一氧化氮在大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤中的作用
华北煤炭医学院病理生理教研室；唐山 063000 杨秀红；张连元*；孙树勋；董淑云；门秀丽；景有伶；张一兵
关键词：一氧化氮；缺血；再灌注；成人呼吸窘迫综合症
摘要：在大鼠肢体缺血再灌注(LIR)损伤模型上, 观察应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂氨基胍(AG)及一氧化氮(NO)合成前体物质L-精氨酸(L-Arg)对大鼠骨骼肌和肺组织的NOS活性、 NO含量、 丙二醛(MDA)、 髓过氧化物酶(MPO)和湿/干重(W/D)值的影响以及肺磷脂酰胆碱(PC)的改变, 并观察了肺组织在光镜下形态学的变化。结果显示, 与对照组比较, LIR组骨骼肌和肺组织NOS活性均增强, MDA值、 MPO活性增加, W/D值增大, 肺PC含量降低; 光镜下, 肺间质多形核粒细胞(PMN)聚集和浸润, 肺间隔面密度值增加。给予AG后, 与LIR组相比NOS活性降低, NO产生下降, 而MPO活性、 W/D比值增加, 肺PC含量进一步降低; 镜下PMN聚集和浸润增加, 肺间隔面密度值增大。而给予 L-Arg 后能减轻LIR引起的上述变化。上述结果提示, LIR后2 h时, 骨骼肌和肺组织NOS活性增加, NO产生增多; 内源性NO可能在LIR所诱发的早期急性肺损伤中起保护作用。
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大量实验已证实, 肢体经过一段时间的缺血再灌注后可引起急性肺损伤(acute lung injury, ALI); 并有人用同位素标记等方法[1,2]研究表明, ALI时肺组织NOS活性明显增高并催化合成大量的NO。NO是一种强烈的扩血管物质, 具有舒张血管平滑肌、 抑制血小板和白细胞的活化和聚集等重要作用。NO和NOS在肢体缺血再灌注(LIR)后的ALI中起着极其重要的作用, 但目前关于NO在LIR后ALI中作用尚存争议。我们在LIR模型上, 采用氨基胍(AG)和 L-Arg 两种药物处理, 观察缺血4 h再灌注2 h后骨骼肌和肺组织丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、 湿/干重(W/D)、 NOS活性、 NO含量、 肺磷脂酰胆碱(PC)的改变以及形态学上的变化, 旨在探讨NO在LIR继发ALI中的作用。
1材料和方法
1.1 模型复制 按Rosenthal法[3]复制大鼠LIR模型, 用200~250 g雄性Wistar大鼠(购自北京实验动物养殖厂), 术前禁食12 h, 自由饮水。 乙醚浅麻醉下以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部, 阻断血流4 h松解, 恢复血流后观察2 h。缺血期间, 用激光多普勒血流仪(LDF-3型， 南开大学)监测肢体血流情况。于松带前20 min向腹腔注入1%戍巴比妥钠溶液(0.4 ml/kg)麻醉, 左侧颈外静脉注入1000 U/kg肝素抗凝血, 右侧颈总动脉插管。 于松带后2 h自颈动脉放血处死大鼠, 速取后肢腓肠肌及右肺300 mg制成10%组织匀浆, 分别测MPO[4]、 NO、 NOS[5], 取左肺及股二头肌约300 mg测W/D值, 取右肺400 mg测PC[6,7]。取左肺尖及腓肠肌做组织学检查。
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1.2 动物分组 动物随机分为4组, 每组6例。(1)对照组: 不结扎后肢; (2)LIR组: 模型复制如上述; (3) LIR+AG组: 松带前15 min滴注AG(30 mg/kg); (4)LIR+L-Arg组: 松带前15 min滴注 L-Arg (150 mg/kg)。各组动物均经颈外静脉给药, 各药均溶于生理盐水(NS)(4 ml/kg)滴注。 LIR组仅滴注相同剂量的NS而不加任何药物治疗, 均60 min内滴完。
1.3 分光光度法测NOS 根据NOS催化L-Arg生成NO, NO与二价铁配合物形成有色物, 在540 nm波长处测其消光值, 以此了解NOS活性。试剂盒购自北京邦定泰克生物制剂公司, 用紫外吸收法测上清液蛋白含量, 计算各样品NOS活性。
1.4 组织NO水平测定 采用萘乙二胺与样品中硝酸盐和亚硝酸盐反应生成粉红色物质, 在分光光度计上530 nm处测样品的吸光度, 按试剂盒(军事医学科学院提供)说明操作, 以NO-2和NO-3离子浓度代表组织NO含量(μmol/L)。
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1.5 组织MDA的测定 采用自己配制的试剂硫代巴比妥酸比色法进行测定。
