失血性休克引起大鼠肠系膜动脉平滑肌依钙K+通道活动改变
1第三军医大学大坪医院野战外科研究所；重庆 400042;2中国科学院上海生命科学研究院；上海生理研究所；上海 200031 开丽1*；胡德耀1；王中峰2；施玉墚2；刘良明1
关键词：失血性休克；血管对去甲肾上腺素的反应性；大电导钙激活钾通道；血管平滑肌细胞；肠系膜动脉
摘要：在由股动脉放血制备的失血性休克大鼠模型急性分离的肠系膜动脉平滑肌细胞上, 利用膜片箝单通道记录技术观察了血管平滑肌依钙K+通道(BKCa)的活动。发现在对去甲肾上腺素(NE)反应性增高的休克代偿期, BKCa的开放概率(Po)和单位电导都显著较正常动物的低, Po的改变主要是由通道的慢关闭时间常数(τcs) 增大引起关闭时间延长所致; 而处于对NE反应性降低的休克失代偿期, BKCa的Po和单位电导都高于正常动物, Po的变化也主要是τcs减小所致。
休克是多种因素引起的、涉及临床各科的一种危重病症。失血性休克也是战事和事故创伤死亡的主要原因之一。复杂的休克病理生理过程的表现之一, 是体循环血管功能状态随机体所处的病理时相而变化, 由早期对血管活性药物的反应性升高转变为晚期降低, 这也是休克由代偿期转化为失代偿期的标志之一。在失代偿期, 血管扩张、微循环功能紊乱、心输出量和血压进行性下降。研究失血性休克的病理过程和病理变化, 对休克血管反应性变化的机制的阐明, 对探讨休克血管反应性低下的发生机制, 以及对休克的救治, 尤其是对血管活性药物的选用, 有十分重要的意义。
, http://www.100md.com
已有研究表明, 休克后期出现血管反应性低下时, 缩血管的肾上腺素受体失敏, 包括受体数目下调、 亲和力下降、 耦联酶活性降低, 对[Ca2+]i敏感性下降, 以及一些体液因子, 如一氧化氮、 肿瘤坏死因子产生增多等[1,2]。此外, 近来与血管功能密切相关的膜离子通道的活动是否有变化亦引起人们关注。如已有报道认为, KATP阻断剂可以改善重症失血性休克的血管低反应性[3,4], 但未见直接观察失血性休克引起血管平滑肌离子通道活动改变的研究报道。本文以失血性休克为模型, 用膜片箝实验技术进行研究, 首次报告了血管平滑肌细胞大电导钙激活K+通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)在休克代偿期开放概率显著降低和失代偿期显著增大, 以及通道开放、 关闭时间常数的变化。
1材料和方法
1.1 失血性休克模型和血管反应性检测参照文献[2,3] 建立大鼠失血性休克模型。Wistar大鼠(中国科学院上海实验动物中心提供), 体重220～260 g, 18只, 雄性。13.3%氨基甲酸乙酯和0.5%氯醛糖 (0.6 ml/100 g 体重)肌肉注射麻醉后, 双侧股动脉插管, 其中一侧股动脉接血压计, 观察平均动脉血压; 另一侧放血, 复制失血性休克模型。单侧股静脉插管供给药用。实验分为失血性休克组(n=12)和对照组(n=6)。休克组动物动脉放血至平均动脉压为3.99～4.25 kPa左右, 维持3 h, 并于放血后0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3 h静脉注射NE (6 μg/kg), 利用其引起的动脉血压的变化, 检测血管反应性水平; 对照组动物除不放血外, 其它处理同失血性休克组。
, http://www.100md.com
1.2 肠系膜动脉血管平滑肌细胞分离参照文献[5], 稍加修改, 分别在休克血管反应性不同的时期, 对NE反应性增高的代偿期(0.5 h左右)和其后反应性降低的失代偿期(1 h以后), 开腹取出大鼠肠系膜动脉, 置于细胞分离液中(组成mmol/L: NaCl 145、 KCl 6、 葡萄糖10、 HEPES 10, pH 7.3, 充以100% O2)。在解剖显微镜下, 仔细清除血管周围组织, 分离出2～3级血管分支(直径小于300 μm), 在36℃下, 于分离液中孵育15 min后, 移入含0.3% 胶原酶和1 mmol/L DTT的细胞分离液中, 消化45～50 min。然后用细胞分离液冲洗标本2～3次, 将组织稍加剪碎后, 用尖端火抛光的Pasteur管轻柔吹打分散细胞, 加入0.2% BSA、 1 mmol/L MgCl2, 细胞悬液置于4℃冰箱内备用。
