脂多糖通过诱导白细胞介素-1的生成引起迷走传入神经活动
1吉林大学基础医学部免疫学教研室；长春130021；2中国人民解放军白求恩国际和平医院；石家庄 050082 路秀英2；杨贵贞1*；孙辉臣2
关键词：迷走神经；c-Fos；结状神经节；白细胞介素-1( IL-1)；白细胞介素-1受体 (IL-1RⅠ)
摘要：为探讨脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起迷走传入神经活动是否可能通过白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)的作用, 将Wistar大鼠随机分为LPS实验组和生理盐水对照组, 用免疫组织化学方法检测迷走神经结状神经节c-Fos及CD14的表达以及腹腔迷走神经周围Mac-1阳性巨噬细胞(macrophage, Mφ)。用L929细胞增殖法检测LPS刺激Mφ上清IL-1的生物活性。用原位杂交的方法检测迷走神经结状神经节Ⅰ型白细胞介素-1受体(IL-1RⅠ)mRNA的表达。结果显示, LPS组迷走神经结状神经节神经元c-Fos蛋白表达为阳性, 而对照组迷走神经结状神经节神经元 c-Fos蛋白表达为阴性。LPS注射后1 h, 见腹腔迷走神经周围Mφ数量明显增多。Mφ在LPS刺激后45 min、 1 h和2 h时, IL-1生成明显增高。LPS组迷走神经结状神经节IL-1RⅠmRNA表达为阳性。以上结果提示, LPS引起迷走传入神经活动可能通过IL-1的作用。
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脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分, 进入机体可以作为非特异免疫刺激物质刺激免疫系统产生炎性细胞因子, 同时可以引起发热、厌食等中枢神经系统症状。给实验动物注入LPS后引起发热是研究免疫系统与神经系统信息交流的很好模型。 已有实验证实, LPS 可以通过迷走神经途径将外周LPS的信息传递到脑组织[1, 2], 但LPS的作用机制尚不清楚。迷走感觉神经元上是否有LPS受体, 以及LPS刺激白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)生成是否是其引起迷走神经活动的机制之一, 都尚未被证实, 本文就此进行了研究。
1材料和方法
1.1 主要试剂 LPS购自Sigma公司, 来自大肠杆菌(血清型055:B5, 批号122h4025)。 c-Fos, Mac-1抗体购自迈新公司。CD14 抗体由山东医学科学院孙汭老师惠赠。S-P试剂盒购自迈新公司。pBluscriptSK IL-1RI质粒由Charles J Sherr 博士惠赠。
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1.2 实验动物及分组雄性Wistar大鼠(250～300 g)由吉林大学实验动物部提供, 随机分为:(1) LPS组, 给予LPS 25 μg/kg (0.5 ml) i.p.; (2) 对照组: 给予生理盐水0.5 ml i.p.。 给药后1 h用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉, 用4%多聚甲醛左心室灌注固定。
1.3 免疫组织化学方法检测c-Fos蛋白的表达取迷走神经结状神经节, 常规进行固定、脱水、透明、包埋和切片。用S-P试剂盒进行免疫组织化学染色。一抗c-Fos抗体为兔抗大鼠多克隆抗体。每次染色均设有PBS代替一抗的阴性对照。
1.4免疫组织化学方法检测CD14蛋白的表达一抗用鼠抗人CD14单克隆抗体, 其它步骤同1.3。由于脑组织小胶质细胞CD14染色为阳性, 因此用大鼠脑组织切片作为阳性对照, 每次染色均设有阳性对照。
1.5免疫组织化学方法检测Mac-1阳性腹腔Mφ取腹腔迷走神经及其周围组织, 常规处理后用S-P试剂盒进行免疫组织化学染色。一抗为鼠抗大鼠Mac-1, 其它步骤同方法1.3。
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1.6 腹腔Mφ制备, LPS刺激及刺激上清IL-1检测大鼠腹腔注射2%淀粉1.5 ml后24 h杀鼠, 取腹腔Mφ, 用含5%小牛血清的IMDM将细胞稀释为1×107, 加入24孔板, 再加入LPS 200 ng/ml, 放入CO2孵箱中, 分别于不同时间取上清, -20℃保存待测。将生长状态良好的L929细胞稀释为2×105, 加入96孔细胞培养板, 每孔0.1 ml, 每孔加入10倍稀释的待测上清0.1 ml/孔, 一式三份, 用IMDM (5% FCS)作对照。于5% CO2, 37℃孵育48 h, 加入MTT (5 mg/ml) 10 μl, 继续孵育4 h, 加入甲溶解液(含50%二甲基甲酰胺, 20% SDS, pH 4.7), 混匀, 37 ℃放置4 h, 于酶标仪上测定OD570。IL-1测定重复三次。
