百分比)，结果显示与实验组相比，对照组的神经元发生更加普 遍明显的中重度嗜酸性变性(P<0.001)(表2)。
, 百拇医药
表2 小脑病理定量分析(%)
空泡变形
轻度嗜酸性变性
中度嗜酸性变性
重度嗜酸性变性
实验组
10.50±20.15**
19.42±27.13
3.30±12.18
0±0#
对照组
, 百拇医药 2.42±7.57
20.60±25.08
30.63±26.05
31.82±18.35
注：表中实验组与对照组相比，**P<0.01 #P<0.001
3.电子显微镜检查
小脑组织超微结构显示，实验组末梢网基本正常，粗面内质网及线粒体轻度肿胀：对照组粗 面内质网明显肿胀；广泛脱颗粒，线粒体明显肿胀，中间变空，线粒体嵴变短或减少、消失 。
相关分析显示活体脑片Ca2+荧光强度与中重度嗜酸性变性有相关性(r＝0.86，P<0.05)。
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讨 论
大脑是一个非贮能器官，对缺血缺氧非常敏感。DHCA后可导致线粒体不能继续合成ATP，脑内ATP水平急速下降。Usui等〔1〕证实DHCA60分钟后脑组织ATP降至基础水平的20%。 此外兴奋性氨基酸的大量释放，可造成Ca2+超载。DHCA时由于兴奋性氨基酸谷氨酸释放增加，重摄取减少，细胞外的谷氨酸浓度增加。谷氨酸作用于细胞膜上的N-甲基-D-天门 冬氨酸(NMDA)受体，Ca2+内流增加，复灌后细胞内Ca2+含量增加，激活Na+-Ca2+交换系统，导致Ca2+内流增加。同时由于DHCA时ATP合成不足，细胞膜上的Ca2+泵不能将细胞内的Ca2+转运出细胞外，且细胞器对Ca2+摄取和储存能力降低，可使胞浆内Ca2+浓度不断增加，Ca2+超载。但由于技术因素的限制， 以往的实验研究多集中于离体细胞的研究，不能完全反映脑组织的实际状况。本组实验中首 次采用激光共聚焦显微镜检查，直接检测采用活体脑片Ca2+荧光强度，实验显示活体 脑片Ca2+荧光强度与脑组织损伤程度相关，因而证实Ca2+超载参与了DHCA后脑损伤过程。
, 百拇医药
RCP脑保护在主动脉瘤特别是在主动脉弓部动脉瘤外科治疗中的应用从90年代Ueda〔2〕 文章发表之后得到了较为广泛的重视及临床应用。但仍有些学者则对RCP是否能提供有效的脑灌注持怀疑态度，部分临床效果观察表明RCP能明显延长停循环的安全时间，有RCP达13 5分钟后神经系统无并发症的报道。
本组的前期实验〔3〕在动物的灌注血液中注入同位素99mTc-ECD，逆行灌注3分钟后脑γ显像显示核素在大脑、小脑及延髓，各处分布均匀。近期采用眼底血管荧光造影 (FFA)和彩色多普勒超声波检查对RCP期间的视网膜血管进行观测，发现在RCP期间，眼底血管存在明确的血液供应。由于眼底血管来源于脑内循环系统，因而直接证实RCP对脑组织的 血液灌注〔4〕。Pagano等〔5〕在3例手术患者的灌注血液中加入99mT c-HMPAO，使用便携式γ照相机拍照，时间活性曲线显示在所有病例的双侧大脑半球血液灌注均匀。
, 百拇医药
我们早期对临床病人观察〔3〕发现RCP期间灌注5、10、15、20、25分钟时，检测入脑血与出脑血其氧含量存在明显的差异。恢复循环后，RCP组血浆MDA含量在复温后显著低于 DHCA组。ESR波谱O/S比值无明显增高，自由基的相对含量增加不明显。血浆乳酸低于DHCA组 。在动物实验中RCP2h复灌后的颈静脉血乳酸含量与DHCA组相比有显著性差异。近期实验中R CP组Na+-K+ ATP酶活力在复灌后保持了较高的水平，说明RCP能很好地提供血液供应，使线粒体不断地合成ATP，维持细胞的功能。Saitou等〔6〕在实验中使用中性红作为pH 示踪染色发现RCP组脑皮层组织pH为7.15±0.18，而DHCA组为6.46±0.13。这些实验研 究均证明RCP维持了逆灌期间的有氧代谢，减轻了酸中毒。
在体外循环快速降温时脑内温度的不均匀是造成脑损伤的重要原因，因而停循环期间脑内温度有可能逐渐回升。Juvoven等〔7〕的实验RCP组动物在逆灌期间硬膜外温度明显低于DHCA组，Usui等〔8〕的实验中DHCA期间脑内温度逐渐升高(20.4℃～22.7℃±0.7℃)，而RCP则维持了恒定的温度。Shanma等〔8〕临床研究同样证实充分有效均匀的 脑内低温具有确切的脑保护效果。