1.3 钙激活钾通道单通道记录将细胞悬液滴加在事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上使细胞贴壁。用inside-out膜片箝单通道记录技术记录BKCa 通道电流[6]。玻璃微电极由拉制器(PP-83, Narishige, Japan)两步法拉制, 电极尖端涂以N-trimethylsily~diethylamine, 经热抛光, 冲灌电极液后电阻为6～8 MΩ。通道电流经膜片箝放大器(Axopatch 200A, Burlingame, CA, USA)放大, 用pClamp软件(6.0.4, Axon Instruments, USA)的Fetchex程序采样,并存入计算机作进一步分析。放大器低通滤波1 kHz, 采样频率20 kHz。inside-out膜片胞内面浴液组成(mmol/L): KCl 140、 CaCl2 2.86、 HEPES 10、 EGTA 3, pH 7.3, 游离钙浓度为1 μmol/L。电极液组成(mmol/L): KCl 140、 CaCl2 1.48、 HEPES 10、 EGTA 3, pH 7.3。通道记录共用动物49只, 随机分为对照组(n=12)、休克40 min组(n=14)和休克3 h组(n=23)。每只动物记录1～2个膜片数据用于统计处理。
, http://www.100md.com
数据用pClamp软件分析处理; 由高斯曲线拟合通道电流幅度; 用指数曲线拟合通道开关时间分布, 求出通道平均开放和平均关闭时间以及通道的开放概率。结果以mean±SD表示。用t检验进行统计学处理, 以P<0.05为有显著性差异。
1.4 主要试剂去甲肾上腺素(norepinephrine, NE, Serva)、 胶原酶(typeⅠ, Sigma)、 二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT, Serva)、 小牛血清白蛋白(BSA, B.M)、多聚赖氨酸(Sigma)、 四乙胺(tetraethylammonium, TEA, Sigma)。
2结果
2.1 失血性休克血管反应性变化的两个时相
已有资料表明, 在失血性休克病理过程中, 作为体循环阻力的血管的功能状态随病程而改变。血管平滑肌对缩血管药物引起的机体血压升高效应有早期的反应性升高和晚期降低的双相变化, 它们分别相当于休克代偿期和失代偿期。为探索失血性休克动物血管平滑肌BKCa活动与血管反应性变化的关系, 我们首先以血压变化为指标, 测试了失血性休克引起的血管平滑肌对缩血管药NE (6 μg/kg)反应性的变化(图1)。结果表明, 每一次静脉注射NE引起正常大鼠血压升高3.38±0.22 kPa, 在整个实验观察的3 h内, 每30 min测试一次, 引起的血压升高都在这个水平, 无明显差异(P>0.05)。
, http://www.100md.com
在失血性休克动物, 同样注射NE引起的升压效应则显著不同。从图1的结果可以看出, 它的升压效应在失血性休克早期(约 0.5 h)显著高于正常动物, 可达5.53±0.76 kPa (P<0.01); 失血休克晚期(>1 h)则明显降低, 休克3 h时低至1.04±0.24 kPa, 与相应时间正常动物对照组的差别明显(P<0.01)。基于这个观察, 我们的下述研究将分别选用正常动物组、 失血休克40 min和3 h动物组的血管平滑肌标本, 比较它们BKCa活动的变化。
2. 2 失血性休克显著改变BKCa 的开放概率: 早期降低, 晚期升高
本工作在急性分离的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞“内面朝外”膜片记录的K+通道电流, 具有电压依赖性, 在胞内外对称140 mmol/L K+溶液系统中, 单通道电流幅度-维持电压关系为一直线, 平衡电位为0 mV, 单位电导315±13 pS, 通道活动随胞内[Ca2+]提高而增强, 可被胞内施加TEA (40 mmol/L)抑制, 具有BKCa的一般特性(n=17 膜片)[7]。
, 百拇医药