1.7 原位杂交检测迷走神经结状神经节IL-1RⅠ mRNA表达将pBluscriptSK IL-1RI质粒用CaCl2方法转染DH5α细胞, 大量培养并用碱裂解的方法提取质粒, 经酶切、冻溶方法回收, 得到300～400 bp之间片段, 用地高辛标记试剂盒标记。经斑点杂交实验证明标记成功, 用于原位杂交实验。
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原位杂交过程: 石蜡切片常规经二甲苯和梯度酒精脱蜡入蒸馏水, 3% H2O2室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶。切片上滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶, 37℃消化20 min, 0.5 mol/L TBS 洗3次×5 min, 蒸馏水洗1次。然后预杂交：每张切片滴加20 μl预杂交液, 放在湿盒中, 恒温箱37 ℃预杂交2 h, 甩掉多余液体, 不洗, 直接进行下一步杂交： 每张切片滴加20 μl含地高辛标记探针杂交液, 盖上原位杂交专用盖玻片, 放在湿盒中, 恒温箱37℃杂交过夜。杂交后洗涤：去掉盖玻片, 37 ℃的2×SSC洗涤5 min×3次, 37 ℃的0.2×SSC洗涤5 min×1次。滴加封闭液, 室温20 min, 不洗。滴加兔抗地高辛抗体, 37 ℃ 60 min。TBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG, 37 ℃ 20 min, TBS洗2 min×3次。滴加SABC-POD： 37℃ 20 min, TBS洗5 min×4次。用DAB显色, 再用Mayer复染核, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。显微镜下观察并照相。
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1.8 统计学分实验结果以mean±SD表示, 用t检验进行组间比较。
2结果
2.1 LPS可刺激迷走神经结状神经节神经元表达c-Fos蛋白
对照组迷走神经结状神经节神经元 c-Fos蛋白表达为阴性, LPS组迷走神经结状神经节部分神经元 c-Fos蛋白表达为阳性, 表现为细胞核呈棕黄色, 胞浆未着色, 如图1 (Aa, Ab)所示。
2.2 LPS可提高腹腔迷走神经周围Mφ的数量
用Mac-1作为Mφ 的标志进行免疫组织化学染色, 腹腔注射生理盐水后1 h, 腹腔迷走神经周围偶见Mac-1+Mφ, 腹腔LPS注射后1 h, 见腹腔迷走神经周围Mφ数量明显增多。
2.3 LPS刺激后不同时间Mφ IL-1的生成
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Mφ在LPS刺激后30 min, 其上清中IL-1生物活性与培养基对照组相比无明显差异；45 min时IL-1生物活性增高, 与培养基对照组有显著差异(P<0.05)；60 和120 min时, IL-1生物活性明显增高, 与培养基对照组有极显著差异(P<0.01) 。
2.4 迷走神经结状神经节未见CD14表达
用免疫组织化学方法检测了迷走神经结状神经节神经元CD14蛋白的表达, 结果为生理盐水对照组和LPS实验组迷走神经结状神经节神经元CD14表达均为阴性。每次染色大鼠脑组织切片小胶质细胞CD14染色均为阳性。
2.5 LPS可刺激迷走神经结状神经节表达IL-1RⅠ mRNA
用原位杂交的方法检测了迷走神经结状神经节神经元在LPS腹腔给入1 h时IL-1RⅠ mRNA的表达, 结果如图1(Ca, Cb)所示, 部分神经元细胞在LPS腹腔给入1 h时, IL-1RⅠ mRNA的表达为阳性。
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3讨论
c-fos是一种原癌基因, 它作为一种有效的反映神经元对外界伤害性刺激发生反应的标志而被广泛应用于显示各种伤害性刺激引起反应的神经元[3]。本研究以c-Fos蛋白表达为指标, 检测了迷走感觉神经结状神经节神经元的活动情况。 实验观察到LPS组迷走感觉神经结状神经节部分神经元c-Fos表达阳性, 对照组c-Fos表达为阴性, 说明LPS腹腔注射能够引起迷走传入神经活动。
