白细胞滤过器保护肺功能的实验研究
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体外循环杂志 2000年第4期第2卷
200433第二军医大学附属长海医院胸心外科 王军；徐志云；张宝仁
关键词：白细胞滤器；肺保护；体外循环
摘要：
目的目的：在猫体外循环(CPB)动物模型基础上应用白细胞滤过器(LDF)，探讨LDF在CPB中肺保护的效果。
方法：建立猫体外循环动物模型，实验组为应用LDF，对照组为未用LDF。测定肺内白细胞扣留率，肺组织干/湿比值；用电子自旋共振(ESR)法直接测定肺组织氧自由基含量，测定血浆丙二醛(MDA)含量，观察肺组织超微结构的变化。
结果：白细胞滤除率为0.93±0.05(与滤过前比较P<0.01)。肺内白细胞扣留率对照组明显高于实验组(P<0.01)。肺组织干/湿比值对照组为0.258±0.011，实验组为0.612±0.023，两者比较P<0.01。ESR检测结果：在不同时间点对照组氧自由基产量均明显高于实验组(P<0.01)；血浆MDA的变化对照组由阻断前的0.618±0.037nmol/mg增至1.374±0.079nmol/mg(P<0.01)，60min后增至2.258±0.099nmol/mg；实验组阻断前为0.556±0.073nmol/mg，60min后为0.613±0.028nmol/mg，实验组较对照组产量低(P<0.05)。体外循环后两组可见肺泡水肿，有时可见透明膜形成，并伴有不同程度的白细胞浸润，以对照组最明显。
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结论：应用LDF能明显减低肺损伤，起到了较好地肺保护效果。
体外循环(CPB)引起呼吸功能不全和白细胞的激活有密切关系，CPB时血液与大量人工物质接触，使血液中的补体激活，产生白细胞脱颗粒，使大量白细胞在肺内聚集、扣留〔1〕。这时氧分子并不生成水而是经还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的作用，释放大量的氧自由基，造成肺损伤。人们试图滤除激活的白细胞，从根本上解决激活白细胞的副作用，减轻或消除肺损伤。通过去除白细胞来保护心肺功能，近年有报道，但多见于离体心肺的再灌注损伤的研究〔2〕。白细胞滤过器(LDF)应用于体外循环心肺功能保护的实验研究，也仅仅把它作为心肺移植时离体单器官研究的干扰因素之一。本研究在猫CPB模型基础上应用LDF，通过直接测定氧自由基产量的变化，探讨LDF在CPB中肺保护的效果，为临床上应用LDF提供理论依据。
材料与方法
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材料 健康杂种猫12只，雌雄不拘，体重3～3.5kg(本院动物所提供)。血泵为HL-S型恒流泵，流量为0～450ml/min(上海沪西分析仪器厂生产)。根据Protor〔3〕小型动物实验，采用鼓泡式氧合器，呼吸机为江湾Ⅰ型人工呼吸机(第二军医大学教研处提供)。低温高速离心机为Biofuge22R(德国Hreaeus公司产品)。GX-21型电子自旋共振波谱仪(美国)。UV-754分光光度计(上海第三分析仪器厂)。四甲氧丙烷(TMP)(美国Sigma公司产品)。
猫CPB用LDF的制备：参照日本Terumo公司生产的白细胞分离器，过滤材料为多孔聚亚胺脂，外鞘材料采用聚碳酸酯，管道材料为PVC，根据猫血容量〔猫体内血容量(ml)＝70%×体重(kg)×1000〕及体外循环流量确定LDF的预充量及滤过速度。检测灌注压在150mmHg时(1mmHg=0.133kPa)LDF的入口压力、侧壁压力、出口压力；测定白细胞滤除率；血小板回收率；红细胞回收率；蛋白漏出率以检测LDF的性能。
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猫CPB模型的建立及标本采集：心肌保护液采用含血心肌保护液(机血与高钾Fremes'溶液比例为4∶1)〔4〕；预充液为复方乳酸钠60ml,右旋醣酐20ml，5%碳酸氢钠9ml，10%氯化钾1.2ml，25%甘露醇9ml，全血100～120ml。手术操作：麻醉后，行人工呼吸；左旁胸骨正中切口进胸，主动脉插管入左无名动脉，经左、右心耳插入心房引流管，建立CPB。CPB开始后，于主动脉根部持续顺行灌注含血心肌保护液，灌注流量5ml·Kg-1·min-1，灌注温度为26～28℃，实验组于含血心肌保护液通路加用LDF，对照组不用LDF。