研究表明, 与正常动物组相比, 失血性休克40 min动物的BKCa活动显著降低, 通道的平均开放时间缩短 (n=19膜片); 而失血休克 3 h 动物的活动则明显增强, 通道平均开放时间增加(n=29膜片)。
分析显示, 失血性休克40 min组动物BKCa的开放概率(Po)明显低于正常动物组, 以维持电压+80 mV为例, Po由正常动物的0.303±0.052 (n=17膜片)降低至0.206±0.060 (n=19膜片)(P<0.01)。而失血休克3 h组动物BKCa的Po 则显著较正常动物组的高, 同样在维持电压+80 mV的数据为0.521±0.167 (n=29 膜片) (P<0.01), 相应结果示于。分析还表明, 失血休克后BKCa开放频率也有与Po相似的变化时程，这提示失血休克可能不影响BKCa 的开放时间常数。
2.3 Po 的变化主要是BKCa慢关闭时间常数改变
, http://www.100md.com 对由统计通道开放存活时间建立的直方图进行指数拟合, 可以得到BKCa的开放或关闭的时间常数。结果表明, 大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa开放和关闭均有快、 慢两个时间常数。从表1的结果可以看到, 与上节的推测相符, 失血休克组无论早期或晚期, 快、 慢开放时间常数(τof 和τos)与正常动物均无明显差异; 快关闭时间常数(τcf) 亦无有意义变化, 唯慢关闭时间常数(τcs)在失血休克40 min组明显增大, 在失血休克3 h组明显减小(两者均P<0.05)。这表明, 失血休克引起的Po 变化, 主要是通道慢关闭时间常数的改变。
2.4 单位电导亦有相应变化
由图3C的结果可以看到, 失血休克也可引起BKCa振幅相似的变化: 早期减小, 晚期增大。由此推算出的单位电导在失血休克40 min组为280±16 pS, 与正常动物组(315±13 pS)相比显著减小(P<0.05); 而失血休克3 h组(375±20 pS)则高于正常动物组(P<0.05)。
, http://www.100md.com
3讨论
血管平滑肌BKCa主要参与细胞膜复极化, 限制细胞兴奋频率, 调节血管基础张力等。在一些病理状况下, 如由腺苷、 乳酸、 一氧化氮、 低氧和内毒素等引起的动物脑动脉、 软脑膜动脉、 冠状动脉或提睾肌动脉扩张伴有BKCa活动增强[8～12]; 低氧引起的肺动脉收缩与BKCa抑制和电压门控钾通道α亚单位基因表达抑制有关[13,14]。但是, 在失血性休克, 血管平滑肌细胞BKCa的变化则未见报道。本文采用膜片箝单通道记录技术, 在大鼠失血性休克急性分离的肠系膜动脉平滑肌细胞与机体对NE的反应做平行观察时, 发现在血管对NE反应性升高的休克代偿期, BKCa的开放概率减少, 电导值降低, 而在血管反应性由高转低的失代偿期, BKCa开放概率增加, 电导值增大。分析表明, Po 的这种变化分别是通道慢关闭时间常数改变的结果。顺便指出, 失代偿期BKCa的这种变化与由内毒素引起的脑血管平滑肌舒张和BKCa 激活相似[8,9]。
对休克血管平滑肌细胞BKCa的这种变化与休克血管反应性变化之间的内在联系, 本文提供的资料尚不能给予确切的说明, 但我们知道, 包括BKCa在内的钾通道开放, 可使细胞内钾外流, 膜趋超极化, 从而减少钙离子内流, 减小平滑肌收缩。休克早期的BKCa 抑制将提高膜的兴奋性, 增加血管反应性。休克失代偿期表现的血管反应性低下, 则可能主要归咎于细胞对[Ca2+]i敏感性降低[15,16], 此时[Ca2+]i处于超载水平。由此, BKCa阻断剂和增加细胞兴奋收缩系统对胞内Ca2+ 敏感性的钙增敏剂, 可能成为一个探索改善休克血管反应性低下的途径, 值得进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]Scott JA, Mc Cormack DG. Seletive in vivo inhibition of inducible nitric oxide synthase in rat model of sepsis. J Appl Physiol, 1999, 86:1739～1744.
