人扁桃体中应激免疫抑制蛋白的初步观察
北京大学医学部 1生理学系、 2病理学系；3北京大学第三附属医院耳鼻喉科；北京 100083 张杰1*；王健1；冯娟1；钟贞3；张波2；范少光1
关键词：扁桃体；淋巴细胞转化；免疫组化；应激免疫抑制蛋白
摘要：以前的实验证明, 在应激条件下, 外周淋巴组织中可产生一种蛋白质, 具有抑制某些免疫功能的作用, 称为应激免疫抑制蛋白(immune suppressive protein of stress, ISPS)。本实验用人外周淋巴器官扁桃体进行了研究, 证明扁桃体的提取物能抑制小鼠由Con A诱导的淋巴细胞转化, 而且这种抑制作用可被ISPS单克隆抗体(2C4)部分翻转。间接ELISA法证明人扁桃体提取物能与2C4单克隆抗体相结合。以ISPS单克隆抗体(2C4)作免疫组织化学研究, 证明人扁桃体中有很多染色呈阳性的细胞。这些结果从不同角度提示, 人外周淋巴组织中存在一种与ISPS相类似的免疫抑制物质。
, 百拇医药
本室以前的工作证明, 大鼠和小鼠在束缚应激后, 在中枢神经系统控制下, T淋巴细胞可以产生一种大分子蛋白质(约160 kD), 释放到血中, 具有抑制淋巴细胞转化等多种免疫抑制活性, 命名为应激免疫抑制蛋白(immune suppressive protein of stress, ISPS)[1~3]。随后的研究证明, 在肺癌患者[4]、 银屑病患者[5]以及剧烈运动后的运动员的血清中[6], 均存在能抑制淋巴细胞转化的物质, 与ISPS相类似。本实验通过功能、抗原性和形态学三方面的研究, 进一步探索了人扁桃体中是否存在与ISPS类似的免疫抑制物质。
BALB/C小鼠(18~20 g), 由北京大学医学部动物部提供; 扁桃体切除术后的人体扁桃体标本, 由北京大学第三附属医院耳鼻喉科提供, 共13例。抗ISPS-2C4单克隆抗体[7], 北医神经免疫实验室制备; 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG, 生物素标记的羊抗小鼠IgG, 购自美国Sigma公司。其他试剂至少为分析纯。
, 百拇医药
样品处理0.05 mol/L盐酸提取液以10 ml/g比例匀浆扁桃体标本, 12000 r/min离心20 min, 取上清, 冷冻抽干, 0.01 mol/L pH 7.4 PBS复溶样品, 离心后取上清, 于-20℃保存。
淋巴细胞转化[1, 2]取正常BALB/C小鼠脾脏制成淋巴细胞悬液, 细胞浓度为1.5×106/ml, 刀豆蛋白(Con A)浓度为2 μg/ml, 按一定比例加入组织提取物, 样本每稀释度设三复孔, 置于37℃, 5% CO2培养箱中培养48 h, 结束培养前6 h加[3H]TdR(7.4 kBq/每孔), 用β-液体计数仪测定放射活性, 结果以cpm表示。由于淋巴细胞转化试验每一批之间cpm的绝对值变化较大, 在每次实验中我们都设置了对照组, 观察正常淋巴细胞转化对Con A的反应, 即在培养液中加Con A(2 μg/ml)和不加Con A, 观察淋巴细胞的反应, 作为对照。
2C4单克隆抗体翻转实验[7]不同稀释度的扁桃体提取物与2C4单克隆抗体(1∶1000)及RPMI 1640混合, CO2培养箱孵育2 h, 加入正常淋巴细胞悬液培养(方法同上), 测定放射活性, 观察2C4单克隆抗体对扁桃体提取物抑制淋巴细胞转化活性的影响。
, 百拇医药
