大鼠损伤神经的三种诱发簇放电节律
第四军医大学 1神经科学研究所、 2物理学教研室；西安 710032 段玉斌1；胡三觉1*；菅忠2；段建红1
关键词：自发放电；簇放电；放电节律；神经编码
摘要：实验运用单纤维记录技术, 观察了损伤神经起步点自发放电在改变[Ca2+]o和veratridine作用下放电节律的变化。结果表明: 在每一标本上, 记录到的相同背景的自发放电在低与高Ca2+浓度和veratridine的作用下, 转化为三种不同类型的簇放电。结果提示, 神经元放电的节律形式与刺激的性质相关, 不同的节律形式可能携带着不同的神经信息。
神经系统利用动作电位串进行长距离信息传递, 而动作电位序列大多是不规则的, 表现出多样的节律形式。关于究竟是动作电位串的什么特征携带着神经信息的问题一直存在着争论。传统观点认为, 在神经元的放电串中唯一重要的性质就是它的放电频率, 正是放电频率携带着信息, 平均放电频率的高低表示信号的强弱, 而放电串中动作电位峰峰间期(interspike interval, ISI)的变异被认为是噪声, 不带有任何神经信息[1]。随着非线性动力学在神经科学中的应用, 这种ISI变化的发生机制逐步被揭示, 进而对神经放电的机制也有了进一步的认识。神经放电节律的概念及其在神经信息传递中的作用的研究, 也越来越受到神经生理学工作者的重视[2]。
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簇放电(bursting)节律是常见的一类神经放电形式, 其基本特征是重复放电状态与静息状态交替出现[3]。Bertram和Del Negro等根据簇放电内ISI的变化规律将其分为三种亚型, 并分别在胰腺细胞、海兔(aplysia)的R15神经元、大鼠三叉神经节神经元等不同的可兴奋细胞上观察到, 并认为分别与胰岛素的高效分泌、海兔水中运动的平衡、大鼠颌骨的运动方式等有关[3,4]。至于这三种簇放电分别是不同种类神经元特有的放电模式, 还是分别与不同刺激信息的传递有关, 并不清楚。 本文为探讨神经放电节律形式发生的离子基础和通道机制, 利用坐骨神经慢性压迫模型, 观察了EGTA、 黎芦碱和钙离子对节律形式发生的作用, 发现在同一标本上, 这三种药物在持续紧张性放电的基础上可明确地诱发上述三种簇放电。实验结果对于阐明簇放电的发生机制及其信息传递中的作用有重要意义。
1 材料和方法
1.1 动物模型制备 选用成年雄性 SD 大鼠 (200~300 g), 在戊巴比妥钠(40 mg/kg, i.p.)麻醉下, 于股骨中段处暴露右侧坐骨神经, 分离出大约1 cm长的一段神经干, 以直径约0.2 mm的同种异体大鼠的尾肌腱轻度结扎神经干。每隔l mm扎一个结, 共4个结, 对坐骨神经形成长度为5 mm的一个区段的慢性压迫作用。结扎完成后, 逐层缝合肌肉、皮肤。详见文献[5]。
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1.2 实验手术与数据记录 7~10 d后将动物再度麻醉并做气管插管, 暴露损伤区并仔细去除神经损伤区周围结缔组织, 用丝线结扎损伤区外侧的神经以离断损伤区与外周的联系。以温度为33~35℃的克氏液(mmol/L): NaCl 150、 KCl 5、 MgCl2 1、 CaCl2 1.2、 HEPES 5、 Glucose 10, pH 7.4 灌流损伤区。在损伤区中枢侧约20 mm处另行切口, 暴露坐骨神经, 以同温石蜡油浸浴。在显微镜下小心撕开神经外膜, 分离神经细束, 离断细束与中枢的联系, 使之与损伤区相连。置细束于直径约15 μm白金丝引导电极上, 记录细束神经纤维的自发放电, 当记录到单根的单位纤维放电时便进行实验观察。放电经A/D 转换板输入计算机, 采样频率为10 kHz。整个实验过程中, 经示波器监视放电的波宽与幅度, 以保证记录到的始终是单纤维的放电。连续记录采样的电压值得到原始动作电位图, 顺序记录相邻动作电位峰峰间的时间间隔得到ISI序列。
2 结果
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实验中, 在以正常克氏液灌流损伤区的条件下观察单神经纤维的自发放电时, 不同的神经纤维可表现出多种节律形式[6, 7], 本文是以稳定连续的紧张性放电(beating)(图1A)为本底研究了放电起步点在不同的药物作用下所诱发的不同类型的簇放电。本研究所观察的纤维的动作电位传导速度均大于10 m/s, 波宽为0.4~0.7 ms, 后电位幅度小于动作电位幅值的三分之一, 应属A类纤维。
2.1 EGTA诱发的Ⅰ型簇放电