[2]Zingarelli B, Squadrito F, Altavilla D. Role of tumor necrosis factor-α in acute hypovolemic hemorrhagic shock in rats. Am J Physiol, 1994, 266:H1512～H1515.
[3]Liu J (刘 杰), Zhao KS (赵克森). Role of calcium kinetic changes in vascular hyporeactivity during severe hemorrhagic shock. Chin J Traumatol (中华创伤杂志), 1997, 13:333～335 (in Chinese with English abstract).
, 百拇医药
[4]Szabo C, Salzman AL. Inhibition of ATP-activated potassium channels exerts pressor effect and improves survival in a rat model of severe hemorrhagic shock. Shock, 1996, 5:391～394.
[5]Ohya Y, Tsuchihashi T, Kagiyama S, et al. Single L-type calcium channels in smooth muscle cells from resistance arteries of spontaneously hypertensive rats. Hypertension, 1998, 31:1125～1129.
[6]Mang Y, Mathers DA. Ca2+-dependent K+ channels of high conductance in smooth muscle cells isolated from rat cerebral arteries. J Physiol(Lond), 1993, 462:529～545.
, 百拇医药
[7]Langton PD, Nelson MT, Huang Y, et al. Block of calcium-activated potassium channels in mammalian arterial myocytes by tetraethylammonium ions. Am J Physiol, 1991, 260:H927～H934.
[8]Hoang L, Mathers DA. Bacterial endotoxin alters kinetics of BK channels in rat cerebrovacular smooth muscle cells. Biochim Biophys Acta, 1998, 1369:335～345.
[9]Price JM, Baker CH, Bond RF. Calcium-activated potassium channel-mediated arteriolar relaxation during endotoxic shock. Shock, 1997, 7:294～299.
, http://www.100md.com
[10]Gebremedhin D, Bonnet P, Greene AS, et al. Hypoxia increases the activity of Ca2+-sensitive K+ channel in cat cerebral arterial muscle cell membranes. Pflugers Arch, 1994, 438:621～630.
[11]Mori K, Nakaya K, Sakamoto S, et al. Lactate-induced vascular relaxation in porcine coronary is mediated by Ca2+-activited K+ channels. J Mol Cell Cardiol, 1998, 30:349～356.
[12]Armstead WM. Role of activation of calcium-sensitive K+ channels in NO- and hypoxia-induced pial artery vasodilation. Am J Physiol, 1997, 272:H1785～H1790.
, http://www.100md.com
[13]Yuan XJ, William F, Goldman WF, Tod ML, et al. Hypoxia reduces potassium currents in cultured rat pulmonary but not mesenteric arterial myocytes. Am J Physiol, 1993, 264:L116～L123.
[14]Wang J, Juhaszova M, Rubin LJ, et al. Hypoxia inhibits gene expression of voltage-gated K+ channel alpha subunits in pulmonary artery smooth muscle cells. J Clin Invest, 1997, 100:2347～2353.