间接ELISA法检测扁桃体提取物以截留分子量30 kD超滤管超滤扁桃体提取物, 对分子量大于30 kD和小于30 kD的组分进行检测。方法详见参考文献[8]。以10 μg/ml蛋白浓度溶于50 mmol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液, 100 μl/孔包被酶标板, 一抗为 2C4单克隆抗体100 μl/孔(0.3 μg/ml), 二抗为羊抗小鼠IgG (1∶1000) 100 μl/孔, 最后以底物OPD 0.04 mg/孔显色, 在波长492 nm 处测光密度(OD值)。
免疫组织化学实验方法详见参考文献[9]。简述如下： 冰冻切片, 厚度5 μm, 用微波炉法处理, 滴加适当比例稀释的2C4单克隆抗体。二抗为羊抗鼠抗体(1∶200)。加入ABC复合物, 以DAB显色液显色(用前加入少量H2O2)。于显微镜下观察, 待显色后终止反应, 复染, 最后封片。
数据处理数据以Means±SE表示；以方差分析(ANOVA)作统计学处理, P<0.05为差异具有显著性。
, 百拇医药
主要实验结果如下：
1. 扁桃体提取物对正常小鼠淋巴细胞转化的影响
2. 2C4单克隆抗体的翻转作用
3. 免疫组化染色
以 2C4单克隆抗体作免疫组化检查, 结果表明, 人心肌和大脑, 小鼠骨骼肌切片中均未见阳性(咖啡色)着色细胞；人扁桃体和淋巴结切片中存在大量阳性着色细胞。
4. ELISA测定
实验中将人扁桃体提取物超滤分离(超滤膜截留分子量为30 kD), 分子量大于30 kD和小于30 kD组, 蛋白浓度分别为5和10 μg/ml时, OD值分别为0.259±0.0105和0.043±0.0104以及0.328±0.0162和0.064±0.0096。结果表明, 提取物中分子量在30 kD以上的组分别有能够与2C4单克隆抗相结合的物质, 且呈剂量反应关系(P<0.01)。而小于30 kD组分未见明显的结合, 提示提取物中存在与2C4单克隆抗体相结合的抗原, 且分子量大于30 kD 。
, 百拇医药
本实验以淋巴细胞转化检测ISPS的生物活性。淋巴细胞转化试验的优点是敏感性很高, 缺点是不同批次间, 淋巴细胞转化绝对值可以有很大差异。实验中可采用与正常淋巴细胞转化的百分比来表示, 但使用绝对数据往往能反映实验中一些被百分数掩盖的情况。本文的实验数据均使用绝对值。
本室以前的研究结果表明, 骨骼肌和脑组织不产生ISPS, 因此采用骨骼肌和脑组织作为实验的阴性对照。由于人的骨骼肌和大脑取材十分困难, 实验中采用了小鼠骨骼肌。由于很多组织的提取物, 在高浓度的条件下均能够抑制淋巴细胞转化。例如血清, 正常血清就具有抑制淋巴细胞转化的作用, 因此在确定血清中是否具有特异抑制淋巴细胞转化的作用, 通常必须与正常血清作比较, 并作剂量效应的检验, 从它的相对关系和其他实验综合分析结果。本实验中, 骨骼肌在高浓度时也表现出对淋巴细胞转化的抑制。但与扁桃体提取物的抑制作用相比, 它们之间的差别具有显著性。提示扁桃体的提取物中可能存有ISPS。
进一步的研究证明, ISPS单克隆抗体2C4能够部分翻转这种抑制作用(图2), 这与我们以前报道的应激免疫抑制蛋白的结果一致。ELISA的结果则从另一个侧面证明提取物中有能与2C4单克隆抗体相结合的物质(图4)。我们同时还利用2C4单克隆抗体进行了形态学研究, 免疫组化结果显示, 人体淋巴结和扁桃体免疫组织化学染色呈阳性；而心肌、骨骼肌和脑组织染色呈阴性。上述结果从功能、抗原性及形态学三方面提示人体淋巴组织中可能存在一种与ISPS相类似的免疫抑制物质。本研究为以后开展人体神经免疫调节研究提供了有力的佐证。
, 百拇医药
参考文献
[1]Zha HB, Ding GF, Fan SG. Serum factor(s) induced by restraint stress in mice and rats suppresses lymphocyte proliferation. Brain Behav Immun, 1992, 6: 18~31.
