无细胞真皮基质的制备及应用
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国外医学外科学分册 2002年第2期第29卷
第二军医大学附属长海医院烧伤科；上海200433 唐晨；谭蔚锋(综述)；夏照帆(审校)
关键词：无细胞真皮基质；创面修复；真皮替代物
摘要：无细胞真皮基质是指异全或异种皮经一系列处理后，保留原有纤维成分及基本组织结构的一种永久性真皮替代物。其制作方法有胰酶消化法，Dispase-TritonX-100法，高渗盐溶液-SDS法，平衡盐浸泡法等。与其他真皮基质相比，其具有来源广泛、低免疫原性、生物亲和性高、有利于黑色素细胞增生等特点。其即可用于创面修复，又可用作软组织的替代物。广泛应用于烧伤、整形、口腔、神经外科、眼科、耳鼻喉科等学科领域。
无细胞真皮基质(acelluar dermal matrix,ADM)是指异体或异种皮经一系列处理后，脱去细胞成分，保留原有胶原纤维成分及基本组织结构的一种永久性真皮替代物。目前，无细胞真皮基质的应用远远超出作为单纯真皮替代物的范畴，广泛应用于烧伤、整形、口腔、神经外科、眼科、耳鼻喉科等学科领域。现就无细胞真皮基质的制备、应用及发展前景作一综述。
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1、无细胞真皮基质的制备方法
无细胞真皮基质的制备是尽可能脱除具有抗原性的细胞成分(表皮细胞、毛囊、皮脂腺、肝腺上皮细胞及真皮中血管内皮细胞与成纤维细胞等)，而保留原人胶原结构。按所应用的试剂不同，分为胰酶消化法、Dispase-Triton X-100法、高渗法溶液-SDS法、平衡盐浸泡法等。上述这些方法在制备程序、费用及无细胞真皮基质的质量等方法各有优缺点。
1.1胰酶消化法 利用外源性蛋白酶作用，清除皮肤中的细胞成分。该法制备程序简单，价格低廉，但细胞脱除不彻底，常残留皮肤附件中的上皮细胞成分，移植后可导致排斥反应。
1.2平衡盐浸泡法 该法是指在37℃磷酸缓冲溶液(PBS)中，激活皮肤内源性蛋白酶，再辅以快速冷冻融化等其他理化方法，以达到去除细胞成分。其操作过程过于复杂，制备时间长，而且激活了皮肤内源性蛋白酶易于损伤了真皮中的胶原蛋白和基底膜。
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1.3Dispase-Triton X-100 Dispase对表皮与真皮连接处的半桥粒结构有特异性消化作用。因此，将断层的异体(种)皮浸泡于Dispase溶液中，可使表皮导较完整地脱落，然后，辅以Triton
X-100去除真皮中的细胞成分。使用该法制得的无细胞真皮基质中细胞脱除彻底，但对真皮中基底膜有一定的损伤作用。
1.4高渗盐-SDS法 先用高渗NacI溶液作用皮肤，再用去垢剂SDS等处理，达到无细胞化。使用这种方法，细胞脱除虽不如第二种方法彻底，但其对胶原蛋白和基底膜损伤小，所以目前临床上大多使用该法。
2、无细胞真皮基质的特点
无细胞真皮基质与人工真皮相比，其保留了原的正常胶原三维结构及基底膜，易于血管化；与自体真皮相比，其供区广泛；与异体真皮相比，其去除了表皮层和真皮层的细胞成分，抗原性低。
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2.1来源广泛 无细胞真皮基质取材范围广，可取自同种异体皮，或异种皮，前者(尸体皮)的无细胞真皮基质价格昂贵，且可能存在细菌、病毒浸染可能，而异种(猪)无细胞真皮来源广泛，经动物及临床试验，未见明显排斥反应，可望取代异体无细胞真皮。
2.2低免疫原性 无细胞真皮基质中不含具有强抗原性的细胞在恰好，胶原纤维抗原性弱，移植后未见明显炎症及排斥反应，且降解速度慢，可诱导自体成纤维细胞、血管内皮细胞浸入生长，重建真皮层。免疫学检查证实术后60天机体对异全真皮无免疫排斥反应。