在正常灌流液的作用下, 记录到如图1所示的beating模式放电后, 以含5 mmol EGTA (一种钙离子螯合剂)的无钙灌流液(n=17)替换正常灌流液作用于神经损伤区(起步点)。随着作用时间的延长, 起步点细胞外液中的钙离子逐渐被螯合, 细胞外液中的钙离子浓度持续下降, 便可以观察到beating形式自发放电逐渐转化为簇放电(图1B、C、D)。其基本特征为簇放电内ISI依次增大, 簇放电周期性重复发放。此型簇放电被称为Ⅰ型簇放电[3]。图2A为在EGTA作用下, ISI连续变化的散点图, 在动力学上被描述为ISI分岔(bifurcation)[6]。用正常灌流液洗脱后, 簇放电可恢复到初始的背景beating自发放电。
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2.2 Veratridine诱发的Ⅱ型簇放电
在正常灌流液作用下, 记录到稳定连续的紧张性自发放电后, 以含5 μmol/L veratridine (黎芦碱, 电压门控钠通道失活门的一种抑制剂)的灌流液(n=15)替换正常灌流液作用于神经损伤区。可以观察到连续的紧张性自发放电逐渐转化为Ⅱ型簇放电, 其基本特征为簇放电内ISI先由大逐渐减小尔后又逐渐增大, ISI的变化呈现倒置的抛物线状, 又称为抛物线型簇放电[4]。用正常灌流液洗脱后可恢复。
2.3 高浓度[Ca2+]o诱发Ⅲ型簇放电
在正常灌流液作用下, 记录到beating形式自发放电后, 以含5 mmol CaCl2的灌流液(n=11)替换正常灌流液作用于神经损伤区, 可以观察到连续的紧张性自发放电逐渐转化为Ⅲ型簇放电, 其基本特征为簇放电长度与簇间的静息相长度变化不定(图4A), 簇内ISI大小基本一致(图4B)。图4C为药物作用下放电节律变化的散点图, 纵坐标经指数变换, 显示簇放电内ISI变化程度很小(10 ms), 而静息相在很大的范围(500~2000 ms)内变化。用正常灌流液洗脱后可恢复。
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3 讨论
坐骨神经慢性压迫模型是研究外周神经病理性疼痛的一种动物模型。神经干的慢性压迫可使其局部的轴突发生脱髓鞘, 膜上离子通道的种类和数量发生改变, 形成异位起步点(ectopic pacemaker)。这种异位起步的自发放电被认为与慢性神经病理性痛有关[5]。神经轴突的这种起步点由于无髓鞘的包裹而易于受到药物的作用, 其电活动可以长时间稳定地记录, 又成为研究可兴奋膜放电节律及其转化规律的良好实验标本[6, 7]。
放电形式的发生机制一直是生理科学工作者关注的重要问题之一。对虾的慢与快牵张感受器的放电形式与镁离子浓度的关系[8], tetrodotoxin (TTX) 诱发受损背根节神经元整数倍放电形式[9]等研究提示, 放电节律形式与离子通道的电流或电导有密切关系。Bursting节律是神经元放电的一种常见形式。近几年来, 关于它在神经系统中的功能作用也逐渐被认识。Lever等的研究发现, 以相同频率的beating和bursting形式刺激背根, 在脊髓背角收集测量脑源性营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 后者所诱发释放的BDNF的量明显多于前者[10]。Lisman的研究提示, bursting放电使信息在中枢突触传递中更可靠[11]。Pike等的研究发现, 海马突触后神经元的bursting放电在“Hebbian”长时程增强(LTP)形成中非常重要[12]。
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节律形式的描述、定性刻画在研究放电形式的功能作用中是必不可少的[2, 13]。本研究针对同一标本在相同背景放电条件下, 在神经损伤区施加不同的药物, 分别减少或增加起步点外液中的钙离子, 或者抑制起步点细胞膜上钠通道的失活门, 可导致三种类型的bursting放电, 提示神经元放电的节律形式与刺激的性质相关, 不同的节律形式可能携带着不同的神经信息。这些不同的节律模式的放电在脊髓背角突触传递、可塑性变化的形成中的作用可能也不相同。神经放电的时间模式在神经系统功能活动中作用的研究为理解神经编码的本质提出了新的思路和研究方向。
参考文献
[1] Shadlen MN, Newsome WT. Noise, neural codes and cortical organization. Curr Opin Neurobiol, 1994,4:569~579.
[2] Abarbanel HD, Rabinovich MI. Neurodynamics: nonlinear dynamics and neurobiology. Curr Opin Neurobiol, 2001,11:423~430.