CPB总转流时间为180min，主动脉阻断时间为60min，辅助循环时间为120min，灌注流量为80～100ml·kg-1·min-1，灌注压为70～80mmHg，用碳酸氢钠及调整氧合器通气量维持酸碱平衡。标本采集：两组于主动脉阻断前、主动脉开放后5、15、30及60min取肺组织标本，液氮保存备用；实验组于LDF前、后取血，采用ST-2型血细胞分析仪测定全血细胞计数。 肺干重/湿重比值测定：计算公式为肺干重/湿重比值＝肺干重/肺湿重×100%。CPB结束后取右肺叶标本，吸去表面液体，用分析天平称肺湿重，然后置于电烤箱(80℃)中烘干，每24小时称1次重量，直至重量不变即得恒重(肺干重)，代入公式，结果用于判断肺水肿程度。
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肺组织氧自由基含量的测定：采用电子自旋共振(ESR)方法直接测定。ESR波谱特征为g1＝2.026，g2＝2.003，g3＝1.939，观察条件77K。计量方法为；根据ESR波谱两点(O峰和S峰)的高度比值(O/S)以及O峰高度与样本重量克数的比例(O/W)。
肺组织丙二醛(MDA)含量的测定：采用硫代巴比妥酸(TBA)法〔5〕。
肺组织超微结构的观察：采用电镜切片观察。
结 果
LDF的性能指标：滤过器的预充量为25.0±1.4ml，滤过速度为20.0±5.0ml/min，灌注压在150mmHg时，LDF的入口压为129±31mmHg，出口压力为108±44mmHg，侧壁压力为103±42mmHg；滤过后白细胞滤除率为0.93±0.05(P<0.01)，红细胞回收率为0.97±0.04(P>0.05)，血小板回收率为0.13±0.03(P<0.01)。蛋白漏出率为0.02±0.004(P<0.01)。LDF的性能完全符合实验条件所需。
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肺干重/肺湿重比值的变化：CPB后对照组肺组织干/湿比值为0.258±0.011，实验组为0.612±0.023， P<0.01。表明肺水肿的程度实验组明显低于对照组。
肺组织氧自由基含量的变化：CPB后主动脉阻断前两组均有氧自由基产生，主动脉开放后对照组氧自由基产量明显升高，15min达到高峰，以后有下降的趋势，但无统计学意义。实验组于主动脉开放后未见氧自由基产量升高，各时间点与对照组比较产量明显降低(表1)。
表1 两组肺组织氧自由基含量的变化
阻断前
开放5min
15min
30min
60min
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O/S
O/W
O/S
O/W
O/S
O/W
O/S
O/W
O/S
O/W
对照组
0.052±0.005
0.002±0.002
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0.189±0.009
0.091±0.010*
0.211±0.017*
0.096±0.012*
0.151±0.013*
0.094±0.008*
0.127±0.012*
0.090±0.004*
实验组
0.047±0.007
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0.023±0.004
0.059±0.007**
0.37±0.005**
0.64±0.005**
0.51±0.006**
0.050±0.007**
0.044±0.004**
0.042±0.006**
0.040±0.003**
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注： O/S为O峰高度与S峰高度之比；O/W为O峰高度与样本重量克数之比；
*P<0.01(组内比较) ** P<0.01(组间比较)
MDA含量的变化：CPB后主动脉阻断前MDA含量均有升高，两组无显著性差别。肺组织恢复正常血液灌注后对照组MDA的产量明显升高，到60min仍维持在较高的水平，而实验组于主动脉开放后未见明显升高，实验组较对照组产量低(表2)。
表2 两组心肌组织MDA含量的变化(nmol/mg pro)(x±s)
阻断前
开放5min
15min
30min
