成纤维细胞生长因子对烫伤大鼠原癌基因和抑癌基因蛋白的影响
解放军第三○四医院创伤外科研究室；北京100037 程飚；付小兵；盛志勇；孙同柱；顾小曼；孙晓庆；李建福
关键词：烫伤；愈合；细胞增殖；细胞凋亡；成纤维细胞
摘要：目的：观察外用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中增殖细胞核抗原 (PCNA) 、p53、原癌基因c-myc和caspase-3的影响，初步认识增殖与凋亡 活动对创面愈合的作用。方法： 74只W istar 大鼠随机分为正常对照、单纯烫伤和bFGF治疗3组。利用大鼠30%总体表面积深Ⅱ度烫 伤模型，于伤后3、6小时及1、3、7和14日采取创面皮肤标本，采用免疫组织化学染色技术检测创伤 组织真皮内成纤维细胞PCNA、p53、c-myc和caspase-3蛋白的表达变化情况。结果： 烫伤大鼠 创面中成纤维细胞的增殖与凋亡活动与p53、c-myc蛋白表达有一定的关系；局 部外用bFGF对成纤维细胞的增殖等活动产生影响。结论： 成纤维细胞的增殖与凋亡变化是组织修复的重要步骤。
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创伤愈合过程中，肉芽组织生成是伤口愈合、组织重建的关键步骤。肉芽组织中含有丰富的细胞成分，其中成纤维细胞是最主要的修复细胞〔1〕。组织创伤后，成纤维细 胞反应性 增生，迅速增加的细胞数可以满足组织修复的需要。随着创面的愈合，完成了作用的 修复细胞应当迅速减少或消失。既往的研究发现，早期的成纤维细胞以细胞的增殖、分化活 动为主，后期则以细胞凋亡的形式实现〔2〕，彼此之间有机地联系在一起。原癌基因c-myc和肿瘤抑制基因 p53的表达在细胞的增殖与凋亡中均可发挥作用〔3-6〕。因此，我们希望通过研究c- myc和p53蛋白在创伤愈合过程中的表达变化规律，探讨生长因子对组织修复时细胞增殖与凋 亡的调控作用，深入认识创伤修复的相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组及模型制备：雄性Wistar 大鼠74只(军事医学科学院动 物中心提供)，体重250 ~300 g，实验前在本院动物室饲养1周，适应后投入实验。随机分为正常对照组(2只)、单纯损伤组(36只)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)治疗组(36只)。实验前禁食12小时，自由饮水 。单纯损伤组动物经质量分数为3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量0.15 ml/100 g， 刮 除背部30%总体表面积(TBSA)背毛，置于98 ℃水中8秒，造成30%TBSA深Ⅱ度烫伤(经组织 学鉴定和以往 的实验证实)，创面不进行特殊处理。将正常对照组大鼠背部皮肤置于37 ℃ 水中8秒，其余处理同单纯损伤组。bFGF治疗组在动物烫伤后局部外用bFGF(4 μg/d，隔日 使用1次，共3次，由北京白鹭原生物制药有限公司提供)，其余处理同单纯损伤组。伤后进 行休克期 复苏，按每100 g体重腹腔注射生理盐水4 ml补液，于伤后3、6小时及1、3、7、 14日各取6只大鼠的创面组织和1只正常对照组大鼠皮肤备用。
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1.2 标本处理：所有标本在无菌条件下采集后，立即切成1.0 cm×1. 0 cm组织块，置多聚甲 醛溶液中固定1小时后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱3次，脱水透明后，石蜡包埋组织，制成6 μm厚的石蜡切片，4 ℃保存备用。
1.3 抗体的准备与组织化学染色：增殖细胞核抗原(PCNA)、p53蛋白、c-myc蛋白和caspase蛋白抗体均购自美国 的Santa Cruz Biotech公司。石蜡切片脱蜡，体积分数为3%的过氧化氢孵育5~1 0分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡，进行抗原热修复。免疫组织化学试剂盒购于北京中山生物技 术有限公司，采用过氧化 物酶标记的链酶卵白素(SP)方法，按试剂盒说明书要求进行免疫组织化学显色。5%正常山羊血清封闭后，加入稀释的一抗(1∶100)，4 ℃过夜，PBS 漂洗，加入生物素标记的二抗，37 ℃孵育20分钟，PBS漂洗，滴加辣根过氧化物酶标 记 的SP，37 ℃孵育30分钟，PBS漂洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，再行苏木 精复染，脱水、透明、封片，光学显微镜观察结果。