[15]Zhang L, Xiao D. Effect of chronic hypoxia on Ca2+ mobilization and Ca2+ sensitivity of myofilament in uterine arteries. Am J Physiol, 1998, 274:H132～H138.
, 百拇医药
[16]Mei JM, Hu DY, Chen HS, et al. Effect of MCI-254, a calcium sensitizer, on cardiac dysfunction in endotoxic shock in rabbits. Shock, 2000, 13:459～463.
Received 2000-10-26Accepted 2000-12-05
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39870829).
*Corresponding author. Tel: 021-64370080 ext 154; E-mail: zfwang@sunm.shcnc.ac.cn, 百拇医药
关键词：失血性休克；血管对去甲肾上腺素的反应性；大电导钙激活钾通道；血管平滑肌细胞；肠系膜动脉
摘要：在由股动脉放血制备的失血性休克大鼠模型急性分离的肠系膜动脉平滑肌细胞上, 利用膜片箝单通道记录技术观察了血管平滑肌依钙K+通道(BKCa)的活动。发现在对去甲肾上腺素(NE)反应性增高的休克代偿期, BKCa的开放概率(Po)和单位电导都显著较正常动物的低, Po的改变主要是由通道的慢关闭时间常数(τcs) 增大引起关闭时间延长所致; 而处于对NE反应性降低的休克失代偿期, BKCa的Po和单位电导都高于正常动物, Po的变化也主要是τcs减小所致。
休克是多种因素引起的、涉及临床各科的一种危重病症。失血性休克也是战事和事故创伤死亡的主要原因之一。复杂的休克病理生理过程的表现之一, 是体循环血管功能状态随机体所处的病理时相而变化, 由早期对血管活性药物的反应性升高转变为晚期降低, 这也是休克由代偿期转化为失代偿期的标志之一。在失代偿期, 血管扩张、微循环功能紊乱、心输出量和血压进行性下降。研究失血性休克的病理过程和病理变化, 对休克血管反应性变化的机制的阐明, 对探讨休克血管反应性低下的发生机制, 以及对休克的救治, 尤其是对血管活性药物的选用, 有十分重要的意义。
, http://www.100md.com
已有研究表明, 休克后期出现血管反应性低下时, 缩血管的肾上腺素受体失敏, 包括受体数目下调、 亲和力下降、 耦联酶活性降低, 对[Ca2+]i敏感性下降, 以及一些体液因子, 如一氧化氮、 肿瘤坏死因子产生增多等[1,2]。此外, 近来与血管功能密切相关的膜离子通道的活动是否有变化亦引起人们关注。如已有报道认为, KATP阻断剂可以改善重症失血性休克的血管低反应性[3,4], 但未见直接观察失血性休克引起血管平滑肌离子通道活动改变的研究报道。本文以失血性休克为模型, 用膜片箝实验技术进行研究, 首次报告了血管平滑肌细胞大电导钙激活K+通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)在休克代偿期开放概率显著降低和失代偿期显著增大, 以及通道开放、 关闭时间常数的变化。
1材料和方法
1.1 失血性休克模型和血管反应性检测参照文献[2,3] 建立大鼠失血性休克模型。Wistar大鼠(中国科学院上海实验动物中心提供), 体重220～260 g, 18只, 雄性。13.3%氨基甲酸乙酯和0.5%氯醛糖 (0.6 ml/100 g 体重)肌肉注射麻醉后, 双侧股动脉插管, 其中一侧股动脉接血压计, 观察平均动脉血压; 另一侧放血, 复制失血性休克模型。单侧股静脉插管供给药用。实验分为失血性休克组(n=12)和对照组(n=6)。休克组动物动脉放血至平均动脉压为3.99～4.25 kPa左右, 维持3 h, 并于放血后0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3 h静脉注射NE (6 μg/kg), 利用其引起的动脉血压的变化, 检测血管反应性水平; 对照组动物除不放血外, 其它处理同失血性休克组。
, http://www.100md.com