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[3] Bertram R, Butte MJ, Kiemel BT, Sherman A. Topological and phenomenological classification of bursting oscillations. Bul Mat Biol, 1995,57:413~439.
[4] Del Negro CA, Hsiao CF, Chandler SH, Garfinkel A. Evidence for a novel bursting mechanism in rodent trigeminal neurons. Biophys J, 1998,75:174~182.
[5] Bennett GT, Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those in man. Pain, 1988,33:87~107.
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[6] Ren W, Hu SJ, Zhang BJ, Wang FZ, Gong YF, Xu JX. Period-adding bifurcation with chaos in the interspike intervals generated by an experimental neural pacemaker. Int J Bifurcat Chaos, 1997,7:709~712.
[7] Duan YB (段玉斌), Jian Z (菅 忠), Hu SJ (胡三觉), Ren W (任 维). Chaos and intermittent phenomena in the spontaneous discharges of injured nerve. Acta Biophys Sin (生物物理学报), 1998,14:465~471 (Chinese, English abstract).
[8] Yang YZ(杨钦照), Sun HB (孙海宝), Xu K (徐 科). Dependence of discharge patterns of slow and fast stretch receptors of Penaeus orientaliaon Mg2+ concentration. Acta Physiol Sin (生理学报), 1984,36:77~80 (Chinese, English abstract).
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[9] Long KP(龙开平), Hu SJ (胡三觉), Duan YB (段玉斌), Xu H (徐 晖). Pattern and dynamic changes of integer multiples in spontaneous discharge of injured dorsal root ganglion neurons. Acta Physiol Sin (生理学报), 1999,51:481~487 (Chinese, English abstract).
[10] Lever IJ, Bradury EJ, Cunningham JR, Adelson DW, Jones MG, McMahon SB, Marvizon JC, Malcangio M. Brain-derived neurotrophic factor is released in the dorsal horn by distinctive patterns of afferent fiber stimulation. J Neurosci, 2001,21:4469~4477.
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[11] Lisman JE. Bursts as a unit of neural information: making unreliable synapses reliable. TINS, 1997,20:38~43.
[12] Pike FG, Meredith RM, Olding AW, Paulsen O. Post- synaptic bursting is essential for ‘Hebbian’ induction of associative long-term potentiation at excitatory synapses in rat hippocampus. J Physiol, 1999,518:571~576.