[2]Fan SG. A factor in lymph node and spleen induced by restraint stress in mice and rats suppresses lymphocyte proliferation. Neuroimmunomodulation， 1995, 2: 274.
[3]Fan SG(范少光), Ding GF(丁桂凤).T lymyhocyte generates an immunosuppressive protein induced by stress. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1999, 31(3)：197~203 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药
[4]Zhu XS(朱晓松), Hu HZ(胡鸿藻). An immuno-suppressive factor in the serum of patients with lung cancer. Chin J Exp Surg (中华实验外科学杂志), 1999, 16(3)：228~229 (Chinese, English abstract).
[5]Yang XQ(杨雪琴), Shao L(邵 黎), Na AH(那爱华), Guo XL(郭秀兰), Pang XW(庞晓文), Li SY(李世荫), Fan SG(范少光).The study of neruro-immune protein and the lymphocyte transformation in psoriatic serum. Chin J Dermatol (中华皮肤科杂志), 1998, 31(2)：97~99 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药 [6]Shao L(邵 黎), Jiao W(矫 伟), Zhu XS(朱晓松), Fan SG(范少光).Generation of suppressive protein after heavy physical stress in athletes. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1997, 13(4)：312~314 (Chinese).
[7]Li LQ, Deng YL, Shao L, Fan SG. Production and Characterization of a monoclone antibody against immune suppresses factor induced by restraint stress. Chin J Neuroimmunol Neurol (中国神经病学与神经免疫学杂志), 1997, 4(suppl):39(English, Chinese abstract).
[8]杨贵贞. 免疫生物工程纲要与技术. 吉林：吉林科学出版社， 1991, 209.
[9]朱立平, 陈学清. 免疫学常用实验方法. 北京：人民军医出版社， 2000, 398~400., 百拇医药
关键词：扁桃体；淋巴细胞转化；免疫组化；应激免疫抑制蛋白
摘要：以前的实验证明, 在应激条件下, 外周淋巴组织中可产生一种蛋白质, 具有抑制某些免疫功能的作用, 称为应激免疫抑制蛋白(immune suppressive protein of stress, ISPS)。本实验用人外周淋巴器官扁桃体进行了研究, 证明扁桃体的提取物能抑制小鼠由Con A诱导的淋巴细胞转化, 而且这种抑制作用可被ISPS单克隆抗体(2C4)部分翻转。间接ELISA法证明人扁桃体提取物能与2C4单克隆抗体相结合。以ISPS单克隆抗体(2C4)作免疫组织化学研究, 证明人扁桃体中有很多染色呈阳性的细胞。这些结果从不同角度提示, 人外周淋巴组织中存在一种与ISPS相类似的免疫抑制物质。
, 百拇医药
本室以前的工作证明, 大鼠和小鼠在束缚应激后, 在中枢神经系统控制下, T淋巴细胞可以产生一种大分子蛋白质(约160 kD), 释放到血中, 具有抑制淋巴细胞转化等多种免疫抑制活性, 命名为应激免疫抑制蛋白(immune suppressive protein of stress, ISPS)[1~3]。随后的研究证明, 在肺癌患者[4]、 银屑病患者[5]以及剧烈运动后的运动员的血清中[6], 均存在能抑制淋巴细胞转化的物质, 与ISPS相类似。本实验通过功能、抗原性和形态学三方面的研究, 进一步探索了人扁桃体中是否存在与ISPS类似的免疫抑制物质。