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1.4 阳性判定标准：PCNA的阳性结果为细胞核染成棕色，其余抗体的阳 性结果则是细胞膜 被染成棕色的为阳性细胞。根据高倍镜下(×40)阳性细胞的染色进行半定量：0为无阳性 细胞；±为弱阳性表达；+为50% 的细胞着深棕色。用血清替代一抗作阴性对照，无阳性标记的细胞。
2 结果
2.1 单纯烫伤大鼠创面组织中PCNA、caspase-3、p53和c-myc蛋白的表达：正常皮肤的真皮组织中，仅有个别的成纤维细胞胞核PCNA染色阳性，呈棕黄色；至伤后 3日，创面切片内PCNA阳性的成纤维细胞表达增多，且相差显著，并于烫伤后7日表达最强(++++)。casp ase- 3蛋白在正常组织中的表达较少(+)，伤后3日，成纤维细胞caspase-3蛋白的 表达开始增加，至伤后7日达到高峰，随后有所下降。c-myc蛋白在正常的成纤 维细胞中有弱阳性 表达，3小时~1日开始增加，至第3日达高峰后逐渐下降。p53在正常组织中的表达呈阴性， 伤后6小时表达增强，伤后7日达到高峰后下降(见表1)。
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2.2 烫伤大鼠外用bFGF后创面组织中PCNA、caspase-3、p5 3和c-myc蛋白的表达：深Ⅱ度烫伤大鼠局部外用bFGF后，创伤初期(3~6小时)组织中PCNA的表达无显著变化 ，伤后1~14日，成纤维细胞PCNA阳性表达强于对照组。caspase-3蛋白的表达规 律与对照组 一致，但在伤后7日时阳性细胞的数量增加。p53在创伤初期的变化不明显，伤后1~14日的 表 达强于对照组。c-myc蛋白的变化较早，伤后3小时标记阳性的细胞数量即开始显著增加，但整体的变化规律与对照组相似。见表2。
3 讨论
组织损伤后创面成纤维细胞增生，表现为细胞器(如粗面内质网、高尔基体和微管网)增多 ，以满足DNA修复的需要。PCNA又被称为细胞周期蛋白，是与细胞周期相关的核蛋白，为真核细胞内DNA多聚酶δ的一种 辅助蛋白。它直接参与DNA合成，是DNA复制和修复所必需的成分，一般在静止期细胞中含量很低，自G1晚期开始升高，S期的含量达到高峰，G2期与M期明显下降。PCNA的表达与细胞的增殖状态密切相关，常常被用作评价细胞增殖状态的一种指标〔7〕。在细胞增殖满 足修复活动的同时，为维持机体的稳定性，增殖的细胞应及时被清除，凋亡便是目前 对修复细胞消失最令人信服的一种方式之一。由于细胞骨架是细胞重要的组成成分，因此细胞骨架的改变便成为研究凋亡的重要指征。无论是微丝、肌动蛋白、肌球蛋白、凝胶素、微 管和中间丝等，都可因caspase-3的蛋白酶切作 用而发生改变，同时它还能裂解DNA修复的相关分子〔8，9〕。因此，caspase-3已成为观察凋亡 最重要的指标之一。由于细胞增殖与凋亡的调控途径都可以由细胞因子引起，而c-myc、p53 又是调控途径中的重要底物，故观察它们在创伤修复过程中的变化规律将有助于认识创面愈 合的真正机制〔10，11〕。
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本实验显示，正常皮肤中PCNA的阳性信号主要表达于基底细胞、毛囊和汗腺等附属物的上皮细胞中。深Ⅱ度烫伤后表皮细胞坏死，表皮与真皮的浅层细胞也发生变性，失去了细胞分裂与增殖的能力，仅在真皮深层存在的成纤维细胞有所表达。伤后3日成纤维细胞PCNA的 表达增强，恢复了增殖活力；7日后细胞的增殖能力进一步增强，持续到伤后14日，创面部分已被新生上皮覆盖，真皮中成纤维细胞PCNA的表达开始有所降低。原癌基因c-myc在 伤后最先开 始增强表达，随后p53蛋白的表达升高。