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60min
对照组
0.574±0.051
1.371±0.078*
1.674±0.077*
1.871±0.097*
2.089±0.108*
实验组
0.523±0.048
0.534±0.032**
0.551±0.041**
, http://www.100md.com 0.562±0.045**
0.587±0.056**
注：*P<0.01(组内比较 **P<0.01(组间比较)
肺组织超微结构的变化：体外循环后实验组可见肺泡水肿，并伴有轻度的白细胞浸润。对照组可见肺泡水肿，伴红、白细胞渗出，有时可见透明膜形成，并伴有肺间质的水肿。
讨 论
CPB时，由于转流中使用许多人工管道等，使血清和这些高分子材料接触，可直接激活补体，补体通过趋化、激活中性粒细胞，参与脂质过氧化反应；同时主动脉阻断期间由于肺循环的停止造成肺内无血流，当主动脉开放后出现肺的再灌注。CPB时肺损伤的主要病理改变是中性粒细胞粘附于肺微血管内皮细胞，然后移行于肺泡腔引起渗出性肺水肿〔6〕。本实验结果表明，体外循环期间开放主动脉后氧自由基和丙二醛水平明显增高，表明由于体外循环大量人工物质接触及主动脉的阻断、开放，产生了大量的氧自由基，加重了肺损伤。当通过LDF去除白细胞后，氧自由基和丙二醛的水平实验组较对照组明显降低，说明白细胞是参与组织缺氧椩俟嘧⑺鹕说闹匾蛩刂唬煌狈胃?湿比值测定结果表明，通过去除白细胞可以明显降低由于CPB后白细胞激活造成的肺水肿。体外循环期间，激活的白细胞表面电荷发生变化，变形能力下降，易嵌于毛细血管网中，同时释放多种酶类、补体、脂质过氧化物等物质，参与再灌注损伤；术中肺循环血流阻断，肺组织缺血缺氧，呼吸链中氧化酶受到抑制，产生大量超氧阴离子，血流恢复后，产生大量的氧自由基，肺组织出现再灌注损伤。有报道发现用含有白细胞的全血灌注，27%的毛细血管无血流通过，而用去白细胞的血液灌注，仅有1%的毛细血管阻塞〔7〕。通过滤除这些激活的白细胞，可从根本上减轻或消除激活白细胞的副作用，减轻肺损伤。CPB造成的急性肺损伤是CPB后的常见并发症，它可由许多因素引起，白细胞激活、氧自由基产生等作用是引起CPB后急性肺损伤的重要原因之一，单纯滤过白细胞对手术后早期肺功能有何影响还有待于进一步研究。 LDF通过直接和间接的吸附方式，使激活的白细胞粘附于滤网上。我们制作的LDF可滤除白细胞达90%以上，性能良好。但是白细胞一直处于动态状态，在白细胞不停地被LDF滤过的同时，骨髓中的白细胞及边缘池的白细胞不断地释放入血循环，所以需要有良好的LDF能够持续长时间地滤过白细胞，以达到有效的白细胞滤过，维持CPB时的白细胞低记数。本实验中应用LDF对血小板的滤除率也较高，这是需要进一步改良的地方。
, 百拇医药
白细胞的激活是机体防御的一部分。心脏手术体外循环时，机体大面积暴露，感染机会增加，大量的白细胞减少，对细菌的抵御力产生何种影响？术中白细胞减少程度以何种为最佳？去除的白细胞能否回输及如何回输？这一系列问题都有待进一步研究和探讨。
参考文献
1.Frank E,Schmidt JR,Malcolm J,et al.leukocyte depletion of blood cardioplegia attenuates reperfusion injury.Ann thorac surg 1996,62:1691-1697.
2.Kawamura A,Saitoh M,Yonekawa M,et al.New technique of leukocyte apheresis by the use of nonwoven polyester fiber filter for inflammatory bowel disease.Clin Hemorheol Microcirc,1999,21:113-23.
, 百拇医药
3.Protor DJ,Brazier J,Salerno T,et al.An oxygenator for CPB in the rat. J Surg Res,1977,22:124-127.
4.王军，朱家麟，张宝仁，等。不同温度含血心肌保护液的临床研究。第二军医大学学报,1997,103；66-69.
5.Ohkawall.Assay for lipid peroxide in animal tissues by thiobarbituric acid relation.And Biochem 1979;95:351.