BALB/C小鼠(18~20 g), 由北京大学医学部动物部提供; 扁桃体切除术后的人体扁桃体标本, 由北京大学第三附属医院耳鼻喉科提供, 共13例。抗ISPS-2C4单克隆抗体[7], 北医神经免疫实验室制备; 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG, 生物素标记的羊抗小鼠IgG, 购自美国Sigma公司。其他试剂至少为分析纯。
, 百拇医药
样品处理0.05 mol/L盐酸提取液以10 ml/g比例匀浆扁桃体标本, 12000 r/min离心20 min, 取上清, 冷冻抽干, 0.01 mol/L pH 7.4 PBS复溶样品, 离心后取上清, 于-20℃保存。
淋巴细胞转化[1, 2]取正常BALB/C小鼠脾脏制成淋巴细胞悬液, 细胞浓度为1.5×106/ml, 刀豆蛋白(Con A)浓度为2 μg/ml, 按一定比例加入组织提取物, 样本每稀释度设三复孔, 置于37℃, 5% CO2培养箱中培养48 h, 结束培养前6 h加[3H]TdR(7.4 kBq/每孔), 用β-液体计数仪测定放射活性, 结果以cpm表示。由于淋巴细胞转化试验每一批之间cpm的绝对值变化较大, 在每次实验中我们都设置了对照组, 观察正常淋巴细胞转化对Con A的反应, 即在培养液中加Con A(2 μg/ml)和不加Con A, 观察淋巴细胞的反应, 作为对照。
2C4单克隆抗体翻转实验[7]不同稀释度的扁桃体提取物与2C4单克隆抗体(1∶1000)及RPMI 1640混合, CO2培养箱孵育2 h, 加入正常淋巴细胞悬液培养(方法同上), 测定放射活性, 观察2C4单克隆抗体对扁桃体提取物抑制淋巴细胞转化活性的影响。
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间接ELISA法检测扁桃体提取物以截留分子量30 kD超滤管超滤扁桃体提取物, 对分子量大于30 kD和小于30 kD的组分进行检测。方法详见参考文献[8]。以10 μg/ml蛋白浓度溶于50 mmol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液, 100 μl/孔包被酶标板, 一抗为 2C4单克隆抗体100 μl/孔(0.3 μg/ml), 二抗为羊抗小鼠IgG (1∶1000) 100 μl/孔, 最后以底物OPD 0.04 mg/孔显色, 在波长492 nm 处测光密度(OD值)。
免疫组织化学实验方法详见参考文献[9]。简述如下： 冰冻切片, 厚度5 μm, 用微波炉法处理, 滴加适当比例稀释的2C4单克隆抗体。二抗为羊抗鼠抗体(1∶200)。加入ABC复合物, 以DAB显色液显色(用前加入少量H2O2)。于显微镜下观察, 待显色后终止反应, 复染, 最后封片。
数据处理数据以Means±SE表示；以方差分析(ANOVA)作统计学处理, P<0.05为差异具有显著性。
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主要实验结果如下：
1. 扁桃体提取物对正常小鼠淋巴细胞转化的影响
2. 2C4单克隆抗体的翻转作用
3. 免疫组化染色
以 2C4单克隆抗体作免疫组化检查, 结果表明, 人心肌和大脑, 小鼠骨骼肌切片中均未见阳性(咖啡色)着色细胞；人扁桃体和淋巴结切片中存在大量阳性着色细胞。
4. ELISA测定
实验中将人扁桃体提取物超滤分离(超滤膜截留分子量为30 kD), 分子量大于30 kD和小于30 kD组, 蛋白浓度分别为5和10 μg/ml时, OD值分别为0.259±0.0105和0.043±0.0104以及0.328±0.0162和0.064±0.0096。结果表明, 提取物中分子量在30 kD以上的组分别有能够与2C4单克隆抗相结合的物质, 且呈剂量反应关系(P<0.01)。而小于30 kD组分未见明显的结合, 提示提取物中存在与2C4单克隆抗体相结合的抗原, 且分子量大于30 kD 。
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本实验以淋巴细胞转化检测ISPS的生物活性。淋巴细胞转化试验的优点是敏感性很高, 缺点是不同批次间, 淋巴细胞转化绝对值可以有很大差异。实验中可采用与正常淋巴细胞转化的百分比来表示, 但使用绝对数据往往能反映实验中一些被百分数掩盖的情况。本文的实验数据均使用绝对值。