1.2 肠系膜动脉血管平滑肌细胞分离参照文献[5], 稍加修改, 分别在休克血管反应性不同的时期, 对NE反应性增高的代偿期(0.5 h左右)和其后反应性降低的失代偿期(1 h以后), 开腹取出大鼠肠系膜动脉, 置于细胞分离液中(组成mmol/L: NaCl 145、 KCl 6、 葡萄糖10、 HEPES 10, pH 7.3, 充以100% O2)。在解剖显微镜下, 仔细清除血管周围组织, 分离出2～3级血管分支(直径小于300 μm), 在36℃下, 于分离液中孵育15 min后, 移入含0.3% 胶原酶和1 mmol/L DTT的细胞分离液中, 消化45～50 min。然后用细胞分离液冲洗标本2～3次, 将组织稍加剪碎后, 用尖端火抛光的Pasteur管轻柔吹打分散细胞, 加入0.2% BSA、 1 mmol/L MgCl2, 细胞悬液置于4℃冰箱内备用。
1.3 钙激活钾通道单通道记录将细胞悬液滴加在事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上使细胞贴壁。用inside-out膜片箝单通道记录技术记录BKCa 通道电流[6]。玻璃微电极由拉制器(PP-83, Narishige, Japan)两步法拉制, 电极尖端涂以N-trimethylsily~diethylamine, 经热抛光, 冲灌电极液后电阻为6～8 MΩ。通道电流经膜片箝放大器(Axopatch 200A, Burlingame, CA, USA)放大, 用pClamp软件(6.0.4, Axon Instruments, USA)的Fetchex程序采样,并存入计算机作进一步分析。放大器低通滤波1 kHz, 采样频率20 kHz。inside-out膜片胞内面浴液组成(mmol/L): KCl 140、 CaCl2 2.86、 HEPES 10、 EGTA 3, pH 7.3, 游离钙浓度为1 μmol/L。电极液组成(mmol/L): KCl 140、 CaCl2 1.48、 HEPES 10、 EGTA 3, pH 7.3。通道记录共用动物49只, 随机分为对照组(n=12)、休克40 min组(n=14)和休克3 h组(n=23)。每只动物记录1～2个膜片数据用于统计处理。
, http://www.100md.com
数据用pClamp软件分析处理; 由高斯曲线拟合通道电流幅度; 用指数曲线拟合通道开关时间分布, 求出通道平均开放和平均关闭时间以及通道的开放概率。结果以mean±SD表示。用t检验进行统计学处理, 以P<0.05为有显著性差异。
1.4 主要试剂去甲肾上腺素(norepinephrine, NE, Serva)、 胶原酶(typeⅠ, Sigma)、 二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT, Serva)、 小牛血清白蛋白(BSA, B.M)、多聚赖氨酸(Sigma)、 四乙胺(tetraethylammonium, TEA, Sigma)。
2结果
2.1 失血性休克血管反应性变化的两个时相
已有资料表明, 在失血性休克病理过程中, 作为体循环阻力的血管的功能状态随病程而改变。血管平滑肌对缩血管药物引起的机体血压升高效应有早期的反应性升高和晚期降低的双相变化, 它们分别相当于休克代偿期和失代偿期。为探索失血性休克动物血管平滑肌BKCa活动与血管反应性变化的关系, 我们首先以血压变化为指标, 测试了失血性休克引起的血管平滑肌对缩血管药NE (6 μg/kg)反应性的变化(图1)。结果表明, 每一次静脉注射NE引起正常大鼠血压升高3.38±0.22 kPa, 在整个实验观察的3 h内, 每30 min测试一次, 引起的血压升高都在这个水平, 无明显差异(P>0.05)。
, http://www.100md.com
在失血性休克动物, 同样注射NE引起的升压效应则显著不同。从图1的结果可以看出, 它的升压效应在失血性休克早期(约 0.5 h)显著高于正常动物, 可达5.53±0.76 kPa (P<0.01); 失血休克晚期(>1 h)则明显降低, 休克3 h时低至1.04±0.24 kPa, 与相应时间正常动物对照组的差别明显(P<0.01)。基于这个观察, 我们的下述研究将分别选用正常动物组、 失血休克40 min和3 h动物组的血管平滑肌标本, 比较它们BKCa活动的变化。
2. 2 失血性休克显著改变BKCa 的开放概率: 早期降低, 晚期升高
本工作在急性分离的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞“内面朝外”膜片记录的K+通道电流, 具有电压依赖性, 在胞内外对称140 mmol/L K+溶液系统中, 单通道电流幅度-维持电压关系为一直线, 平衡电位为0 mV, 单位电导315±13 pS, 通道活动随胞内[Ca2+]提高而增强, 可被胞内施加TEA (40 mmol/L)抑制, 具有BKCa的一般特性(n=17 膜片)[7]。