1.6 高效液相色谱法测肺PC 使用仪器: SY5000 LIQUID CHROMATOGRAPH (北京分析仪器厂), N2000色谱数据工作站 (浙江大学智能信息工程研究所)。色谱柱: Hypersil SiO2 4.0×300 mm, 粒径10 μm (大连依利特)。流动相由乙腈-甲醇-85%磷酸(85∶10∶1 V/V)组成, 混匀, 过滤(0.2 μm), 并脱气后使用。 流速为1.0 ml/min, 进样量10 μl, 以每克肺组织含PC量表示, 结果见表2。PC的出峰时间是2.95±0.02 min。
1.7 组织形态学观察 每组动物任取2只, 实验结束时, 取左上肺及腓肠肌经10%多聚甲醛固定, 备做光镜标本,并对切片进行图像分析(北京新航图像分析系统), 随机选择6个低倍视野(10×10)测其肺泡间隔面密度值, 以目标面积/统计场面积表示。
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1.8 试剂 L-Arg、 AG和PC标准品购自Sigma公司, 乙腈、 甲醇为美国Fisher公司色谱纯级产品, 磷酸为国产优级纯, 余为国产分析纯试剂。
1.9 统计学分析 数据用mean±SD表示, 用方差分析q检验统计处理。
2结果
2.1 各组动物骨骼肌生化检查结果
LIR组与对照组比较, NOS活性增强, 产生NO增多, MPO、 MDA、 W/D值明显升高(P<0.01)。 AG给药后, NOS活性明显降低(P<0.01), NO产生减少, 而组织MPO、 MDA、 W/D值却较LIR组升高(P<0.05), 组织损伤加重。滴注L-Arg后, NOS活性虽无明显变化(P>0.05), 但NO产生增多, MPO、 MDA、 W/D值降低, 减轻了组织损伤。
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2.2 各组动物肺组织生化检查结果
LIR组与对照组比较, NOS活性增强, 产生NO增多, MPO、 MDA、 W/D值明显升高(P<0.05和P<0.01), PC (出峰时间为2.998±0.02 min)含量降低(P<0.01)。 AG给药后, 与LIR组比较NOS活性明显降低(P<0.01), NO产生减少, 而组织MPO、 MDA、 W/D值升高(P<0.05), PC含量进一步降低, 组织损伤加重。用L-Arg 治疗后, 与LIR组比较NOS活性虽无明显变化(P>0.05), 但NO产生增多, MPO值、 MDA、 W/D值均降低, PC含量增加(P<0.05), 减轻了组织损伤。
2.3 组织形态学的变化
与对照组比较, LIR组肌纤维明显肿胀、 变性、 断裂, 间质内血管扩张充血, 血细胞粘附于血管壁。肺组织间质血管扩张充血, 中性粒细胞聚集和浸润, 肺间隔加宽, 未见透明膜形成。LIR+AG组病变加重, 而LIR+L-Arg 组病变减轻。各组肺间隔面密度值见图3。
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3讨论
我们的前期工作已证明了LIR后血管组织iNOS活性明显增高[8]。本实验观察到, 缺血再灌注后骨骼肌和肺组织NOS活性增加, NO生成增加, 与文献报道相符[1, 2] 。 同时观察到, 给予NOS抑制剂AG后, NOS活性降低, NO生成减少, 骨骼肌和肺的损伤却加重。 相反, 给予 L-Arg 治疗后, NOS活性虽无明显改变, 却能增加NO的产生, 而使骨骼肌和肺组织的损伤减轻, 结果提示内源性NO的增高在LIR后早期引起局部骨骼肌和远端肺的损伤中起保护作用。
目前有关研究NO在LIR后ALI中作用的报道较少见, 结果尚存争议, 其原因可能与ALI的阶段及所用药物种类、 剂量和作用时程等有关。NO的作用具有两面性, 适量时可通过降低血管的反应性维持器官的灌注、 抗血小板和白细胞聚集、 消除氧自由基抑制脂质过氧化、 改善微循环等而起代偿性的保护作用。NO生成过多时又可形成毒性更强的过氧亚硝基化合物, 与氧自由基协同加重组织的损伤。本研究观察了LIR后2 h时NO与各损伤指标的关系, 结果表明NO在LIR后早期对ALI起保护作用。随着再灌注时间的延长, NOS活性和NO的产生以及与ALI的关系有待进一步研究。目前多数学者认为LIR后ALI的机制实际上是全身炎症反应综合征(SIRS)在肺部的表现, 但参与炎症反应的细胞和因子很多, 何者为首要因素以及这些因素与NO的关系有待进一步研究。
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参考文献
[1]Pararajasingam R, Weight SC, Bell PR, Nicholson ML, Sayers RD. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2000,19(1):47~51.