2.3生物亲和性高 无细胞真皮基质来源于天然皮肤，在组织结构上与自体皮肤最接近，其组织相容性比高分子聚合物真皮支架好，血管化速度较快，植入后1周真皮浅层即可见新生微血管形成，2周时真皮与创面基底基本融合。Mizuno等认为无细胞真皮基质可支持成纤维细胞的浸润和促进血管化。
2.4有利于黑色素细胞增生 Medalie等将黑色素细胞分别种植于无细胞的人真皮和含有成纤维细胞的胶原凝胶中，将两种复合物移植至裸鼠上，结果使用无细胞真皮，移植物的重新着色更加广泛，3周后产生色素滤泡并扩散，8周后完全扩散。而含有成纤维细胞的胶原凝胶则在移植6周后才有黑色素细胞增生的迹象。Medalie等认为无细胞真皮基质对含有的黑色素细胞克隆生长有很高的价值。
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3、临床应用
3.1深度烧伤创面的修复 以往全层或深层烧伤后，创面常用自体大张刃厚皮片移植、网状皮片移植、邮票样皮片移植等方法处理，但这三种方法均有不同避免的缺点，Lattari等用无细胞真皮基质为支架复合以超薄自体皮片移植治疗远端肢体深度烧伤，创面愈合后外观及肢体功能均获得良好疗效。Tasi等对大面积烧伤后关节部位应用无细胞真皮移植的病人进行随访。在12例应用了无细胞真皮基质移植技术的临床病例中平均的植皮成功率达到91.5%，且所有病人在一年后的随访中基本恢复了关节运动功能(正常的95%)。Gustafson等将体外培养扩增的表皮细胞种植于无细胞真皮基质表面，于体外培养后形成复合皮移植，结果表明移植后2周，复合皮存活，并封闭创面，而此时，与之对照的未种植表皮细胞的无细胞真皮基质仅在创面的边缘部分有角质细胞覆盖，在3，4和6周后角质细胞从边缘向中心逐渐迁移，但在整个研究过程中始终未能完全封闭创面。虽然含表皮细胞导牟无细胞真皮基质复合皮目前尚未用于临床，但其可望为自体皮源缺乏的大面积烧伤患者的救治开辟新的途径。
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3.2硬脊膜的替代物 Chaplin等进行了一项实验性研究，他们将来源于猪皮的无细胞真皮缝合至猪颞部的硬脊膜损伤处，结果表明无细胞的真皮胶原基质可作为硬脊膜的近乎理想的替代材料。Warren等对200例需要硬脊膜替代移植且无法施行或自体移植的病人进行无细胞的真皮基质移植。经过一年以上随访，其中仅7例患者要求后续手术，3位患者发现脑脊液漏，4位患者发生伤口感染。而任一患者移植物并未介入感染过程且周围均未出现粘连或疤痕形成，并得出无细胞的真皮胶原基质是硬脊膜移植的可行材料。
3.3眼部整形及创面修复 使用自体移植物和异体移植物治疗结膜穹降收缩缺陷、眶上沟缺陷、眶周的软组织缺陷效果一直不佳。Rubin等对29位此类患者使用了无细胞真皮移植作为缺陷屏障及软组织充填，进行了3～ 16个月的随访，他们认为无细胞基质是一种优良的屏障和重建移植物材料，其操作方便，避免了大量使用自身组织，且并发炎症的机会极小。SHorr等对63位在施行眼科整形和修复手术中应用无细胞真皮移植作为软组织填充物、缺陷屏障及眼眶移植的包扎材料的患者进行了回顾性的调查研究，结果证明这种材料可以安全地用来作为眼科整形、修复及包扎材料。临床上，这种材料生物相容性好，无毒，对眼眶、眼球及中面部组织无致敏性。
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3.4鼻中隔缺损修补 结缔组织自身移植物通常用于鼻中隔缺损修补术，通常使用颞肌筋膜和颅骨膜，这两者均伴有较高的供区损伤，且移植太薄与鼻中隔尺寸不符，以至于很难掌握。Kridel等在粘软骨膜瓣中插入无细胞人真皮修补鼻中隔，并对患者进行了3～14个月的随访，结果12名患者中的11名缺损获得了完全愈合，剩下的1名患者也取得了较好的疗效，其缺损直径从原先的3cm隆至5mm，症状也变得不明显了。Kridel等认为使用无细胞真皮基质移植成功率与使用颞肌筋膜和颅骨膜相仿，且具有不伴有供区损伤，易于放置、缝合，并能提供足够的材料的优点。