凋亡的活动规律与增殖反应基本一致，即伤后3日 开 始增加，7日达高峰后逐渐降低，由此可见创伤后原癌基因c-myc、p53的蛋白 变化引起烫伤 组织中细胞的增殖与凋亡，而两者间的相互制约行为与平衡调节是组织正常愈合的分子基础 。随着外源性生长因子(如bFGF)的介入，在创伤的初始阶段(伤后1~3日)，这种平衡被 打破 ，PCNA的表达变化早于caspase-3蛋白，直至伤后7日重新达到平衡状态。造成 这一现象的原 因可能是bFGF间接激活表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子，级联不同的信号传导途径，产生制约作用 的结果〔12，13〕。另外，根据本实验创伤愈合过程中外用bFGF引起c-m yc和p53蛋白的表达增 强，而c-myc蛋白的表达早于p53蛋白，结合其他学者的研究报告〔14-16〕，我们推测 ，bFGF经过其受体将刺激由胞外转入胞核内，诱导原癌基因c-myc 的表达，导 致p53的激活。激活的p53与PCNA基因启动子区的结合，以核转录因子的方式激活PCNA的转录 与表达，引起细胞的增殖活动。同时，c-myc自身可能存在负反馈机制，即激活 p53后，顺次激活p21蛋白，抑制细胞周期依赖蛋白激酶(CDK)活性，促进细胞的凋亡产生。通过对细胞增殖与凋亡的调节维持机体平衡。
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参考文献
〔1〕 Martin P.Wound healing-aiming for perfect skin regeneration〔J〕.Sci ence,1997,276(4):75-81.
〔2〕Greenhalgh D G.The role of apoptosis in wound healing〔J〕.Int J Biochem C ell Biol,1998,30(9):1019-1030.
〔3〕Dang C V,Resar L M S,Emison E,et al.Function of the c-myc oncogeneic transcription factor〔J〕.Exp Cell Res,1999,253(1):63-72 .
〔4〕Hoffman B,Liebermann D A.The proto-oncogene c-myc and apoptosis〔J〕.Oncogene,1998,17(25):3351-3357.
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〔5〕Antoniades H N,Galanopoulos T,Neville-Golden J,et al.p53 exp ression during normal tissue regeneration in response to acute cutaneous injury in swine〔J〕. J Clin Invest,1994,93(5):2206-2214.
〔6〕Henseleit U,Zhang J,Wanner R，et al.Role of p53 in UVB-induc ed ap optosis in human HaCaT keratinocytes〔J〕.J Invest Dermatol,1997,109(6):722-727.
〔7〕Stewart C A,Dell′Orcco R T.Age related decline in the expression of prolif e rating cell nuclear antigen in human diploid fibroblasts〔J〕.Mech Ageing Dev,1 992,66(1):71-80.
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〔8〕管增伟，王盛兰，李勇.半胱氨酸蛋白酶与细胞凋亡〔J〕.国外医学肿瘤分册，20 00，27(5)：280-282.
〔9〕夏国伟，崔玉芳，王德文.创伤愈合与细胞凋亡〔J〕.国外医学生理病理科学与临床分册，1999，19(3)：201-204.
〔10〕付小兵，程飚，盛志勇.有关创伤修复与组织再生的现代认识〔J〕 .中国危重病急救医学，2002，14(2)：67-68.