我们探讨了LPS使迷走神经活动的机制。 本研究观察了迷走神经结状神经节上LPS受体CD14的表达, 结果为阴性, 说明LPS不能直接作用于迷走神经感觉神经结状神经节上神经元而直接发挥作用, 可能通过诱导次级介质的产生。因为LPS对腹腔Mφ产生调节作用, 我们探讨了LPS刺激Mφ后IL-1生成及IL-1作为次级介质发挥作用的可能性。我们还观察了LPS作用后腹腔内Mφ的活性及迁移性的变化。体内实验观察到LPS作用后1 h腹腔迷走神经周围Mφ的数量明显增多, 体外实验观察到 LPS刺激Mφ 45 min即可明显介导IL-1的生成。 因此, LPS作用后使Mφ向迷走神经周围集聚, 并且诱导Mφ分泌IL-1增多, 由此推测LPS诱导IL-1生成可能是LPS介导迷走感觉神经元活动的机制之一。我们进一步检测到迷走神经结状神经节的感觉神经元有IL-1RⅠmRNA表达, 为IL-1与迷走神经的作用提供了形态学基础， 说明IL-1有作用于迷走神经的可能性。但是要得出明确的结论, 还需要进一步的实验来证实。对于LPS作用后迷走神经结状神经节神经元IL-1R I mRNA的表达, 国内外均未见报道, 但是有实验报道IL-1作用后迷走神经结状神经节神经元IL-1RⅠmRNA的表达[4]。
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参考文献
[1]Lu XL(路秀英),Yang GZ(杨贵贞). Subdiaphragmatic vagotomy reduce the responses of fever and c-Fos expression in rat PVN and NTS to LPS. Chin J Immunol (中国免疫学杂志), 2001, 17(4):25～28.
[2]Simons CT,Kulchitsky VA,Sugimoto N,Homer LD, Székely M, Romanovsky AA. Signaling the brain in systemic inflammation: which vagal branch is involved in fever genesis? Am J Physiol, 1998, 275(1 Pt 2): R63～R68.
[3]Harris JA. Using c-fos as a neural marker of pain. Brain Res Bull, 1998, 45(1):1～8.
[4]Monica EK, Micko K, Thomas C, Anders E. Activation of vagus afferents after intravenous injection of interleukin-1β: role of endogenous prostaglandins. J Neurosci, 1998,18(22):9471～9479., http://www.100md.com
关键词：迷走神经；c-Fos；结状神经节；白细胞介素-1( IL-1)；白细胞介素-1受体 (IL-1RⅠ)
摘要：为探讨脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起迷走传入神经活动是否可能通过白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)的作用, 将Wistar大鼠随机分为LPS实验组和生理盐水对照组, 用免疫组织化学方法检测迷走神经结状神经节c-Fos及CD14的表达以及腹腔迷走神经周围Mac-1阳性巨噬细胞(macrophage, Mφ)。用L929细胞增殖法检测LPS刺激Mφ上清IL-1的生物活性。用原位杂交的方法检测迷走神经结状神经节Ⅰ型白细胞介素-1受体(IL-1RⅠ)mRNA的表达。结果显示, LPS组迷走神经结状神经节神经元c-Fos蛋白表达为阳性, 而对照组迷走神经结状神经节神经元 c-Fos蛋白表达为阴性。LPS注射后1 h, 见腹腔迷走神经周围Mφ数量明显增多。Mφ在LPS刺激后45 min、 1 h和2 h时, IL-1生成明显增高。LPS组迷走神经结状神经节IL-1RⅠmRNA表达为阳性。以上结果提示, LPS引起迷走传入神经活动可能通过IL-1的作用。
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脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分, 进入机体可以作为非特异免疫刺激物质刺激免疫系统产生炎性细胞因子, 同时可以引起发热、厌食等中枢神经系统症状。给实验动物注入LPS后引起发热是研究免疫系统与神经系统信息交流的很好模型。 已有实验证实, LPS 可以通过迷走神经途径将外周LPS的信息传递到脑组织[1, 2], 但LPS的作用机制尚不清楚。迷走感觉神经元上是否有LPS受体, 以及LPS刺激白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)生成是否是其引起迷走神经活动的机制之一, 都尚未被证实, 本文就此进行了研究。
1材料和方法