3.5口腔粘膜创面的修复 对于头部和颈闻的粘膜创面一直以来均采用厚皮片移植法来修复，Rhee等对29名口腔粘膜深度缺陷的病人，使用了无细胞真皮基质移植到这些口腔内部的创面缺损伤处。这些患者的平均移植面积为25cm，移植位置包括9例舌部、5例上颌骨口腔前庭、4例下颌骨、4例口腔底部、3例软硬腭、3例扁桃体、1例唇部。4周内，有90%的患者实现了完全上皮化。对病人进行了平均8.6个月的跟踪调查，有3名病人提到了痛或不舒适，一例病人发现有明显的临床表现的移植物挛缩。对口腔内创面的重造，自体真皮基膜不失为自体厚皮片移植汉的成功替代方法，是一种有效的治疗口腔粘膜缺陷的方法。Tal等报道使用无细胞直皮基质培育在牙龈根部以及牙根周围，表面用粘膜骨膜瓣覆盖。8个月后观察，牙根部覆盖已超过3.5mm(面积超过80%)，牙龈边缘与周围牙齿吻合良好，且角质化地区由原先的1mm增大至3mm。Tal认为无细胞真皮基质可作为自身结缔组织移植物代替品，并能作为可生物降解的屏障膜。Harris等报道在牙根愈合术中使用了无细胞真皮基质。并用Verhoeff染色证实了无细胞真皮基质与牙龈组织共同生长，这个病例报告从临床上和组织学上均证明了用结合-冠状位蒂的无细胞真皮基质可取得良好效果。
4、前景及展望
无细胞真皮基南的深度皮肤缺损创面的修复中主要作为真皮支架，还需要在表面复合超薄皮片移植。目前，含表皮细胞层的无细胞真皮基质复合皮尚未用于临床，主要原因是表皮细胞生长、增殖仍较慢，以及无细胞真皮基质无明显孔状结构，渗透性能差，移植后表皮细胞难以获得充分的营养供应。怎样更好地促进人角质细胞在无细胞真皮上生长、提高无细胞真皮基质的渗透性、促进血管化过程是目前正研究的热点。Lam等研究认为使用纤维素胶可促进角质细胞在真皮上的种植效应，而3T3滋养层细胞释放的因子可加强角质细胞的生长和分化，建议使用纤维素胶和3T3滋养层细胞这一模型作类无细胞真皮上培养角质细胞的最理想的系统。, 百拇医药
关键词：无细胞真皮基质；创面修复；真皮替代物
摘要：无细胞真皮基质是指异全或异种皮经一系列处理后，保留原有纤维成分及基本组织结构的一种永久性真皮替代物。其制作方法有胰酶消化法，Dispase-TritonX-100法，高渗盐溶液-SDS法，平衡盐浸泡法等。与其他真皮基质相比，其具有来源广泛、低免疫原性、生物亲和性高、有利于黑色素细胞增生等特点。其即可用于创面修复，又可用作软组织的替代物。广泛应用于烧伤、整形、口腔、神经外科、眼科、耳鼻喉科等学科领域。
无细胞真皮基质(acelluar dermal matrix,ADM)是指异体或异种皮经一系列处理后，脱去细胞成分，保留原有胶原纤维成分及基本组织结构的一种永久性真皮替代物。目前，无细胞真皮基质的应用远远超出作为单纯真皮替代物的范畴，广泛应用于烧伤、整形、口腔、神经外科、眼科、耳鼻喉科等学科领域。现就无细胞真皮基质的制备、应用及发展前景作一综述。
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1、无细胞真皮基质的制备方法
无细胞真皮基质的制备是尽可能脱除具有抗原性的细胞成分(表皮细胞、毛囊、皮脂腺、肝腺上皮细胞及真皮中血管内皮细胞与成纤维细胞等)，而保留原人胶原结构。按所应用的试剂不同，分为胰酶消化法、Dispase-Triton X-100法、高渗法溶液-SDS法、平衡盐浸泡法等。上述这些方法在制备程序、费用及无细胞真皮基质的质量等方法各有优缺点。
1.1胰酶消化法 利用外源性蛋白酶作用，清除皮肤中的细胞成分。该法制备程序简单，价格低廉，但细胞脱除不彻底，常残留皮肤附件中的上皮细胞成分，移植后可导致排斥反应。