6.Steurer G,Yang P,Rao V,et al.Acute myocardial infarction,reperfusion injury,and intravenous magnesium therapy:basic concepts and clinical implications.Am Heart J,1996,132:478-481.
7.Engler RL.Leukocytes and ischemia-induced myocardial injury.Am J Cardiac,1998,56:135-145., 百拇医药
关键词：白细胞滤器；肺保护；体外循环
摘要：
目的目的：在猫体外循环(CPB)动物模型基础上应用白细胞滤过器(LDF)，探讨LDF在CPB中肺保护的效果。
方法：建立猫体外循环动物模型，实验组为应用LDF，对照组为未用LDF。测定肺内白细胞扣留率，肺组织干/湿比值；用电子自旋共振(ESR)法直接测定肺组织氧自由基含量，测定血浆丙二醛(MDA)含量，观察肺组织超微结构的变化。
结果：白细胞滤除率为0.93±0.05(与滤过前比较P<0.01)。肺内白细胞扣留率对照组明显高于实验组(P<0.01)。肺组织干/湿比值对照组为0.258±0.011，实验组为0.612±0.023，两者比较P<0.01。ESR检测结果：在不同时间点对照组氧自由基产量均明显高于实验组(P<0.01)；血浆MDA的变化对照组由阻断前的0.618±0.037nmol/mg增至1.374±0.079nmol/mg(P<0.01)，60min后增至2.258±0.099nmol/mg；实验组阻断前为0.556±0.073nmol/mg，60min后为0.613±0.028nmol/mg，实验组较对照组产量低(P<0.05)。体外循环后两组可见肺泡水肿，有时可见透明膜形成，并伴有不同程度的白细胞浸润，以对照组最明显。
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结论：应用LDF能明显减低肺损伤，起到了较好地肺保护效果。
体外循环(CPB)引起呼吸功能不全和白细胞的激活有密切关系，CPB时血液与大量人工物质接触，使血液中的补体激活，产生白细胞脱颗粒，使大量白细胞在肺内聚集、扣留〔1〕。这时氧分子并不生成水而是经还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的作用，释放大量的氧自由基，造成肺损伤。人们试图滤除激活的白细胞，从根本上解决激活白细胞的副作用，减轻或消除肺损伤。通过去除白细胞来保护心肺功能，近年有报道，但多见于离体心肺的再灌注损伤的研究〔2〕。白细胞滤过器(LDF)应用于体外循环心肺功能保护的实验研究，也仅仅把它作为心肺移植时离体单器官研究的干扰因素之一。本研究在猫CPB模型基础上应用LDF，通过直接测定氧自由基产量的变化，探讨LDF在CPB中肺保护的效果，为临床上应用LDF提供理论依据。
材料与方法
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材料 健康杂种猫12只，雌雄不拘，体重3～3.5kg(本院动物所提供)。血泵为HL-S型恒流泵，流量为0～450ml/min(上海沪西分析仪器厂生产)。根据Protor〔3〕小型动物实验，采用鼓泡式氧合器，呼吸机为江湾Ⅰ型人工呼吸机(第二军医大学教研处提供)。低温高速离心机为Biofuge22R(德国Hreaeus公司产品)。GX-21型电子自旋共振波谱仪(美国)。UV-754分光光度计(上海第三分析仪器厂)。四甲氧丙烷(TMP)(美国Sigma公司产品)。
猫CPB用LDF的制备：参照日本Terumo公司生产的白细胞分离器，过滤材料为多孔聚亚胺脂，外鞘材料采用聚碳酸酯，管道材料为PVC，根据猫血容量〔猫体内血容量(ml)＝70%×体重(kg)×1000〕及体外循环流量确定LDF的预充量及滤过速度。检测灌注压在150mmHg时(1mmHg=0.133kPa)LDF的入口压力、侧壁压力、出口压力；测定白细胞滤除率；血小板回收率；红细胞回收率；蛋白漏出率以检测LDF的性能。