, 百拇医药
研究表明, 与正常动物组相比, 失血性休克40 min动物的BKCa活动显著降低, 通道的平均开放时间缩短 (n=19膜片); 而失血休克 3 h 动物的活动则明显增强, 通道平均开放时间增加(n=29膜片)。
分析显示, 失血性休克40 min组动物BKCa的开放概率(Po)明显低于正常动物组, 以维持电压+80 mV为例, Po由正常动物的0.303±0.052 (n=17膜片)降低至0.206±0.060 (n=19膜片)(P<0.01)。而失血休克3 h组动物BKCa的Po 则显著较正常动物组的高, 同样在维持电压+80 mV的数据为0.521±0.167 (n=29 膜片) (P<0.01), 相应结果示于。分析还表明, 失血休克后BKCa开放频率也有与Po相似的变化时程，这提示失血休克可能不影响BKCa 的开放时间常数。
2.3 Po 的变化主要是BKCa慢关闭时间常数改变
, http://www.100md.com 对由统计通道开放存活时间建立的直方图进行指数拟合, 可以得到BKCa的开放或关闭的时间常数。结果表明, 大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa开放和关闭均有快、 慢两个时间常数。从表1的结果可以看到, 与上节的推测相符, 失血休克组无论早期或晚期, 快、 慢开放时间常数(τof 和τos)与正常动物均无明显差异; 快关闭时间常数(τcf) 亦无有意义变化, 唯慢关闭时间常数(τcs)在失血休克40 min组明显增大, 在失血休克3 h组明显减小(两者均P<0.05)。这表明, 失血休克引起的Po 变化, 主要是通道慢关闭时间常数的改变。
2.4 单位电导亦有相应变化
由图3C的结果可以看到, 失血休克也可引起BKCa振幅相似的变化: 早期减小, 晚期增大。由此推算出的单位电导在失血休克40 min组为280±16 pS, 与正常动物组(315±13 pS)相比显著减小(P<0.05); 而失血休克3 h组(375±20 pS)则高于正常动物组(P<0.05)。
, http://www.100md.com
3讨论
血管平滑肌BKCa主要参与细胞膜复极化, 限制细胞兴奋频率, 调节血管基础张力等。在一些病理状况下, 如由腺苷、 乳酸、 一氧化氮、 低氧和内毒素等引起的动物脑动脉、 软脑膜动脉、 冠状动脉或提睾肌动脉扩张伴有BKCa活动增强[8～12]; 低氧引起的肺动脉收缩与BKCa抑制和电压门控钾通道α亚单位基因表达抑制有关[13,14]。但是, 在失血性休克, 血管平滑肌细胞BKCa的变化则未见报道。本文采用膜片箝单通道记录技术, 在大鼠失血性休克急性分离的肠系膜动脉平滑肌细胞与机体对NE的反应做平行观察时, 发现在血管对NE反应性升高的休克代偿期, BKCa的开放概率减少, 电导值降低, 而在血管反应性由高转低的失代偿期, BKCa开放概率增加, 电导值增大。分析表明, Po 的这种变化分别是通道慢关闭时间常数改变的结果。顺便指出, 失代偿期BKCa的这种变化与由内毒素引起的脑血管平滑肌舒张和BKCa 激活相似[8,9]。
对休克血管平滑肌细胞BKCa的这种变化与休克血管反应性变化之间的内在联系, 本文提供的资料尚不能给予确切的说明, 但我们知道, 包括BKCa在内的钾通道开放, 可使细胞内钾外流, 膜趋超极化, 从而减少钙离子内流, 减小平滑肌收缩。休克早期的BKCa 抑制将提高膜的兴奋性, 增加血管反应性。休克失代偿期表现的血管反应性低下, 则可能主要归咎于细胞对[Ca2+]i敏感性降低[15,16], 此时[Ca2+]i处于超载水平。由此, BKCa阻断剂和增加细胞兴奋收缩系统对胞内Ca2+ 敏感性的钙增敏剂, 可能成为一个探索改善休克血管反应性低下的途径, 值得进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]Scott JA, Mc Cormack DG. Seletive in vivo inhibition of inducible nitric oxide synthase in rat model of sepsis. J Appl Physiol, 1999, 86:1739～1744.