[2]Tassiopoulos AK, Carlin RE, Gao Y, Pedoto A, Finck CM, Landas SK, Tice DG, Marx W, Hakim TS, McGraw DJ. Role of nitric oxide and tumor necrosis factor on lung injury caused by ischemia/reperfusion of the lower extremities. J Vasc Surg, 1997,26(4):647~656.
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[3]Rosenthal SM. Exprimental chemotherapy of burns and shock Ⅳ. Production of traumatic shock in mice. Public Health Rep, 1943, 58:1429~1433.
[4]Lefer AM, Johson G 3d, Ma XL, Tsao PS, Thomas GR. Cardioprotective and endothelial protective effects of [Ala-IL-8] 77 in a rabbit model of myocardial ischemia and reperfusion. Br J Pharmacol, 1991, 103(1):1153~1159.
[5]Knowles RG, Salter M, Brooks SL, Moncada S. Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the induction by endotoxin of nitric oxide synthase in the lung, liver and aorta of the rat. Biochem Biophys Res Commun, 1995,172:1042~1048.
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[6]Folch J, Lees M, Stanley GHS. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animals tissues. J Biol Chem, 1957,226:497.
[7]Wang FJ (王风君), Zhao Y (赵 云), Xie EF (谢尔凡), You ZY (尤忠义). The determination of phospholipid in biological samples by HPLC. Acta Acad Med Mili Tert (第三军医大学学报), 1996,18(1):67~68.
[8]Zhang LY(张连元), Dong SY(董淑云), Yang J(杨 军), Tang J(汤 健), Su JY(苏静怡), Tang CS(唐朝枢). Effect of NO-like relaxing factor(NO-LRF) in rat tourniquet shock. Acta Physiol Sin (生理学报),1992,44(6):576~582., 百拇医药
关键词：一氧化氮；缺血；再灌注；成人呼吸窘迫综合症
摘要：在大鼠肢体缺血再灌注(LIR)损伤模型上, 观察应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂氨基胍(AG)及一氧化氮(NO)合成前体物质L-精氨酸(L-Arg)对大鼠骨骼肌和肺组织的NOS活性、 NO含量、 丙二醛(MDA)、 髓过氧化物酶(MPO)和湿/干重(W/D)值的影响以及肺磷脂酰胆碱(PC)的改变, 并观察了肺组织在光镜下形态学的变化。结果显示, 与对照组比较, LIR组骨骼肌和肺组织NOS活性均增强, MDA值、 MPO活性增加, W/D值增大, 肺PC含量降低; 光镜下, 肺间质多形核粒细胞(PMN)聚集和浸润, 肺间隔面密度值增加。给予AG后, 与LIR组相比NOS活性降低, NO产生下降, 而MPO活性、 W/D比值增加, 肺PC含量进一步降低; 镜下PMN聚集和浸润增加, 肺间隔面密度值增大。而给予 L-Arg 后能减轻LIR引起的上述变化。上述结果提示, LIR后2 h时, 骨骼肌和肺组织NOS活性增加, NO产生增多; 内源性NO可能在LIR所诱发的早期急性肺损伤中起保护作用。
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大量实验已证实, 肢体经过一段时间的缺血再灌注后可引起急性肺损伤(acute lung injury, ALI); 并有人用同位素标记等方法[1,2]研究表明, ALI时肺组织NOS活性明显增高并催化合成大量的NO。NO是一种强烈的扩血管物质, 具有舒张血管平滑肌、 抑制血小板和白细胞的活化和聚集等重要作用。NO和NOS在肢体缺血再灌注(LIR)后的ALI中起着极其重要的作用, 但目前关于NO在LIR后ALI中作用尚存争议。我们在LIR模型上, 采用氨基胍(AG)和 L-Arg 两种药物处理, 观察缺血4 h再灌注2 h后骨骼肌和肺组织丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、 湿/干重(W/D)、 NOS活性、 NO含量、 肺磷脂酰胆碱(PC)的改变以及形态学上的变化, 旨在探讨NO在LIR继发ALI中的作用。