1.2平衡盐浸泡法 该法是指在37℃磷酸缓冲溶液(PBS)中，激活皮肤内源性蛋白酶，再辅以快速冷冻融化等其他理化方法，以达到去除细胞成分。其操作过程过于复杂，制备时间长，而且激活了皮肤内源性蛋白酶易于损伤了真皮中的胶原蛋白和基底膜。
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1.3Dispase-Triton X-100 Dispase对表皮与真皮连接处的半桥粒结构有特异性消化作用。因此，将断层的异体(种)皮浸泡于Dispase溶液中，可使表皮导较完整地脱落，然后，辅以Triton
X-100去除真皮中的细胞成分。使用该法制得的无细胞真皮基质中细胞脱除彻底，但对真皮中基底膜有一定的损伤作用。
1.4高渗盐-SDS法 先用高渗NacI溶液作用皮肤，再用去垢剂SDS等处理，达到无细胞化。使用这种方法，细胞脱除虽不如第二种方法彻底，但其对胶原蛋白和基底膜损伤小，所以目前临床上大多使用该法。
2、无细胞真皮基质的特点
无细胞真皮基质与人工真皮相比，其保留了原的正常胶原三维结构及基底膜，易于血管化；与自体真皮相比，其供区广泛；与异体真皮相比，其去除了表皮层和真皮层的细胞成分，抗原性低。
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2.1来源广泛 无细胞真皮基质取材范围广，可取自同种异体皮，或异种皮，前者(尸体皮)的无细胞真皮基质价格昂贵，且可能存在细菌、病毒浸染可能，而异种(猪)无细胞真皮来源广泛，经动物及临床试验，未见明显排斥反应，可望取代异体无细胞真皮。
2.2低免疫原性 无细胞真皮基质中不含具有强抗原性的细胞在恰好，胶原纤维抗原性弱，移植后未见明显炎症及排斥反应，且降解速度慢，可诱导自体成纤维细胞、血管内皮细胞浸入生长，重建真皮层。免疫学检查证实术后60天机体对异全真皮无免疫排斥反应。
2.3生物亲和性高 无细胞真皮基质来源于天然皮肤，在组织结构上与自体皮肤最接近，其组织相容性比高分子聚合物真皮支架好，血管化速度较快，植入后1周真皮浅层即可见新生微血管形成，2周时真皮与创面基底基本融合。Mizuno等认为无细胞真皮基质可支持成纤维细胞的浸润和促进血管化。
2.4有利于黑色素细胞增生 Medalie等将黑色素细胞分别种植于无细胞的人真皮和含有成纤维细胞的胶原凝胶中，将两种复合物移植至裸鼠上，结果使用无细胞真皮，移植物的重新着色更加广泛，3周后产生色素滤泡并扩散，8周后完全扩散。而含有成纤维细胞的胶原凝胶则在移植6周后才有黑色素细胞增生的迹象。Medalie等认为无细胞真皮基质对含有的黑色素细胞克隆生长有很高的价值。
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3、临床应用
3.1深度烧伤创面的修复 以往全层或深层烧伤后，创面常用自体大张刃厚皮片移植、网状皮片移植、邮票样皮片移植等方法处理，但这三种方法均有不同避免的缺点，Lattari等用无细胞真皮基质为支架复合以超薄自体皮片移植治疗远端肢体深度烧伤，创面愈合后外观及肢体功能均获得良好疗效。Tasi等对大面积烧伤后关节部位应用无细胞真皮移植的病人进行随访。在12例应用了无细胞真皮基质移植技术的临床病例中平均的植皮成功率达到91.5%，且所有病人在一年后的随访中基本恢复了关节运动功能(正常的95%)。Gustafson等将体外培养扩增的表皮细胞种植于无细胞真皮基质表面，于体外培养后形成复合皮移植，结果表明移植后2周，复合皮存活，并封闭创面，而此时，与之对照的未种植表皮细胞的无细胞真皮基质仅在创面的边缘部分有角质细胞覆盖，在3，4和6周后角质细胞从边缘向中心逐渐迁移，但在整个研究过程中始终未能完全封闭创面。虽然含表皮细胞导牟无细胞真皮基质复合皮目前尚未用于临床，但其可望为自体皮源缺乏的大面积烧伤患者的救治开辟新的途径。