1.1 主要试剂 LPS购自Sigma公司, 来自大肠杆菌(血清型055:B5, 批号122h4025)。 c-Fos, Mac-1抗体购自迈新公司。CD14 抗体由山东医学科学院孙汭老师惠赠。S-P试剂盒购自迈新公司。pBluscriptSK IL-1RI质粒由Charles J Sherr 博士惠赠。
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1.2 实验动物及分组雄性Wistar大鼠(250～300 g)由吉林大学实验动物部提供, 随机分为:(1) LPS组, 给予LPS 25 μg/kg (0.5 ml) i.p.; (2) 对照组: 给予生理盐水0.5 ml i.p.。 给药后1 h用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉, 用4%多聚甲醛左心室灌注固定。
1.3 免疫组织化学方法检测c-Fos蛋白的表达取迷走神经结状神经节, 常规进行固定、脱水、透明、包埋和切片。用S-P试剂盒进行免疫组织化学染色。一抗c-Fos抗体为兔抗大鼠多克隆抗体。每次染色均设有PBS代替一抗的阴性对照。
1.4免疫组织化学方法检测CD14蛋白的表达一抗用鼠抗人CD14单克隆抗体, 其它步骤同1.3。由于脑组织小胶质细胞CD14染色为阳性, 因此用大鼠脑组织切片作为阳性对照, 每次染色均设有阳性对照。
1.5免疫组织化学方法检测Mac-1阳性腹腔Mφ取腹腔迷走神经及其周围组织, 常规处理后用S-P试剂盒进行免疫组织化学染色。一抗为鼠抗大鼠Mac-1, 其它步骤同方法1.3。
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1.6 腹腔Mφ制备, LPS刺激及刺激上清IL-1检测大鼠腹腔注射2%淀粉1.5 ml后24 h杀鼠, 取腹腔Mφ, 用含5%小牛血清的IMDM将细胞稀释为1×107, 加入24孔板, 再加入LPS 200 ng/ml, 放入CO2孵箱中, 分别于不同时间取上清, -20℃保存待测。将生长状态良好的L929细胞稀释为2×105, 加入96孔细胞培养板, 每孔0.1 ml, 每孔加入10倍稀释的待测上清0.1 ml/孔, 一式三份, 用IMDM (5% FCS)作对照。于5% CO2, 37℃孵育48 h, 加入MTT (5 mg/ml) 10 μl, 继续孵育4 h, 加入甲溶解液(含50%二甲基甲酰胺, 20% SDS, pH 4.7), 混匀, 37 ℃放置4 h, 于酶标仪上测定OD570。IL-1测定重复三次。
1.7 原位杂交检测迷走神经结状神经节IL-1RⅠ mRNA表达将pBluscriptSK IL-1RI质粒用CaCl2方法转染DH5α细胞, 大量培养并用碱裂解的方法提取质粒, 经酶切、冻溶方法回收, 得到300～400 bp之间片段, 用地高辛标记试剂盒标记。经斑点杂交实验证明标记成功, 用于原位杂交实验。
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原位杂交过程: 石蜡切片常规经二甲苯和梯度酒精脱蜡入蒸馏水, 3% H2O2室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶。切片上滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶, 37℃消化20 min, 0.5 mol/L TBS 洗3次×5 min, 蒸馏水洗1次。然后预杂交：每张切片滴加20 μl预杂交液, 放在湿盒中, 恒温箱37 ℃预杂交2 h, 甩掉多余液体, 不洗, 直接进行下一步杂交： 每张切片滴加20 μl含地高辛标记探针杂交液, 盖上原位杂交专用盖玻片, 放在湿盒中, 恒温箱37℃杂交过夜。杂交后洗涤：去掉盖玻片, 37 ℃的2×SSC洗涤5 min×3次, 37 ℃的0.2×SSC洗涤5 min×1次。滴加封闭液, 室温20 min, 不洗。滴加兔抗地高辛抗体, 37 ℃ 60 min。TBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG, 37 ℃ 20 min, TBS洗2 min×3次。滴加SABC-POD： 37℃ 20 min, TBS洗5 min×4次。用DAB显色, 再用Mayer复染核, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。显微镜下观察并照相。
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1.8 统计学分实验结果以mean±SD表示, 用t检验进行组间比较。
2结果
2.1 LPS可刺激迷走神经结状神经节神经元表达c-Fos蛋白
对照组迷走神经结状神经节神经元 c-Fos蛋白表达为阴性, LPS组迷走神经结状神经节部分神经元 c-Fos蛋白表达为阳性, 表现为细胞核呈棕黄色, 胞浆未着色, 如图1 (Aa, Ab)所示。
