自发性高血压大鼠中血小板源生长因子-AA及其受体表达与血管平滑肌细胞增殖的关系
1第三军医大学新桥医院心内科；重庆400037；2第三军医大学大坪医院高血压内分泌科；重庆400042 晋军1；祝善俊1* ；祝之明2；杨永健1；丁钢1
关键词：自发性高血压；血小板源生长因子-AA；血小板源生长因子α受体
摘要：为明确血小板源生长因子-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA)及PDGF-α受体在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rats, SHR)血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖中的作用, 采用Western blot、 [3H]TdR及 [3H]Leu掺入率等方法, 观察在SHR和WKY大鼠VSMC中PDGF-AA及PDGF受体表达的差异; 在PDGF-AA刺激下VSMC增殖和肥大反应的变化。结果显示, SHR-VSMC 中PDGF-AA、PDGF-α受体蛋白表达明显高于WKY-VSMC(P<0.01), 而PDGF-β受体蛋白表达在SHR-VSMC与WKY-VSMC无明显差异; 在不同浓度PDGF-AA刺激下, 增殖细胞核抗原(PCNA)及3H掺入率在SHR-VSMC明显增强且呈剂量依赖性增加(P<0.01)。本研究表明PDGF-A链及其α受体的自泌性增高, 可能是导致SHR-VSMC异常增殖和肥大, 并导致血管构型变化的重要原因之一。
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血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)是决定血管反应性和血管构型的重要因素。几种常见的心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、 血管再狭窄等都与血管重构有关。 许多研究表明, 血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)与它特异的受体结合, 通过介导细胞内一系列信号转导, 在血管重构中起重要作用[1]。PDGF有三个二聚体(AA、 BB、 AB), 而PDGF受体含α和β亚基, PDGF-α受体能结合PDGF的所有二聚体, 而PDGF-β受体则只能结合PDGF-BB。但PDGF具体通过哪种二聚体发挥作用, 在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)血管平滑肌细胞中PDGF-α 和β受体表达有什么差异, 目前仍不清楚。本研究重点探讨SHR-VSMC增殖与PDGF-A链和PDGF-α受体的关系, 为血管重构的基因治疗提供理论依据。
1材料和方法
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1.1 材料实验用SHR及Wistar-Kyoto (WKY) 大鼠由第三军医大学动物中心提供; M199培养基购于GIBCO公司; PDGF-AA购于Sigma公司; PDGF-AA、 PDGF-α受体、 PDGF-β受体及PCNA抗体和辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗及硝酸纤维膜购于Santa公司; 化学发光试剂购于Gene公司; 氚-亮氨酸([3H]Leu)购于中国科学院上海核技术开发公司; 氚-胸腺嘧啶([3H]TdR)购于北京原子能科学研究院。
1.2 血管平滑肌细胞(VSMC)培养及鉴定[2]取20周龄雄性SHR、 WKY大鼠各10只, 尾动脉血压分别为29.3±1.07、 16.8±1.6 kPa, 无菌操作下取出胸主动脉, 按文献方法原代培养VSMC。用抗平滑肌细胞特异α -actin抗体免疫组化法鉴定VSMC。
1.3 PDGF-AA、 PDGF-α受体、 PDGF-β受体蛋白在WKY及SHR-VSMC中的表达第5代VSMC培养至80%融合状态, 换无血清培养基培养24 h, 提取蛋白并定量, 经聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40 μg总蛋白), 电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上, 封闭、 加I抗、 辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗, 化学发光试剂增强反应, X光片压片曝光, 凝胶成像系统分析结果, 设对照并重复3次。
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1.4 PDGF-AA对SHR和WKY大鼠VSMC增殖核抗原(PCNA)表达的影响第5代VSMC培养至80%融合状态, 换无血清培养基培养24 h, 分别加入不同浓度(ng/ml) PDGF-AA(2、 5、 10、 20)剌激VSMC 24 h后, 提取蛋白并定量, 方法同1.3。
1.5 PDGF-AA对SHR和WKY大鼠VSMC蛋白及核酸合成的影响[3H]Leu及[3H]TdR掺入量的测定按参考文献[5]的方法进行。用放射性同位素[3H]Leu掺入量反映平滑肌细胞蛋白质合成速率, 用放射性同位素[3H]TdR掺入量反映平滑肌细胞核酸合成速率。
1.6 统计分析每组数据为3个样本测定数值的平均值, 结果以均值±标准差表示。进行t检验和方差分析, P<0.01为差异显著。
2结果
2.1 PDGF-AA、 PDGF-α受体、 PDGF-β受体蛋白在大鼠VSMC中的表达
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VSMC中PDGF-AA蛋白及PDGF-α受体表达在SHR明显高于WKY, P<0.01; PDGF-β受体蛋白表达在SHR与WKY组无明显差异。
2.3 PDGF-AA对SHR/WKY大鼠VSMC蛋白及核酸合成的影响