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3.2硬脊膜的替代物 Chaplin等进行了一项实验性研究，他们将来源于猪皮的无细胞真皮缝合至猪颞部的硬脊膜损伤处，结果表明无细胞的真皮胶原基质可作为硬脊膜的近乎理想的替代材料。Warren等对200例需要硬脊膜替代移植且无法施行或自体移植的病人进行无细胞的真皮基质移植。经过一年以上随访，其中仅7例患者要求后续手术，3位患者发现脑脊液漏，4位患者发生伤口感染。而任一患者移植物并未介入感染过程且周围均未出现粘连或疤痕形成，并得出无细胞的真皮胶原基质是硬脊膜移植的可行材料。
3.3眼部整形及创面修复 使用自体移植物和异体移植物治疗结膜穹降收缩缺陷、眶上沟缺陷、眶周的软组织缺陷效果一直不佳。Rubin等对29位此类患者使用了无细胞真皮移植作为缺陷屏障及软组织充填，进行了3～ 16个月的随访，他们认为无细胞基质是一种优良的屏障和重建移植物材料，其操作方便，避免了大量使用自身组织，且并发炎症的机会极小。SHorr等对63位在施行眼科整形和修复手术中应用无细胞真皮移植作为软组织填充物、缺陷屏障及眼眶移植的包扎材料的患者进行了回顾性的调查研究，结果证明这种材料可以安全地用来作为眼科整形、修复及包扎材料。临床上，这种材料生物相容性好，无毒，对眼眶、眼球及中面部组织无致敏性。
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3.4鼻中隔缺损修补 结缔组织自身移植物通常用于鼻中隔缺损修补术，通常使用颞肌筋膜和颅骨膜，这两者均伴有较高的供区损伤，且移植太薄与鼻中隔尺寸不符，以至于很难掌握。Kridel等在粘软骨膜瓣中插入无细胞人真皮修补鼻中隔，并对患者进行了3～14个月的随访，结果12名患者中的11名缺损获得了完全愈合，剩下的1名患者也取得了较好的疗效，其缺损直径从原先的3cm隆至5mm，症状也变得不明显了。Kridel等认为使用无细胞真皮基质移植成功率与使用颞肌筋膜和颅骨膜相仿，且具有不伴有供区损伤，易于放置、缝合，并能提供足够的材料的优点。
3.5口腔粘膜创面的修复 对于头部和颈闻的粘膜创面一直以来均采用厚皮片移植法来修复，Rhee等对29名口腔粘膜深度缺陷的病人，使用了无细胞真皮基质移植到这些口腔内部的创面缺损伤处。这些患者的平均移植面积为25cm，移植位置包括9例舌部、5例上颌骨口腔前庭、4例下颌骨、4例口腔底部、3例软硬腭、3例扁桃体、1例唇部。4周内，有90%的患者实现了完全上皮化。对病人进行了平均8.6个月的跟踪调查，有3名病人提到了痛或不舒适，一例病人发现有明显的临床表现的移植物挛缩。对口腔内创面的重造，自体真皮基膜不失为自体厚皮片移植汉的成功替代方法，是一种有效的治疗口腔粘膜缺陷的方法。Tal等报道使用无细胞直皮基质培育在牙龈根部以及牙根周围，表面用粘膜骨膜瓣覆盖。8个月后观察，牙根部覆盖已超过3.5mm(面积超过80%)，牙龈边缘与周围牙齿吻合良好，且角质化地区由原先的1mm增大至3mm。Tal认为无细胞真皮基质可作为自身结缔组织移植物代替品，并能作为可生物降解的屏障膜。Harris等报道在牙根愈合术中使用了无细胞真皮基质。并用Verhoeff染色证实了无细胞真皮基质与牙龈组织共同生长，这个病例报告从临床上和组织学上均证明了用结合-冠状位蒂的无细胞真皮基质可取得良好效果。
4、前景及展望
无细胞真皮基南的深度皮肤缺损创面的修复中主要作为真皮支架，还需要在表面复合超薄皮片移植。目前，含表皮细胞层的无细胞真皮基质复合皮尚未用于临床，主要原因是表皮细胞生长、增殖仍较慢，以及无细胞真皮基质无明显孔状结构，渗透性能差，移植后表皮细胞难以获得充分的营养供应。怎样更好地促进人角质细胞在无细胞真皮上生长、提高无细胞真皮基质的渗透性、促进血管化过程是目前正研究的热点。Lam等研究认为使用纤维素胶可促进角质细胞在真皮上的种植效应，而3T3滋养层细胞释放的因子可加强角质细胞的生长和分化，建议使用纤维素胶和3T3滋养层细胞这一模型作类无细胞真皮上培养角质细胞的最理想的系统。, 百拇医药