2.2 LPS可提高腹腔迷走神经周围Mφ的数量
用Mac-1作为Mφ 的标志进行免疫组织化学染色, 腹腔注射生理盐水后1 h, 腹腔迷走神经周围偶见Mac-1+Mφ, 腹腔LPS注射后1 h, 见腹腔迷走神经周围Mφ数量明显增多。
2.3 LPS刺激后不同时间Mφ IL-1的生成
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Mφ在LPS刺激后30 min, 其上清中IL-1生物活性与培养基对照组相比无明显差异；45 min时IL-1生物活性增高, 与培养基对照组有显著差异(P<0.05)；60 和120 min时, IL-1生物活性明显增高, 与培养基对照组有极显著差异(P<0.01) 。
2.4 迷走神经结状神经节未见CD14表达
用免疫组织化学方法检测了迷走神经结状神经节神经元CD14蛋白的表达, 结果为生理盐水对照组和LPS实验组迷走神经结状神经节神经元CD14表达均为阴性。每次染色大鼠脑组织切片小胶质细胞CD14染色均为阳性。
2.5 LPS可刺激迷走神经结状神经节表达IL-1RⅠ mRNA
用原位杂交的方法检测了迷走神经结状神经节神经元在LPS腹腔给入1 h时IL-1RⅠ mRNA的表达, 结果如图1(Ca, Cb)所示, 部分神经元细胞在LPS腹腔给入1 h时, IL-1RⅠ mRNA的表达为阳性。
, 百拇医药
3讨论
c-fos是一种原癌基因, 它作为一种有效的反映神经元对外界伤害性刺激发生反应的标志而被广泛应用于显示各种伤害性刺激引起反应的神经元[3]。本研究以c-Fos蛋白表达为指标, 检测了迷走感觉神经结状神经节神经元的活动情况。 实验观察到LPS组迷走感觉神经结状神经节部分神经元c-Fos表达阳性, 对照组c-Fos表达为阴性, 说明LPS腹腔注射能够引起迷走传入神经活动。
我们探讨了LPS使迷走神经活动的机制。 本研究观察了迷走神经结状神经节上LPS受体CD14的表达, 结果为阴性, 说明LPS不能直接作用于迷走神经感觉神经结状神经节上神经元而直接发挥作用, 可能通过诱导次级介质的产生。因为LPS对腹腔Mφ产生调节作用, 我们探讨了LPS刺激Mφ后IL-1生成及IL-1作为次级介质发挥作用的可能性。我们还观察了LPS作用后腹腔内Mφ的活性及迁移性的变化。体内实验观察到LPS作用后1 h腹腔迷走神经周围Mφ的数量明显增多, 体外实验观察到 LPS刺激Mφ 45 min即可明显介导IL-1的生成。 因此, LPS作用后使Mφ向迷走神经周围集聚, 并且诱导Mφ分泌IL-1增多, 由此推测LPS诱导IL-1生成可能是LPS介导迷走感觉神经元活动的机制之一。我们进一步检测到迷走神经结状神经节的感觉神经元有IL-1RⅠmRNA表达, 为IL-1与迷走神经的作用提供了形态学基础， 说明IL-1有作用于迷走神经的可能性。但是要得出明确的结论, 还需要进一步的实验来证实。对于LPS作用后迷走神经结状神经节神经元IL-1R I mRNA的表达, 国内外均未见报道, 但是有实验报道IL-1作用后迷走神经结状神经节神经元IL-1RⅠmRNA的表达[4]。
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参考文献
[1]Lu XL(路秀英),Yang GZ(杨贵贞). Subdiaphragmatic vagotomy reduce the responses of fever and c-Fos expression in rat PVN and NTS to LPS. Chin J Immunol (中国免疫学杂志), 2001, 17(4):25～28.
[2]Simons CT,Kulchitsky VA,Sugimoto N,Homer LD, Székely M, Romanovsky AA. Signaling the brain in systemic inflammation: which vagal branch is involved in fever genesis? Am J Physiol, 1998, 275(1 Pt 2): R63～R68.
[3]Harris JA. Using c-fos as a neural marker of pain. Brain Res Bull, 1998, 45(1):1～8.
[4]Monica EK, Micko K, Thomas C, Anders E. Activation of vagus afferents after intravenous injection of interleukin-1β: role of endogenous prostaglandins. J Neurosci, 1998,18(22):9471～9479., http://www.100md.com