, 百拇医药
采用RCP时，逆向血流不断冲洗动脉血管，明显减少了各种微栓的气栓进入动脉血管造成脑 栓塞的可能性，并且减少了钳夹动脉造成的动脉损伤。Yerlioglu等〔9〕在实验动物 的血液循环中加入直径250～750um的聚苯乙烯微粒后进行顺行或逆行脑灌注，再观察神经系 统的功能。结果发现顺灌组动物的神经功能低下，SVC压力低于40mmHg动物的神经功能良好 。脑组织病理检查发现RCP组动物脑血管床内沉积的微粒数明显低于顺灌组。
本组实验首次应用LCSM直接检测活体脑片Ca2+荧光强度，证实RCP组脑片Ca2+ 荧光强度明显低于DHCA组，同时病理及电子显微镜检查均显示DHCA组神经细胞存在较严重的损伤，证实RCP能明显减轻Ca2+超载，对神经细胞起到保护作用。
结 论
Ca2+超载参与了DHCA后神经细胞的损伤过程，RCP能明显减轻Ca2+超载，对脑组织起到保护作用。
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参考文献
1.Usui A,Oohara K,Liu T,et al.Comparative experimental study betwe en retrograde cerebral perfusion and circulatory arrest.J Thorac Cardiovasc Surg ,1994,107,1228～1236.
2.Ueda Y,Miki S,Kusuhara K,et al.Surgical treatment of aneurysm of disse ction involving the ascending aorta and aortic arch,utilizing circulatory arrest and retrograde cerebral perfusion.J Cardiovasc Surg(Torino),1990,31,553～558.
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3.董培青大血管手术的脑保护 见：胡小琴主编心血管麻醉及体外循环北京：人民卫生出版社，1997.489～498.
4.Dong PQ,Guan YL,Yang J,et al.Fundus microvascular flow monitoring dur ing retrograde cerebral perfusion:an experimental study.Ann Thorac Surg,2000(in press).
5.Pagano D,Boivin CM,Foroqui MH,et al.Retrograde perfusion through th e superior vena cava perfuses the brain in human beings.J Thorac Cardiovasc Surg ,1996,111:270～272.
6.Saitou H,Watanabe T,Zhang JW,et al.Regional tissue blood flow and p H in the brain during deep hypothermic retrograde brain perfusion.J Surg Res,199 7,72:135～140.
, 百拇医药
7.Juvonen T,Zhang N,Wolfe D,et al.Retrograde cerebral perfusion enhan ces cerebral protection during prolonged hypothermic circulatory arrest:a study in a chronic porcine model.Ann Thorac Surg,1998,66:38～50.
8.Sharma R,Choudhary SK,Mohan MR,et al.Neurological evaluation and in telligence testing in the child with operated congenital heart disease.Ann Thora c Surg,2000,70:575～581.