本室以前的研究结果表明, 骨骼肌和脑组织不产生ISPS, 因此采用骨骼肌和脑组织作为实验的阴性对照。由于人的骨骼肌和大脑取材十分困难, 实验中采用了小鼠骨骼肌。由于很多组织的提取物, 在高浓度的条件下均能够抑制淋巴细胞转化。例如血清, 正常血清就具有抑制淋巴细胞转化的作用, 因此在确定血清中是否具有特异抑制淋巴细胞转化的作用, 通常必须与正常血清作比较, 并作剂量效应的检验, 从它的相对关系和其他实验综合分析结果。本实验中, 骨骼肌在高浓度时也表现出对淋巴细胞转化的抑制。但与扁桃体提取物的抑制作用相比, 它们之间的差别具有显著性。提示扁桃体的提取物中可能存有ISPS。
进一步的研究证明, ISPS单克隆抗体2C4能够部分翻转这种抑制作用(图2), 这与我们以前报道的应激免疫抑制蛋白的结果一致。ELISA的结果则从另一个侧面证明提取物中有能与2C4单克隆抗体相结合的物质(图4)。我们同时还利用2C4单克隆抗体进行了形态学研究, 免疫组化结果显示, 人体淋巴结和扁桃体免疫组织化学染色呈阳性；而心肌、骨骼肌和脑组织染色呈阴性。上述结果从功能、抗原性及形态学三方面提示人体淋巴组织中可能存在一种与ISPS相类似的免疫抑制物质。本研究为以后开展人体神经免疫调节研究提供了有力的佐证。
, 百拇医药
参考文献
[1]Zha HB, Ding GF, Fan SG. Serum factor(s) induced by restraint stress in mice and rats suppresses lymphocyte proliferation. Brain Behav Immun, 1992, 6: 18~31.
[2]Fan SG. A factor in lymph node and spleen induced by restraint stress in mice and rats suppresses lymphocyte proliferation. Neuroimmunomodulation， 1995, 2: 274.
[3]Fan SG(范少光), Ding GF(丁桂凤).T lymyhocyte generates an immunosuppressive protein induced by stress. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1999, 31(3)：197~203 (Chinese, English abstract).
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[4]Zhu XS(朱晓松), Hu HZ(胡鸿藻). An immuno-suppressive factor in the serum of patients with lung cancer. Chin J Exp Surg (中华实验外科学杂志), 1999, 16(3)：228~229 (Chinese, English abstract).
[5]Yang XQ(杨雪琴), Shao L(邵 黎), Na AH(那爱华), Guo XL(郭秀兰), Pang XW(庞晓文), Li SY(李世荫), Fan SG(范少光).The study of neruro-immune protein and the lymphocyte transformation in psoriatic serum. Chin J Dermatol (中华皮肤科杂志), 1998, 31(2)：97~99 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药 [6]Shao L(邵 黎), Jiao W(矫 伟), Zhu XS(朱晓松), Fan SG(范少光).Generation of suppressive protein after heavy physical stress in athletes. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1997, 13(4)：312~314 (Chinese).
[7]Li LQ, Deng YL, Shao L, Fan SG. Production and Characterization of a monoclone antibody against immune suppresses factor induced by restraint stress. Chin J Neuroimmunol Neurol (中国神经病学与神经免疫学杂志), 1997, 4(suppl):39(English, Chinese abstract).
[8]杨贵贞. 免疫生物工程纲要与技术. 吉林：吉林科学出版社， 1991, 209.
[9]朱立平, 陈学清. 免疫学常用实验方法. 北京：人民军医出版社， 2000, 398~400., 百拇医药