1材料和方法
1.1 模型复制 按Rosenthal法[3]复制大鼠LIR模型, 用200~250 g雄性Wistar大鼠(购自北京实验动物养殖厂), 术前禁食12 h, 自由饮水。 乙醚浅麻醉下以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部, 阻断血流4 h松解, 恢复血流后观察2 h。缺血期间, 用激光多普勒血流仪(LDF-3型， 南开大学)监测肢体血流情况。于松带前20 min向腹腔注入1%戍巴比妥钠溶液(0.4 ml/kg)麻醉, 左侧颈外静脉注入1000 U/kg肝素抗凝血, 右侧颈总动脉插管。 于松带后2 h自颈动脉放血处死大鼠, 速取后肢腓肠肌及右肺300 mg制成10%组织匀浆, 分别测MPO[4]、 NO、 NOS[5], 取左肺及股二头肌约300 mg测W/D值, 取右肺400 mg测PC[6,7]。取左肺尖及腓肠肌做组织学检查。
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1.2 动物分组 动物随机分为4组, 每组6例。(1)对照组: 不结扎后肢; (2)LIR组: 模型复制如上述; (3) LIR+AG组: 松带前15 min滴注AG(30 mg/kg); (4)LIR+L-Arg组: 松带前15 min滴注 L-Arg (150 mg/kg)。各组动物均经颈外静脉给药, 各药均溶于生理盐水(NS)(4 ml/kg)滴注。 LIR组仅滴注相同剂量的NS而不加任何药物治疗, 均60 min内滴完。
1.3 分光光度法测NOS 根据NOS催化L-Arg生成NO, NO与二价铁配合物形成有色物, 在540 nm波长处测其消光值, 以此了解NOS活性。试剂盒购自北京邦定泰克生物制剂公司, 用紫外吸收法测上清液蛋白含量, 计算各样品NOS活性。
1.4 组织NO水平测定 采用萘乙二胺与样品中硝酸盐和亚硝酸盐反应生成粉红色物质, 在分光光度计上530 nm处测样品的吸光度, 按试剂盒(军事医学科学院提供)说明操作, 以NO-2和NO-3离子浓度代表组织NO含量(μmol/L)。
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1.5 组织MDA的测定 采用自己配制的试剂硫代巴比妥酸比色法进行测定。
1.6 高效液相色谱法测肺PC 使用仪器: SY5000 LIQUID CHROMATOGRAPH (北京分析仪器厂), N2000色谱数据工作站 (浙江大学智能信息工程研究所)。色谱柱: Hypersil SiO2 4.0×300 mm, 粒径10 μm (大连依利特)。流动相由乙腈-甲醇-85%磷酸(85∶10∶1 V/V)组成, 混匀, 过滤(0.2 μm), 并脱气后使用。 流速为1.0 ml/min, 进样量10 μl, 以每克肺组织含PC量表示, 结果见表2。PC的出峰时间是2.95±0.02 min。
1.7 组织形态学观察 每组动物任取2只, 实验结束时, 取左上肺及腓肠肌经10%多聚甲醛固定, 备做光镜标本,并对切片进行图像分析(北京新航图像分析系统), 随机选择6个低倍视野(10×10)测其肺泡间隔面密度值, 以目标面积/统计场面积表示。
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1.8 试剂 L-Arg、 AG和PC标准品购自Sigma公司, 乙腈、 甲醇为美国Fisher公司色谱纯级产品, 磷酸为国产优级纯, 余为国产分析纯试剂。
1.9 统计学分析 数据用mean±SD表示, 用方差分析q检验统计处理。
2结果
2.1 各组动物骨骼肌生化检查结果
LIR组与对照组比较, NOS活性增强, 产生NO增多, MPO、 MDA、 W/D值明显升高(P<0.01)。 AG给药后, NOS活性明显降低(P<0.01), NO产生减少, 而组织MPO、 MDA、 W/D值却较LIR组升高(P<0.05), 组织损伤加重。滴注L-Arg后, NOS活性虽无明显变化(P>0.05), 但NO产生增多, MPO、 MDA、 W/D值降低, 减轻了组织损伤。
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2.2 各组动物肺组织生化检查结果
LIR组与对照组比较, NOS活性增强, 产生NO增多, MPO、 MDA、 W/D值明显升高(P<0.05和P<0.01), PC (出峰时间为2.998±0.02 min)含量降低(P<0.01)。 AG给药后, 与LIR组比较NOS活性明显降低(P<0.01), NO产生减少, 而组织MPO、 MDA、 W/D值升高(P<0.05), PC含量进一步降低, 组织损伤加重。用L-Arg 治疗后, 与LIR组比较NOS活性虽无明显变化(P>0.05), 但NO产生增多, MPO值、 MDA、 W/D值均降低, PC含量增加(P<0.05), 减轻了组织损伤。
2.3 组织形态学的变化
与对照组比较, LIR组肌纤维明显肿胀、 变性、 断裂, 间质内血管扩张充血, 血细胞粘附于血管壁。肺组织间质血管扩张充血, 中性粒细胞聚集和浸润, 肺间隔加宽, 未见透明膜形成。LIR+AG组病变加重, 而LIR+L-Arg 组病变减轻。各组肺间隔面密度值见图3。