9.Yerlioglu ME,Wolfe D,Mezrow CK,et al.The effect of retrograde cereb ral perfusion after particulate embolization to the brain.J Thorac Cardiovasc Su rg,1995,110:1470～1485., 百拇医药
关键词：钙离子荧光强度；脑损伤
摘要：
目的 目的：通过应用激光共聚焦显微镜检测活体脑片Ca2+荧光强度，对脑损伤的机制进行探讨。
方法：16只小型幼猪分别经过单纯深低温停循环(DHCA)或上腔静脉逆行灌注(RCP)90分钟后复灌120分钟。制备活体脑片，检测脑片Ca2+荧光强度，并进行组织病理和电子显微镜检查。
结果：RCP组Ca2+荧光强度明显低于DHCA组。相关分析显示活体脑片Ca2+荧光强度与中重度嗜酸性变性有相关性(r＝0.861，P<0.05)。
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结论：Ca2+超载参与了DHCA后神经细胞的损伤过程，RCP能明显减轻Ca2+超载，对脑组织起到保护作用。
在累及主动脉弓部的大血管手术中，深低温停循环经上腔静脉逆行灌注(RCP)已成为一种脑保护方法渐为学者所接受，Ueda、Takamoto、Dong、Lin等均有成功的临床报告。 但有关RCP的基础研究尚不够深入，其保护机制尚未得到较公认的解释。实验研究认为Ca2+超载是脑缺血再灌注损伤的最基本原因。但由于技术因素尚未得到直接的证据。本实验应用激光共聚焦显微镜(LCSM)检测深低温停循环(DHCA)及RCP后2小时活体脑片Ca2+荧光强度，对脑损伤的机制进行探讨。
资料与方法
研究对象 1998年10月～12月选取16只健康小型幼猪(北京农业大学培育)，体重18～20kg，随机分为两组：实验组(n＝8)RCP组；对照组(n＝8)DHCA组。
, 百拇医药
研究方法 对幼猪采取硫喷妥钠30～50mg/kg-1腹腔注射，气管切开插管，呼吸机辅助呼吸。 正中劈开胸骨建立CPB，转流降温至鼻咽温达18℃，肛温达20℃，停CPB。对照组行单纯DHCA ，实验组经上腔静脉行RCP。90分钟后恢复CPB并复温，120分钟后鼻咽温达37℃，肛温达35 ℃，停CPB。采用小脑幕上开颅术，取小脑半球组织300～500mg。摘除眼球，剥离视网膜组织。
活体脑片的制备及Ca2+荧光强度的测定 将小脑组织、视网膜放入pH为7.4的人工脑脊液中，在4℃环境中以95%O2-5%CO2混合气体充灌5分钟，将小脑组织进行冠状切片，厚度为400±10um，立即将脑片放入人工脑脊液中在室温下孵育30分钟后移至含有5umol/L Fluo -3/AM的人工脑脊液中，室温下避光负载45分钟，洗涤2～3次后移入不含Flou -3/AM的脑脊液中孵育30分钟。使用激光共聚焦显微镜(Leica TCS-NT，德国)观察脑片的Ca2+荧光强度，使用共聚焦图象分析仪(Leica Q550IW，德国)进行定量分析。
, 百拇医药
对小脑组织和视网膜进行组织病理和电子显微镜检查。
统计学处理 数据用ˉx±s表示，用SPSS10.0软件处理，采用t检验进行组间 对照分析，并对Ca2+荧光强度与组织病理进行相关分析。
结 果
1.活体脑片细胞内Ca2+荧光强度
实验组和对照组小脑组织及视网膜组织的Ca2+镜下荧光显像定量分析显示实验互助Ca2+荧光强度明显低于对照组(表1)。
表1 两组脑片Ca2+荧光强度
小脑
, http://www.100md.com 视网膜
实验组
9.16±3.98***
21.48±14.27*
对照组
31.97±20.59
44.07±21.01
注：*P<0.05***P <0.001
2.组织病理检查
脑组织病理改变程度不等，部分细胞可见缺血性改变。根据Greenfield's neuropathology 神经元缺血缺氧病变分型进行40倍镜下视野锥体细胞观察，并对病变锥体神经细胞进行定量 分析(病变细胞占细胞总数的百分比)，结果显示与实验组相比，对照组的神经元发生更加普 遍明显的中重度嗜酸性变性(P<0.001)(表2)。
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表2 小脑病理定量分析(%)
空泡变形
轻度嗜酸性变性
中度嗜酸性变性
重度嗜酸性变性
实验组
10.50±20.15**
19.42±27.13