[13] Chen LC (陈力超), Gu YH (顾蕴辉). Coding theories and analyzing methods of information contained in neuronal spike trains. Progress Physiol Sci (生理科学进展), 1999,30:101~106 (Chinese, English abstract)., 百拇医药
关键词：自发放电；簇放电；放电节律；神经编码
摘要：实验运用单纤维记录技术, 观察了损伤神经起步点自发放电在改变[Ca2+]o和veratridine作用下放电节律的变化。结果表明: 在每一标本上, 记录到的相同背景的自发放电在低与高Ca2+浓度和veratridine的作用下, 转化为三种不同类型的簇放电。结果提示, 神经元放电的节律形式与刺激的性质相关, 不同的节律形式可能携带着不同的神经信息。
神经系统利用动作电位串进行长距离信息传递, 而动作电位序列大多是不规则的, 表现出多样的节律形式。关于究竟是动作电位串的什么特征携带着神经信息的问题一直存在着争论。传统观点认为, 在神经元的放电串中唯一重要的性质就是它的放电频率, 正是放电频率携带着信息, 平均放电频率的高低表示信号的强弱, 而放电串中动作电位峰峰间期(interspike interval, ISI)的变异被认为是噪声, 不带有任何神经信息[1]。随着非线性动力学在神经科学中的应用, 这种ISI变化的发生机制逐步被揭示, 进而对神经放电的机制也有了进一步的认识。神经放电节律的概念及其在神经信息传递中的作用的研究, 也越来越受到神经生理学工作者的重视[2]。
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簇放电(bursting)节律是常见的一类神经放电形式, 其基本特征是重复放电状态与静息状态交替出现[3]。Bertram和Del Negro等根据簇放电内ISI的变化规律将其分为三种亚型, 并分别在胰腺细胞、海兔(aplysia)的R15神经元、大鼠三叉神经节神经元等不同的可兴奋细胞上观察到, 并认为分别与胰岛素的高效分泌、海兔水中运动的平衡、大鼠颌骨的运动方式等有关[3,4]。至于这三种簇放电分别是不同种类神经元特有的放电模式, 还是分别与不同刺激信息的传递有关, 并不清楚。 本文为探讨神经放电节律形式发生的离子基础和通道机制, 利用坐骨神经慢性压迫模型, 观察了EGTA、 黎芦碱和钙离子对节律形式发生的作用, 发现在同一标本上, 这三种药物在持续紧张性放电的基础上可明确地诱发上述三种簇放电。实验结果对于阐明簇放电的发生机制及其信息传递中的作用有重要意义。
1 材料和方法
1.1 动物模型制备 选用成年雄性 SD 大鼠 (200~300 g), 在戊巴比妥钠(40 mg/kg, i.p.)麻醉下, 于股骨中段处暴露右侧坐骨神经, 分离出大约1 cm长的一段神经干, 以直径约0.2 mm的同种异体大鼠的尾肌腱轻度结扎神经干。每隔l mm扎一个结, 共4个结, 对坐骨神经形成长度为5 mm的一个区段的慢性压迫作用。结扎完成后, 逐层缝合肌肉、皮肤。详见文献[5]。
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1.2 实验手术与数据记录 7~10 d后将动物再度麻醉并做气管插管, 暴露损伤区并仔细去除神经损伤区周围结缔组织, 用丝线结扎损伤区外侧的神经以离断损伤区与外周的联系。以温度为33~35℃的克氏液(mmol/L): NaCl 150、 KCl 5、 MgCl2 1、 CaCl2 1.2、 HEPES 5、 Glucose 10, pH 7.4 灌流损伤区。在损伤区中枢侧约20 mm处另行切口, 暴露坐骨神经, 以同温石蜡油浸浴。在显微镜下小心撕开神经外膜, 分离神经细束, 离断细束与中枢的联系, 使之与损伤区相连。置细束于直径约15 μm白金丝引导电极上, 记录细束神经纤维的自发放电, 当记录到单根的单位纤维放电时便进行实验观察。放电经A/D 转换板输入计算机, 采样频率为10 kHz。整个实验过程中, 经示波器监视放电的波宽与幅度, 以保证记录到的始终是单纤维的放电。连续记录采样的电压值得到原始动作电位图, 顺序记录相邻动作电位峰峰间的时间间隔得到ISI序列。
2 结果
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实验中, 在以正常克氏液灌流损伤区的条件下观察单神经纤维的自发放电时, 不同的神经纤维可表现出多种节律形式[6, 7], 本文是以稳定连续的紧张性放电(beating)(图1A)为本底研究了放电起步点在不同的药物作用下所诱发的不同类型的簇放电。本研究所观察的纤维的动作电位传导速度均大于10 m/s, 波宽为0.4~0.7 ms, 后电位幅度小于动作电位幅值的三分之一, 应属A类纤维。
2.1 EGTA诱发的Ⅰ型簇放电