〔11〕陈伟，付小兵，孙同柱，等.胎儿和成人皮肤组织中bFGF、c-fos和c -myc基因转录与翻译的变化及其与创面无瘢愈合的关系〔J〕.中国危重病急救医学，2002，14(2)：9 6-99.
〔12〕Tanaka E,Ase K,Okuda T,et al.Mechanism of acceleration of wound healin g by basic fibroblast growth factor in genetically diabetic mice〔J〕.Biol Pharm Bull,1996,19(9):1141-1148.
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〔13〕Miyazono K,Ten Dijke P,Yamashita H,et al.Signal transduction via serin e/threonine kinase receptors〔J〕.Semin Cell Biol,1994,5(6):389-398 .
〔14〕顾小曼,付小兵.创面愈合过程中两种原癌基因与碱性成纤维细胞生长因子的调控关系 〔J〕.中华创伤杂志，2000，16(6)：340-344.
〔15〕Blagosklonny M V.A node between proliferation,apoptosis,and growth arrest 〔J〕.Bioessays,1999,21(8):704-709.
〔16〕李晋涛，刘昕，吴玉章.p53基因与DNA修复〔J〕.国外医学分子生物学分册，2001 ，23(3)：151-153.
作者简介：程飚(1967-)，男(汉族)，江苏省徐州市人，医学博士，主治医师 ，主要从事创伤修复信号转导机制的研究。, http://www.100md.com
关键词：烫伤；愈合；细胞增殖；细胞凋亡；成纤维细胞
摘要：目的：观察外用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中增殖细胞核抗原 (PCNA) 、p53、原癌基因c-myc和caspase-3的影响，初步认识增殖与凋亡 活动对创面愈合的作用。方法： 74只W istar 大鼠随机分为正常对照、单纯烫伤和bFGF治疗3组。利用大鼠30%总体表面积深Ⅱ度烫 伤模型，于伤后3、6小时及1、3、7和14日采取创面皮肤标本，采用免疫组织化学染色技术检测创伤 组织真皮内成纤维细胞PCNA、p53、c-myc和caspase-3蛋白的表达变化情况。结果： 烫伤大鼠 创面中成纤维细胞的增殖与凋亡活动与p53、c-myc蛋白表达有一定的关系；局 部外用bFGF对成纤维细胞的增殖等活动产生影响。结论： 成纤维细胞的增殖与凋亡变化是组织修复的重要步骤。
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创伤愈合过程中，肉芽组织生成是伤口愈合、组织重建的关键步骤。肉芽组织中含有丰富的细胞成分，其中成纤维细胞是最主要的修复细胞〔1〕。组织创伤后，成纤维细 胞反应性 增生，迅速增加的细胞数可以满足组织修复的需要。随着创面的愈合，完成了作用的 修复细胞应当迅速减少或消失。既往的研究发现，早期的成纤维细胞以细胞的增殖、分化活 动为主，后期则以细胞凋亡的形式实现〔2〕，彼此之间有机地联系在一起。原癌基因c-myc和肿瘤抑制基因 p53的表达在细胞的增殖与凋亡中均可发挥作用〔3-6〕。因此，我们希望通过研究c- myc和p53蛋白在创伤愈合过程中的表达变化规律，探讨生长因子对组织修复时细胞增殖与凋 亡的调控作用，深入认识创伤修复的相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组及模型制备：雄性Wistar 大鼠74只(军事医学科学院动 物中心提供)，体重250 ~300 g，实验前在本院动物室饲养1周，适应后投入实验。随机分为正常对照组(2只)、单纯损伤组(36只)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)治疗组(36只)。实验前禁食12小时，自由饮水 。