3.30±12.18
0±0#
对照组
, 百拇医药 2.42±7.57
20.60±25.08
30.63±26.05
31.82±18.35
注：表中实验组与对照组相比，**P<0.01 #P<0.001
3.电子显微镜检查
小脑组织超微结构显示，实验组末梢网基本正常，粗面内质网及线粒体轻度肿胀：对照组粗 面内质网明显肿胀；广泛脱颗粒，线粒体明显肿胀，中间变空，线粒体嵴变短或减少、消失 。
相关分析显示活体脑片Ca2+荧光强度与中重度嗜酸性变性有相关性(r＝0.86，P<0.05)。
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讨 论
大脑是一个非贮能器官，对缺血缺氧非常敏感。DHCA后可导致线粒体不能继续合成ATP，脑内ATP水平急速下降。Usui等〔1〕证实DHCA60分钟后脑组织ATP降至基础水平的20%。 此外兴奋性氨基酸的大量释放，可造成Ca2+超载。DHCA时由于兴奋性氨基酸谷氨酸释放增加，重摄取减少，细胞外的谷氨酸浓度增加。谷氨酸作用于细胞膜上的N-甲基-D-天门 冬氨酸(NMDA)受体，Ca2+内流增加，复灌后细胞内Ca2+含量增加，激活Na+-Ca2+交换系统，导致Ca2+内流增加。同时由于DHCA时ATP合成不足，细胞膜上的Ca2+泵不能将细胞内的Ca2+转运出细胞外，且细胞器对Ca2+摄取和储存能力降低，可使胞浆内Ca2+浓度不断增加，Ca2+超载。但由于技术因素的限制， 以往的实验研究多集中于离体细胞的研究，不能完全反映脑组织的实际状况。本组实验中首 次采用激光共聚焦显微镜检查，直接检测采用活体脑片Ca2+荧光强度，实验显示活体 脑片Ca2+荧光强度与脑组织损伤程度相关，因而证实Ca2+超载参与了DHCA后脑损伤过程。
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RCP脑保护在主动脉瘤特别是在主动脉弓部动脉瘤外科治疗中的应用从90年代Ueda〔2〕 文章发表之后得到了较为广泛的重视及临床应用。但仍有些学者则对RCP是否能提供有效的脑灌注持怀疑态度，部分临床效果观察表明RCP能明显延长停循环的安全时间，有RCP达13 5分钟后神经系统无并发症的报道。
本组的前期实验〔3〕在动物的灌注血液中注入同位素99mTc-ECD，逆行灌注3分钟后脑γ显像显示核素在大脑、小脑及延髓，各处分布均匀。近期采用眼底血管荧光造影 (FFA)和彩色多普勒超声波检查对RCP期间的视网膜血管进行观测，发现在RCP期间，眼底血管存在明确的血液供应。由于眼底血管来源于脑内循环系统，因而直接证实RCP对脑组织的 血液灌注〔4〕。Pagano等〔5〕在3例手术患者的灌注血液中加入99mT c-HMPAO，使用便携式γ照相机拍照，时间活性曲线显示在所有病例的双侧大脑半球血液灌注均匀。
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我们早期对临床病人观察〔3〕发现RCP期间灌注5、10、15、20、25分钟时，检测入脑血与出脑血其氧含量存在明显的差异。恢复循环后，RCP组血浆MDA含量在复温后显著低于 DHCA组。ESR波谱O/S比值无明显增高，自由基的相对含量增加不明显。血浆乳酸低于DHCA组 。在动物实验中RCP2h复灌后的颈静脉血乳酸含量与DHCA组相比有显著性差异。近期实验中R CP组Na+-K+ ATP酶活力在复灌后保持了较高的水平，说明RCP能很好地提供血液供应，使线粒体不断地合成ATP，维持细胞的功能。Saitou等〔6〕在实验中使用中性红作为pH 示踪染色发现RCP组脑皮层组织pH为7.15±0.18，而DHCA组为6.46±0.13。这些实验研 究均证明RCP维持了逆灌期间的有氧代谢，减轻了酸中毒。
在体外循环快速降温时脑内温度的不均匀是造成脑损伤的重要原因，因而停循环期间脑内温度有可能逐渐回升。Juvoven等〔7〕的实验RCP组动物在逆灌期间硬膜外温度明显低于DHCA组，Usui等〔8〕的实验中DHCA期间脑内温度逐渐升高(20.4℃～22.7℃±0.7℃)，而RCP则维持了恒定的温度。Shanma等〔8〕临床研究同样证实充分有效均匀的 脑内低温具有确切的脑保护效果。