在不同浓度PDGF-AA刺激下, SHR-VSMC中[3H]Leu、 [3H]TdR掺入率呈剂量依赖性增高(P<0.01＝, 而PDGF-AA对WKY-VSMC [3H]掺入率无明显影响。
3讨论
许多研究证实高血压阻力血管结构变化与VSMC增生和肥大有关[3～5]。VSMC结构的变化及血管壁肥厚在不同类型的高血压表现都较为相似, 即通过VSMC生长和血管壁“重塑”(remodeling)共同作用的结果。高血压血管重塑的机制十分复杂, 遗传、 血液动力学、 血管活性物质和神经体液等因素共同参与重塑过程。
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以往的研究大多数都集中在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管重塑的影响, 而对生长因子如PDGF的作用研究较少。Parker [6, 7] 等人在AngⅡ刺激WKY大鼠高血压模型中发现: 皮下注射AngⅡ[200 ng/(kg·min)]2周, 大鼠血压持续升高, 主动脉壁/径比例增加, PDGF-A基因表达上调, PDGF-A蛋白及PCNA生成增加, 大鼠血压升高和动脉壁的肥厚与PDGF-A链的表达密切相关, 而应用AngⅡ受体(AT1)拮抗剂losartan [20 mg/(kg·d)]并不能阻断高血压大鼠动脉壁的肥厚以及PDGF-A链的高表达。本研究发现: PDGF-A链及其α受体表达在SHR和WKY-VSMC具有显著差异, 在WKY大鼠, PDGF-α受体仅有微量表达, PDGF-A链表达也明显低于SHR-VSMC, 而PDGF-β受体在两种细胞中的表达却无明显差异, 这一结果提示: 这种自身PDGF-A链及其α受体的高表达, 可能在自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖肥大、 血管功能异常中具有重要作用。为证实PDGF-A链及其α受体对VSMC的作用, 我们进一步观察了PDGF-A链对SHR/WKY-VSMC增殖和肥大作用的差异性, 发现PDGF-AA明显促进SHR-VSMC的增殖、 肥大(即核酸和蛋白的合成增加), 而对WKY-VSMC的作用较弱。这些结果表明, 自发性高血压VSMC中PDGF-A链及其α受体自泌性表达增高, 可能是导致VSMC异常增殖、 肥大, 从而触发血管重构的重要原因之一。PDGF-β受体及与其特异结合的PDGF-B链可能在介导高血压血管重构过程中的作用并不显著。这些观察为我们进一步在临床上选择针对高血压血管结构功能异常进行基因治疗的靶点和进一步探讨PDGF-α受体介导的信号转导通路提供了实验依据。
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参考文献
[1]Heldin CH, Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev, 1999, 79(4):1283～1316.
[2]Inagami T, Kambayashi Y, Ichiki T, Tsuzuki S, Eguchi S, Yamakawa T. AngiotensinⅡ receptors AT1 and AT2:new mechanisms of signaling and antagonistic effects of AT1 and AT2. Jpn Circ J, 1997, 61: 807～813.
[3]Fischer JW, Davies MG, Wight TN. Versican is the predominant proteoglycan in flow accelerated neointimal hyperplasia of endothelialized baboon vascular grafts. Circulation, 1998, 98 (supplⅠ): Ⅰ-228.Abstract.
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[4]Nakayama M, Fukuda N, Watanabe Y, Soma M, Hu WY, Kishioka H, Satoh C, Kubo A, Kanmatsuse K. Low dose of eicosapentaenoic acid inhibits the exaggerated growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats through suppression of transforming growth factor-beta. J Hypertens, 1999, 17 (10):1421～1430.
[5]Sabri A, Levy BI, Poitevin P, Caputo L, Faggin E, Marootte F, Rappaport L, Samuel JL. Differential roles of AT1 and AT2 receptor subtypes in vascular trophic and phenotypic changes in response to stimulation with angiotensinⅡ. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997, 17: 257～264.
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[6]Parker SB, Dobrian AD, Wade SS, Prewitt RL. AT(1) receptor inhibition does not reduce arterial wall hypertrophy or PDGF-A expression in renal hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278 (2):H613～H622.