单纯损伤组动物经质量分数为3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量0.15 ml/100 g， 刮 除背部30%总体表面积(TBSA)背毛，置于98 ℃水中8秒，造成30%TBSA深Ⅱ度烫伤(经组织 学鉴定和以往 的实验证实)，创面不进行特殊处理。将正常对照组大鼠背部皮肤置于37 ℃ 水中8秒，其余处理同单纯损伤组。bFGF治疗组在动物烫伤后局部外用bFGF(4 μg/d，隔日 使用1次，共3次，由北京白鹭原生物制药有限公司提供)，其余处理同单纯损伤组。伤后进 行休克期 复苏，按每100 g体重腹腔注射生理盐水4 ml补液，于伤后3、6小时及1、3、7、 14日各取6只大鼠的创面组织和1只正常对照组大鼠皮肤备用。
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1.2 标本处理：所有标本在无菌条件下采集后，立即切成1.0 cm×1. 0 cm组织块，置多聚甲 醛溶液中固定1小时后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱3次，脱水透明后，石蜡包埋组织，制成6 μm厚的石蜡切片，4 ℃保存备用。
1.3 抗体的准备与组织化学染色：增殖细胞核抗原(PCNA)、p53蛋白、c-myc蛋白和caspase蛋白抗体均购自美国 的Santa Cruz Biotech公司。石蜡切片脱蜡，体积分数为3%的过氧化氢孵育5~1 0分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡，进行抗原热修复。免疫组织化学试剂盒购于北京中山生物技 术有限公司，采用过氧化 物酶标记的链酶卵白素(SP)方法，按试剂盒说明书要求进行免疫组织化学显色。5%正常山羊血清封闭后，加入稀释的一抗(1∶100)，4 ℃过夜，PBS 漂洗，加入生物素标记的二抗，37 ℃孵育20分钟，PBS漂洗，滴加辣根过氧化物酶标 记 的SP，37 ℃孵育30分钟，PBS漂洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，再行苏木 精复染，脱水、透明、封片，光学显微镜观察结果。
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1.4 阳性判定标准：PCNA的阳性结果为细胞核染成棕色，其余抗体的阳 性结果则是细胞膜 被染成棕色的为阳性细胞。根据高倍镜下(×40)阳性细胞的染色进行半定量：0为无阳性 细胞；±为弱阳性表达；+为50% 的细胞着深棕色。用血清替代一抗作阴性对照，无阳性标记的细胞。
2 结果
2.1 单纯烫伤大鼠创面组织中PCNA、caspase-3、p53和c-myc蛋白的表达：正常皮肤的真皮组织中，仅有个别的成纤维细胞胞核PCNA染色阳性，呈棕黄色；至伤后 3日，创面切片内PCNA阳性的成纤维细胞表达增多，且相差显著，并于烫伤后7日表达最强(++++)。casp ase- 3蛋白在正常组织中的表达较少(+)，伤后3日，成纤维细胞caspase-3蛋白的 表达开始增加，至伤后7日达到高峰，随后有所下降。c-myc蛋白在正常的成纤 维细胞中有弱阳性 表达，3小时~1日开始增加，至第3日达高峰后逐渐下降。p53在正常组织中的表达呈阴性， 伤后6小时表达增强，伤后7日达到高峰后下降(见表1)。
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2.2 烫伤大鼠外用bFGF后创面组织中PCNA、caspase-3、p5 3和c-myc蛋白的表达：深Ⅱ度烫伤大鼠局部外用bFGF后，创伤初期(3~6小时)组织中PCNA的表达无显著变化 ，伤后1~14日，成纤维细胞PCNA阳性表达强于对照组。caspase-3蛋白的表达规 律与对照组 一致，但在伤后7日时阳性细胞的数量增加。p53在创伤初期的变化不明显，伤后1~14日的 表 达强于对照组。c-myc蛋白的变化较早，伤后3小时标记阳性的细胞数量即开始显著增加，但整体的变化规律与对照组相似。见表2。
3 讨论