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猫CPB模型的建立及标本采集：心肌保护液采用含血心肌保护液(机血与高钾Fremes'溶液比例为4∶1)〔4〕；预充液为复方乳酸钠60ml,右旋醣酐20ml，5%碳酸氢钠9ml，10%氯化钾1.2ml，25%甘露醇9ml，全血100～120ml。手术操作：麻醉后，行人工呼吸；左旁胸骨正中切口进胸，主动脉插管入左无名动脉，经左、右心耳插入心房引流管，建立CPB。CPB开始后，于主动脉根部持续顺行灌注含血心肌保护液，灌注流量5ml·Kg-1·min-1，灌注温度为26～28℃，实验组于含血心肌保护液通路加用LDF，对照组不用LDF。CPB总转流时间为180min，主动脉阻断时间为60min，辅助循环时间为120min，灌注流量为80～100ml·kg-1·min-1，灌注压为70～80mmHg，用碳酸氢钠及调整氧合器通气量维持酸碱平衡。标本采集：两组于主动脉阻断前、主动脉开放后5、15、30及60min取肺组织标本，液氮保存备用；实验组于LDF前、后取血，采用ST-2型血细胞分析仪测定全血细胞计数。 肺干重/湿重比值测定：计算公式为肺干重/湿重比值＝肺干重/肺湿重×100%。CPB结束后取右肺叶标本，吸去表面液体，用分析天平称肺湿重，然后置于电烤箱(80℃)中烘干，每24小时称1次重量，直至重量不变即得恒重(肺干重)，代入公式，结果用于判断肺水肿程度。
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肺组织氧自由基含量的测定：采用电子自旋共振(ESR)方法直接测定。ESR波谱特征为g1＝2.026，g2＝2.003，g3＝1.939，观察条件77K。计量方法为；根据ESR波谱两点(O峰和S峰)的高度比值(O/S)以及O峰高度与样本重量克数的比例(O/W)。
肺组织丙二醛(MDA)含量的测定：采用硫代巴比妥酸(TBA)法〔5〕。
肺组织超微结构的观察：采用电镜切片观察。
结 果
LDF的性能指标：滤过器的预充量为25.0±1.4ml，滤过速度为20.0±5.0ml/min，灌注压在150mmHg时，LDF的入口压为129±31mmHg，出口压力为108±44mmHg，侧壁压力为103±42mmHg；滤过后白细胞滤除率为0.93±0.05(P<0.01)，红细胞回收率为0.97±0.04(P>0.05)，血小板回收率为0.13±0.03(P<0.01)。蛋白漏出率为0.02±0.004(P<0.01)。LDF的性能完全符合实验条件所需。
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肺干重/肺湿重比值的变化：CPB后对照组肺组织干/湿比值为0.258±0.011，实验组为0.612±0.023， P<0.01。表明肺水肿的程度实验组明显低于对照组。
肺组织氧自由基含量的变化：CPB后主动脉阻断前两组均有氧自由基产生，主动脉开放后对照组氧自由基产量明显升高，15min达到高峰，以后有下降的趋势，但无统计学意义。实验组于主动脉开放后未见氧自由基产量升高，各时间点与对照组比较产量明显降低(表1)。
表1 两组肺组织氧自由基含量的变化
阻断前
开放5min
15min
30min
60min
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O/S
O/W
O/S
O/W
O/S
O/W
O/S
O/W
O/S
O/W
对照组
0.052±0.005
0.002±0.002
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0.189±0.009
0.091±0.010*
0.211±0.017*
0.096±0.012*
0.151±0.013*
0.094±0.008*
0.127±0.012*
0.090±0.004*
实验组
0.047±0.007
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0.023±0.004
0.059±0.007**
0.37±0.005**
0.64±0.005**
0.51±0.006**
0.050±0.007**
0.044±0.004**
0.042±0.006**
0.040±0.003**
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注： O/S为O峰高度与S峰高度之比；O/W为O峰高度与样本重量克数之比；
*P<0.01(组内比较) ** P<0.01(组间比较)
MDA含量的变化：CPB后主动脉阻断前MDA含量均有升高，两组无显著性差别。肺组织恢复正常血液灌注后对照组MDA的产量明显升高，到60min仍维持在较高的水平，而实验组于主动脉开放后未见明显升高，实验组较对照组产量低(表2)。
表2 两组心肌组织MDA含量的变化(nmol/mg pro)(x±s)
阻断前
开放5min
15min
30min
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60min
对照组
0.574±0.051