[7]Dobrian A, Wade SS, Prewitt RL. PDGF-A expression correlates with blood pressure and remodeling in 1K1C hypertensive rat arteries. Am J Physiol, 1999, 276 (6 Pt 2):H2159～H2167., 百拇医药
关键词：自发性高血压；血小板源生长因子-AA；血小板源生长因子α受体
摘要：为明确血小板源生长因子-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA)及PDGF-α受体在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rats, SHR)血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖中的作用, 采用Western blot、 [3H]TdR及 [3H]Leu掺入率等方法, 观察在SHR和WKY大鼠VSMC中PDGF-AA及PDGF受体表达的差异; 在PDGF-AA刺激下VSMC增殖和肥大反应的变化。结果显示, SHR-VSMC 中PDGF-AA、PDGF-α受体蛋白表达明显高于WKY-VSMC(P<0.01), 而PDGF-β受体蛋白表达在SHR-VSMC与WKY-VSMC无明显差异; 在不同浓度PDGF-AA刺激下, 增殖细胞核抗原(PCNA)及3H掺入率在SHR-VSMC明显增强且呈剂量依赖性增加(P<0.01)。本研究表明PDGF-A链及其α受体的自泌性增高, 可能是导致SHR-VSMC异常增殖和肥大, 并导致血管构型变化的重要原因之一。
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血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)是决定血管反应性和血管构型的重要因素。几种常见的心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、 血管再狭窄等都与血管重构有关。 许多研究表明, 血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)与它特异的受体结合, 通过介导细胞内一系列信号转导, 在血管重构中起重要作用[1]。PDGF有三个二聚体(AA、 BB、 AB), 而PDGF受体含α和β亚基, PDGF-α受体能结合PDGF的所有二聚体, 而PDGF-β受体则只能结合PDGF-BB。但PDGF具体通过哪种二聚体发挥作用, 在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)血管平滑肌细胞中PDGF-α 和β受体表达有什么差异, 目前仍不清楚。本研究重点探讨SHR-VSMC增殖与PDGF-A链和PDGF-α受体的关系, 为血管重构的基因治疗提供理论依据。
1材料和方法
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1.1 材料实验用SHR及Wistar-Kyoto (WKY) 大鼠由第三军医大学动物中心提供; M199培养基购于GIBCO公司; PDGF-AA购于Sigma公司; PDGF-AA、 PDGF-α受体、 PDGF-β受体及PCNA抗体和辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗及硝酸纤维膜购于Santa公司; 化学发光试剂购于Gene公司; 氚-亮氨酸([3H]Leu)购于中国科学院上海核技术开发公司; 氚-胸腺嘧啶([3H]TdR)购于北京原子能科学研究院。
1.2 血管平滑肌细胞(VSMC)培养及鉴定[2]取20周龄雄性SHR、 WKY大鼠各10只, 尾动脉血压分别为29.3±1.07、 16.8±1.6 kPa, 无菌操作下取出胸主动脉, 按文献方法原代培养VSMC。用抗平滑肌细胞特异α -actin抗体免疫组化法鉴定VSMC。
1.3 PDGF-AA、 PDGF-α受体、 PDGF-β受体蛋白在WKY及SHR-VSMC中的表达第5代VSMC培养至80%融合状态, 换无血清培养基培养24 h, 提取蛋白并定量, 经聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40 μg总蛋白), 电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上, 封闭、 加I抗、 辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗, 化学发光试剂增强反应, X光片压片曝光, 凝胶成像系统分析结果, 设对照并重复3次。
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1.4 PDGF-AA对SHR和WKY大鼠VSMC增殖核抗原(PCNA)表达的影响第5代VSMC培养至80%融合状态, 换无血清培养基培养24 h, 分别加入不同浓度(ng/ml) PDGF-AA(2、 5、 10、 20)剌激VSMC 24 h后, 提取蛋白并定量, 方法同1.3。
1.5 PDGF-AA对SHR和WKY大鼠VSMC蛋白及核酸合成的影响[3H]Leu及[3H]TdR掺入量的测定按参考文献[5]的方法进行。用放射性同位素[3H]Leu掺入量反映平滑肌细胞蛋白质合成速率, 用放射性同位素[3H]TdR掺入量反映平滑肌细胞核酸合成速率。
1.6 统计分析每组数据为3个样本测定数值的平均值, 结果以均值±标准差表示。进行t检验和方差分析, P<0.01为差异显著。
2结果
2.1 PDGF-AA、 PDGF-α受体、 PDGF-β受体蛋白在大鼠VSMC中的表达
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VSMC中PDGF-AA蛋白及PDGF-α受体表达在SHR明显高于WKY, P<0.01; PDGF-β受体蛋白表达在SHR与WKY组无明显差异。
2.3 PDGF-AA对SHR/WKY大鼠VSMC蛋白及核酸合成的影响
在不同浓度PDGF-AA刺激下, SHR-VSMC中[3H]Leu、 [3H]TdR掺入率呈剂量依赖性增高(P<0.01＝, 而PDGF-AA对WKY-VSMC [3H]掺入率无明显影响。