组织损伤后创面成纤维细胞增生，表现为细胞器(如粗面内质网、高尔基体和微管网)增多 ，以满足DNA修复的需要。PCNA又被称为细胞周期蛋白，是与细胞周期相关的核蛋白，为真核细胞内DNA多聚酶δ的一种 辅助蛋白。它直接参与DNA合成，是DNA复制和修复所必需的成分，一般在静止期细胞中含量很低，自G1晚期开始升高，S期的含量达到高峰，G2期与M期明显下降。PCNA的表达与细胞的增殖状态密切相关，常常被用作评价细胞增殖状态的一种指标〔7〕。在细胞增殖满 足修复活动的同时，为维持机体的稳定性，增殖的细胞应及时被清除，凋亡便是目前 对修复细胞消失最令人信服的一种方式之一。由于细胞骨架是细胞重要的组成成分，因此细胞骨架的改变便成为研究凋亡的重要指征。无论是微丝、肌动蛋白、肌球蛋白、凝胶素、微 管和中间丝等，都可因caspase-3的蛋白酶切作 用而发生改变，同时它还能裂解DNA修复的相关分子〔8，9〕。因此，caspase-3已成为观察凋亡 最重要的指标之一。由于细胞增殖与凋亡的调控途径都可以由细胞因子引起，而c-myc、p53 又是调控途径中的重要底物，故观察它们在创伤修复过程中的变化规律将有助于认识创面愈 合的真正机制〔10，11〕。
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本实验显示，正常皮肤中PCNA的阳性信号主要表达于基底细胞、毛囊和汗腺等附属物的上皮细胞中。深Ⅱ度烫伤后表皮细胞坏死，表皮与真皮的浅层细胞也发生变性，失去了细胞分裂与增殖的能力，仅在真皮深层存在的成纤维细胞有所表达。伤后3日成纤维细胞PCNA的 表达增强，恢复了增殖活力；7日后细胞的增殖能力进一步增强，持续到伤后14日，创面部分已被新生上皮覆盖，真皮中成纤维细胞PCNA的表达开始有所降低。原癌基因c-myc在 伤后最先开 始增强表达，随后p53蛋白的表达升高。凋亡的活动规律与增殖反应基本一致，即伤后3日 开 始增加，7日达高峰后逐渐降低，由此可见创伤后原癌基因c-myc、p53的蛋白 变化引起烫伤 组织中细胞的增殖与凋亡，而两者间的相互制约行为与平衡调节是组织正常愈合的分子基础 。随着外源性生长因子(如bFGF)的介入，在创伤的初始阶段(伤后1~3日)，这种平衡被 打破 ，PCNA的表达变化早于caspase-3蛋白，直至伤后7日重新达到平衡状态。造成 这一现象的原 因可能是bFGF间接激活表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子，级联不同的信号传导途径，产生制约作用 的结果〔12，13〕。另外，根据本实验创伤愈合过程中外用bFGF引起c-m yc和p53蛋白的表达增 强，而c-myc蛋白的表达早于p53蛋白，结合其他学者的研究报告〔14-16〕，我们推测 ，bFGF经过其受体将刺激由胞外转入胞核内，诱导原癌基因c-myc 的表达，导 致p53的激活。激活的p53与PCNA基因启动子区的结合，以核转录因子的方式激活PCNA的转录 与表达，引起细胞的增殖活动。同时，c-myc自身可能存在负反馈机制，即激活 p53后，顺次激活p21蛋白，抑制细胞周期依赖蛋白激酶(CDK)活性，促进细胞的凋亡产生。通过对细胞增殖与凋亡的调节维持机体平衡。
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〔12〕Tanaka E,Ase K,Okuda T,et al.Mechanism of acceleration of wound healin g by basic fibroblast growth factor in genetically diabetic mice〔J〕.Biol Pharm Bull,1996,19(9):1141-1148.
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〔14〕顾小曼,付小兵.创面愈合过程中两种原癌基因与碱性成纤维细胞生长因子的调控关系 〔J〕.中华创伤杂志，2000，16(6)：340-344.
〔15〕Blagosklonny M V.A node between proliferation,apoptosis,and growth arrest 〔J〕.Bioessays,1999,21(8):704-709.
〔16〕李晋涛，刘昕，吴玉章.p53基因与DNA修复〔J〕.国外医学分子生物学分册，2001 ，23(3)：151-153.
作者简介：程飚(1967-)，男(汉族)，江苏省徐州市人，医学博士，主治医师 ，主要从事创伤修复信号转导机制的研究。, http://www.100md.com