在正常灌流液的作用下, 记录到如图1所示的beating模式放电后, 以含5 mmol EGTA (一种钙离子螯合剂)的无钙灌流液(n=17)替换正常灌流液作用于神经损伤区(起步点)。随着作用时间的延长, 起步点细胞外液中的钙离子逐渐被螯合, 细胞外液中的钙离子浓度持续下降, 便可以观察到beating形式自发放电逐渐转化为簇放电(图1B、C、D)。其基本特征为簇放电内ISI依次增大, 簇放电周期性重复发放。此型簇放电被称为Ⅰ型簇放电[3]。图2A为在EGTA作用下, ISI连续变化的散点图, 在动力学上被描述为ISI分岔(bifurcation)[6]。用正常灌流液洗脱后, 簇放电可恢复到初始的背景beating自发放电。
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2.2 Veratridine诱发的Ⅱ型簇放电
在正常灌流液作用下, 记录到稳定连续的紧张性自发放电后, 以含5 μmol/L veratridine (黎芦碱, 电压门控钠通道失活门的一种抑制剂)的灌流液(n=15)替换正常灌流液作用于神经损伤区。可以观察到连续的紧张性自发放电逐渐转化为Ⅱ型簇放电, 其基本特征为簇放电内ISI先由大逐渐减小尔后又逐渐增大, ISI的变化呈现倒置的抛物线状, 又称为抛物线型簇放电[4]。用正常灌流液洗脱后可恢复。
2.3 高浓度[Ca2+]o诱发Ⅲ型簇放电
在正常灌流液作用下, 记录到beating形式自发放电后, 以含5 mmol CaCl2的灌流液(n=11)替换正常灌流液作用于神经损伤区, 可以观察到连续的紧张性自发放电逐渐转化为Ⅲ型簇放电, 其基本特征为簇放电长度与簇间的静息相长度变化不定(图4A), 簇内ISI大小基本一致(图4B)。图4C为药物作用下放电节律变化的散点图, 纵坐标经指数变换, 显示簇放电内ISI变化程度很小(10 ms), 而静息相在很大的范围(500~2000 ms)内变化。用正常灌流液洗脱后可恢复。
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3 讨论
坐骨神经慢性压迫模型是研究外周神经病理性疼痛的一种动物模型。神经干的慢性压迫可使其局部的轴突发生脱髓鞘, 膜上离子通道的种类和数量发生改变, 形成异位起步点(ectopic pacemaker)。这种异位起步的自发放电被认为与慢性神经病理性痛有关[5]。神经轴突的这种起步点由于无髓鞘的包裹而易于受到药物的作用, 其电活动可以长时间稳定地记录, 又成为研究可兴奋膜放电节律及其转化规律的良好实验标本[6, 7]。
放电形式的发生机制一直是生理科学工作者关注的重要问题之一。对虾的慢与快牵张感受器的放电形式与镁离子浓度的关系[8], tetrodotoxin (TTX) 诱发受损背根节神经元整数倍放电形式[9]等研究提示, 放电节律形式与离子通道的电流或电导有密切关系。Bursting节律是神经元放电的一种常见形式。近几年来, 关于它在神经系统中的功能作用也逐渐被认识。Lever等的研究发现, 以相同频率的beating和bursting形式刺激背根, 在脊髓背角收集测量脑源性营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 后者所诱发释放的BDNF的量明显多于前者[10]。Lisman的研究提示, bursting放电使信息在中枢突触传递中更可靠[11]。Pike等的研究发现, 海马突触后神经元的bursting放电在“Hebbian”长时程增强(LTP)形成中非常重要[12]。
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节律形式的描述、定性刻画在研究放电形式的功能作用中是必不可少的[2, 13]。本研究针对同一标本在相同背景放电条件下, 在神经损伤区施加不同的药物, 分别减少或增加起步点外液中的钙离子, 或者抑制起步点细胞膜上钠通道的失活门, 可导致三种类型的bursting放电, 提示神经元放电的节律形式与刺激的性质相关, 不同的节律形式可能携带着不同的神经信息。这些不同的节律模式的放电在脊髓背角突触传递、可塑性变化的形成中的作用可能也不相同。神经放电的时间模式在神经系统功能活动中作用的研究为理解神经编码的本质提出了新的思路和研究方向。
参考文献
[1] Shadlen MN, Newsome WT. Noise, neural codes and cortical organization. Curr Opin Neurobiol, 1994,4:569~579.
[2] Abarbanel HD, Rabinovich MI. Neurodynamics: nonlinear dynamics and neurobiology. Curr Opin Neurobiol, 2001,11:423~430.
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[3] Bertram R, Butte MJ, Kiemel BT, Sherman A. Topological and phenomenological classification of bursting oscillations. Bul Mat Biol, 1995,57:413~439.