1.371±0.078*
1.674±0.077*
1.871±0.097*
2.089±0.108*
实验组
0.523±0.048
0.534±0.032**
0.551±0.041**
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0.587±0.056**
注：*P<0.01(组内比较 **P<0.01(组间比较)
肺组织超微结构的变化：体外循环后实验组可见肺泡水肿，并伴有轻度的白细胞浸润。对照组可见肺泡水肿，伴红、白细胞渗出，有时可见透明膜形成，并伴有肺间质的水肿。
讨 论
CPB时，由于转流中使用许多人工管道等，使血清和这些高分子材料接触，可直接激活补体，补体通过趋化、激活中性粒细胞，参与脂质过氧化反应；同时主动脉阻断期间由于肺循环的停止造成肺内无血流，当主动脉开放后出现肺的再灌注。CPB时肺损伤的主要病理改变是中性粒细胞粘附于肺微血管内皮细胞，然后移行于肺泡腔引起渗出性肺水肿〔6〕。本实验结果表明，体外循环期间开放主动脉后氧自由基和丙二醛水平明显增高，表明由于体外循环大量人工物质接触及主动脉的阻断、开放，产生了大量的氧自由基，加重了肺损伤。当通过LDF去除白细胞后，氧自由基和丙二醛的水平实验组较对照组明显降低，说明白细胞是参与组织缺氧椩俟嘧⑺鹕说闹匾蛩刂唬煌狈胃?湿比值测定结果表明，通过去除白细胞可以明显降低由于CPB后白细胞激活造成的肺水肿。体外循环期间，激活的白细胞表面电荷发生变化，变形能力下降，易嵌于毛细血管网中，同时释放多种酶类、补体、脂质过氧化物等物质，参与再灌注损伤；术中肺循环血流阻断，肺组织缺血缺氧，呼吸链中氧化酶受到抑制，产生大量超氧阴离子，血流恢复后，产生大量的氧自由基，肺组织出现再灌注损伤。有报道发现用含有白细胞的全血灌注，27%的毛细血管无血流通过，而用去白细胞的血液灌注，仅有1%的毛细血管阻塞〔7〕。通过滤除这些激活的白细胞，可从根本上减轻或消除激活白细胞的副作用，减轻肺损伤。CPB造成的急性肺损伤是CPB后的常见并发症，它可由许多因素引起，白细胞激活、氧自由基产生等作用是引起CPB后急性肺损伤的重要原因之一，单纯滤过白细胞对手术后早期肺功能有何影响还有待于进一步研究。 LDF通过直接和间接的吸附方式，使激活的白细胞粘附于滤网上。我们制作的LDF可滤除白细胞达90%以上，性能良好。但是白细胞一直处于动态状态，在白细胞不停地被LDF滤过的同时，骨髓中的白细胞及边缘池的白细胞不断地释放入血循环，所以需要有良好的LDF能够持续长时间地滤过白细胞，以达到有效的白细胞滤过，维持CPB时的白细胞低记数。本实验中应用LDF对血小板的滤除率也较高，这是需要进一步改良的地方。
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白细胞的激活是机体防御的一部分。心脏手术体外循环时，机体大面积暴露，感染机会增加，大量的白细胞减少，对细菌的抵御力产生何种影响？术中白细胞减少程度以何种为最佳？去除的白细胞能否回输及如何回输？这一系列问题都有待进一步研究和探讨。
参考文献
1.Frank E,Schmidt JR,Malcolm J,et al.leukocyte depletion of blood cardioplegia attenuates reperfusion injury.Ann thorac surg 1996,62:1691-1697.
2.Kawamura A,Saitoh M,Yonekawa M,et al.New technique of leukocyte apheresis by the use of nonwoven polyester fiber filter for inflammatory bowel disease.Clin Hemorheol Microcirc,1999,21:113-23.
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3.Protor DJ,Brazier J,Salerno T,et al.An oxygenator for CPB in the rat. J Surg Res,1977,22:124-127.
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5.Ohkawall.Assay for lipid peroxide in animal tissues by thiobarbituric acid relation.And Biochem 1979;95:351.
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