3讨论
许多研究证实高血压阻力血管结构变化与VSMC增生和肥大有关[3～5]。VSMC结构的变化及血管壁肥厚在不同类型的高血压表现都较为相似, 即通过VSMC生长和血管壁“重塑”(remodeling)共同作用的结果。高血压血管重塑的机制十分复杂, 遗传、 血液动力学、 血管活性物质和神经体液等因素共同参与重塑过程。
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以往的研究大多数都集中在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管重塑的影响, 而对生长因子如PDGF的作用研究较少。Parker [6, 7] 等人在AngⅡ刺激WKY大鼠高血压模型中发现: 皮下注射AngⅡ[200 ng/(kg·min)]2周, 大鼠血压持续升高, 主动脉壁/径比例增加, PDGF-A基因表达上调, PDGF-A蛋白及PCNA生成增加, 大鼠血压升高和动脉壁的肥厚与PDGF-A链的表达密切相关, 而应用AngⅡ受体(AT1)拮抗剂losartan [20 mg/(kg·d)]并不能阻断高血压大鼠动脉壁的肥厚以及PDGF-A链的高表达。本研究发现: PDGF-A链及其α受体表达在SHR和WKY-VSMC具有显著差异, 在WKY大鼠, PDGF-α受体仅有微量表达, PDGF-A链表达也明显低于SHR-VSMC, 而PDGF-β受体在两种细胞中的表达却无明显差异, 这一结果提示: 这种自身PDGF-A链及其α受体的高表达, 可能在自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖肥大、 血管功能异常中具有重要作用。为证实PDGF-A链及其α受体对VSMC的作用, 我们进一步观察了PDGF-A链对SHR/WKY-VSMC增殖和肥大作用的差异性, 发现PDGF-AA明显促进SHR-VSMC的增殖、 肥大(即核酸和蛋白的合成增加), 而对WKY-VSMC的作用较弱。这些结果表明, 自发性高血压VSMC中PDGF-A链及其α受体自泌性表达增高, 可能是导致VSMC异常增殖、 肥大, 从而触发血管重构的重要原因之一。PDGF-β受体及与其特异结合的PDGF-B链可能在介导高血压血管重构过程中的作用并不显著。这些观察为我们进一步在临床上选择针对高血压血管结构功能异常进行基因治疗的靶点和进一步探讨PDGF-α受体介导的信号转导通路提供了实验依据。
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参考文献
[1]Heldin CH, Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev, 1999, 79(4):1283～1316.
[2]Inagami T, Kambayashi Y, Ichiki T, Tsuzuki S, Eguchi S, Yamakawa T. AngiotensinⅡ receptors AT1 and AT2:new mechanisms of signaling and antagonistic effects of AT1 and AT2. Jpn Circ J, 1997, 61: 807～813.
[3]Fischer JW, Davies MG, Wight TN. Versican is the predominant proteoglycan in flow accelerated neointimal hyperplasia of endothelialized baboon vascular grafts. Circulation, 1998, 98 (supplⅠ): Ⅰ-228.Abstract.
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[4]Nakayama M, Fukuda N, Watanabe Y, Soma M, Hu WY, Kishioka H, Satoh C, Kubo A, Kanmatsuse K. Low dose of eicosapentaenoic acid inhibits the exaggerated growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats through suppression of transforming growth factor-beta. J Hypertens, 1999, 17 (10):1421～1430.
[5]Sabri A, Levy BI, Poitevin P, Caputo L, Faggin E, Marootte F, Rappaport L, Samuel JL. Differential roles of AT1 and AT2 receptor subtypes in vascular trophic and phenotypic changes in response to stimulation with angiotensinⅡ. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997, 17: 257～264.
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[6]Parker SB, Dobrian AD, Wade SS, Prewitt RL. AT(1) receptor inhibition does not reduce arterial wall hypertrophy or PDGF-A expression in renal hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278 (2):H613～H622.
[7]Dobrian A, Wade SS, Prewitt RL. PDGF-A expression correlates with blood pressure and remodeling in 1K1C hypertensive rat arteries. Am J Physiol, 1999, 276 (6 Pt 2):H2159～H2167., 百拇医药