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采用RCP时，逆向血流不断冲洗动脉血管，明显减少了各种微栓的气栓进入动脉血管造成脑 栓塞的可能性，并且减少了钳夹动脉造成的动脉损伤。Yerlioglu等〔9〕在实验动物 的血液循环中加入直径250～750um的聚苯乙烯微粒后进行顺行或逆行脑灌注，再观察神经系 统的功能。结果发现顺灌组动物的神经功能低下，SVC压力低于40mmHg动物的神经功能良好 。脑组织病理检查发现RCP组动物脑血管床内沉积的微粒数明显低于顺灌组。
本组实验首次应用LCSM直接检测活体脑片Ca2+荧光强度，证实RCP组脑片Ca2+ 荧光强度明显低于DHCA组，同时病理及电子显微镜检查均显示DHCA组神经细胞存在较严重的损伤，证实RCP能明显减轻Ca2+超载，对神经细胞起到保护作用。
结 论
Ca2+超载参与了DHCA后神经细胞的损伤过程，RCP能明显减轻Ca2+超载，对脑组织起到保护作用。
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参考文献
1.Usui A,Oohara K,Liu T,et al.Comparative experimental study betwe en retrograde cerebral perfusion and circulatory arrest.J Thorac Cardiovasc Surg ,1994,107,1228～1236.
2.Ueda Y,Miki S,Kusuhara K,et al.Surgical treatment of aneurysm of disse ction involving the ascending aorta and aortic arch,utilizing circulatory arrest and retrograde cerebral perfusion.J Cardiovasc Surg(Torino),1990,31,553～558.
, http://www.100md.com
3.董培青大血管手术的脑保护 见：胡小琴主编心血管麻醉及体外循环北京：人民卫生出版社，1997.489～498.
4.Dong PQ,Guan YL,Yang J,et al.Fundus microvascular flow monitoring dur ing retrograde cerebral perfusion:an experimental study.Ann Thorac Surg,2000(in press).
5.Pagano D,Boivin CM,Foroqui MH,et al.Retrograde perfusion through th e superior vena cava perfuses the brain in human beings.J Thorac Cardiovasc Surg ,1996,111:270～272.
6.Saitou H,Watanabe T,Zhang JW,et al.Regional tissue blood flow and p H in the brain during deep hypothermic retrograde brain perfusion.J Surg Res,199 7,72:135～140.
, 百拇医药
7.Juvonen T,Zhang N,Wolfe D,et al.Retrograde cerebral perfusion enhan ces cerebral protection during prolonged hypothermic circulatory arrest:a study in a chronic porcine model.Ann Thorac Surg,1998,66:38～50.
8.Sharma R,Choudhary SK,Mohan MR,et al.Neurological evaluation and in telligence testing in the child with operated congenital heart disease.Ann Thora c Surg,2000,70:575～581.
9.Yerlioglu ME,Wolfe D,Mezrow CK,et al.The effect of retrograde cereb ral perfusion after particulate embolization to the brain.J Thorac Cardiovasc Su rg,1995,110:1470～1485., 百拇医药