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3讨论
我们的前期工作已证明了LIR后血管组织iNOS活性明显增高[8]。本实验观察到, 缺血再灌注后骨骼肌和肺组织NOS活性增加, NO生成增加, 与文献报道相符[1, 2] 。 同时观察到, 给予NOS抑制剂AG后, NOS活性降低, NO生成减少, 骨骼肌和肺的损伤却加重。 相反, 给予 L-Arg 治疗后, NOS活性虽无明显改变, 却能增加NO的产生, 而使骨骼肌和肺组织的损伤减轻, 结果提示内源性NO的增高在LIR后早期引起局部骨骼肌和远端肺的损伤中起保护作用。
目前有关研究NO在LIR后ALI中作用的报道较少见, 结果尚存争议, 其原因可能与ALI的阶段及所用药物种类、 剂量和作用时程等有关。NO的作用具有两面性, 适量时可通过降低血管的反应性维持器官的灌注、 抗血小板和白细胞聚集、 消除氧自由基抑制脂质过氧化、 改善微循环等而起代偿性的保护作用。NO生成过多时又可形成毒性更强的过氧亚硝基化合物, 与氧自由基协同加重组织的损伤。本研究观察了LIR后2 h时NO与各损伤指标的关系, 结果表明NO在LIR后早期对ALI起保护作用。随着再灌注时间的延长, NOS活性和NO的产生以及与ALI的关系有待进一步研究。目前多数学者认为LIR后ALI的机制实际上是全身炎症反应综合征(SIRS)在肺部的表现, 但参与炎症反应的细胞和因子很多, 何者为首要因素以及这些因素与NO的关系有待进一步研究。
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参考文献
[1]Pararajasingam R, Weight SC, Bell PR, Nicholson ML, Sayers RD. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2000,19(1):47~51.
[2]Tassiopoulos AK, Carlin RE, Gao Y, Pedoto A, Finck CM, Landas SK, Tice DG, Marx W, Hakim TS, McGraw DJ. Role of nitric oxide and tumor necrosis factor on lung injury caused by ischemia/reperfusion of the lower extremities. J Vasc Surg, 1997,26(4):647~656.
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[3]Rosenthal SM. Exprimental chemotherapy of burns and shock Ⅳ. Production of traumatic shock in mice. Public Health Rep, 1943, 58:1429~1433.
[4]Lefer AM, Johson G 3d, Ma XL, Tsao PS, Thomas GR. Cardioprotective and endothelial protective effects of [Ala-IL-8] 77 in a rabbit model of myocardial ischemia and reperfusion. Br J Pharmacol, 1991, 103(1):1153~1159.
[5]Knowles RG, Salter M, Brooks SL, Moncada S. Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the induction by endotoxin of nitric oxide synthase in the lung, liver and aorta of the rat. Biochem Biophys Res Commun, 1995,172:1042~1048.
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[6]Folch J, Lees M, Stanley GHS. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animals tissues. J Biol Chem, 1957,226:497.
[7]Wang FJ (王风君), Zhao Y (赵 云), Xie EF (谢尔凡), You ZY (尤忠义). The determination of phospholipid in biological samples by HPLC. Acta Acad Med Mili Tert (第三军医大学学报), 1996,18(1):67~68.
[8]Zhang LY(张连元), Dong SY(董淑云), Yang J(杨 军), Tang J(汤 健), Su JY(苏静怡), Tang CS(唐朝枢). Effect of NO-like relaxing factor(NO-LRF) in rat tourniquet shock. Acta Physiol Sin (生理学报),1992,44(6):576~582., 百拇医药