[4] Del Negro CA, Hsiao CF, Chandler SH, Garfinkel A. Evidence for a novel bursting mechanism in rodent trigeminal neurons. Biophys J, 1998,75:174~182.
[5] Bennett GT, Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those in man. Pain, 1988,33:87~107.
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[6] Ren W, Hu SJ, Zhang BJ, Wang FZ, Gong YF, Xu JX. Period-adding bifurcation with chaos in the interspike intervals generated by an experimental neural pacemaker. Int J Bifurcat Chaos, 1997,7:709~712.
[7] Duan YB (段玉斌), Jian Z (菅 忠), Hu SJ (胡三觉), Ren W (任 维). Chaos and intermittent phenomena in the spontaneous discharges of injured nerve. Acta Biophys Sin (生物物理学报), 1998,14:465~471 (Chinese, English abstract).
[8] Yang YZ(杨钦照), Sun HB (孙海宝), Xu K (徐 科). Dependence of discharge patterns of slow and fast stretch receptors of Penaeus orientaliaon Mg2+ concentration. Acta Physiol Sin (生理学报), 1984,36:77~80 (Chinese, English abstract).
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[9] Long KP(龙开平), Hu SJ (胡三觉), Duan YB (段玉斌), Xu H (徐 晖). Pattern and dynamic changes of integer multiples in spontaneous discharge of injured dorsal root ganglion neurons. Acta Physiol Sin (生理学报), 1999,51:481~487 (Chinese, English abstract).
[10] Lever IJ, Bradury EJ, Cunningham JR, Adelson DW, Jones MG, McMahon SB, Marvizon JC, Malcangio M. Brain-derived neurotrophic factor is released in the dorsal horn by distinctive patterns of afferent fiber stimulation. J Neurosci, 2001,21:4469~4477.
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[11] Lisman JE. Bursts as a unit of neural information: making unreliable synapses reliable. TINS, 1997,20:38~43.
[12] Pike FG, Meredith RM, Olding AW, Paulsen O. Post- synaptic bursting is essential for ‘Hebbian’ induction of associative long-term potentiation at excitatory synapses in rat hippocampus. J Physiol, 1999,518:571~576.
[13] Chen LC (陈力超), Gu YH (顾蕴辉). Coding theories and analyzing methods of information contained in neuronal spike trains. Progress Physiol Sci (生理科学进展), 1999,30:101~106 (Chinese, English abstract)., 百拇医药