[2]Zingarelli B, Squadrito F, Altavilla D. Role of tumor necrosis factor-α in acute hypovolemic hemorrhagic shock in rats. Am J Physiol, 1994, 266:H1512～H1515.
[3]Liu J (刘 杰), Zhao KS (赵克森). Role of calcium kinetic changes in vascular hyporeactivity during severe hemorrhagic shock. Chin J Traumatol (中华创伤杂志), 1997, 13:333～335 (in Chinese with English abstract).
, 百拇医药
[4]Szabo C, Salzman AL. Inhibition of ATP-activated potassium channels exerts pressor effect and improves survival in a rat model of severe hemorrhagic shock. Shock, 1996, 5:391～394.
[5]Ohya Y, Tsuchihashi T, Kagiyama S, et al. Single L-type calcium channels in smooth muscle cells from resistance arteries of spontaneously hypertensive rats. Hypertension, 1998, 31:1125～1129.
[6]Mang Y, Mathers DA. Ca2+-dependent K+ channels of high conductance in smooth muscle cells isolated from rat cerebral arteries. J Physiol(Lond), 1993, 462:529～545.
, 百拇医药
[7]Langton PD, Nelson MT, Huang Y, et al. Block of calcium-activated potassium channels in mammalian arterial myocytes by tetraethylammonium ions. Am J Physiol, 1991, 260:H927～H934.
[8]Hoang L, Mathers DA. Bacterial endotoxin alters kinetics of BK channels in rat cerebrovacular smooth muscle cells. Biochim Biophys Acta, 1998, 1369:335～345.
[9]Price JM, Baker CH, Bond RF. Calcium-activated potassium channel-mediated arteriolar relaxation during endotoxic shock. Shock, 1997, 7:294～299.
, http://www.100md.com
[10]Gebremedhin D, Bonnet P, Greene AS, et al. Hypoxia increases the activity of Ca2+-sensitive K+ channel in cat cerebral arterial muscle cell membranes. Pflugers Arch, 1994, 438:621～630.
[11]Mori K, Nakaya K, Sakamoto S, et al. Lactate-induced vascular relaxation in porcine coronary is mediated by Ca2+-activited K+ channels. J Mol Cell Cardiol, 1998, 30:349～356.
[12]Armstead WM. Role of activation of calcium-sensitive K+ channels in NO- and hypoxia-induced pial artery vasodilation. Am J Physiol, 1997, 272:H1785～H1790.
, http://www.100md.com
[13]Yuan XJ, William F, Goldman WF, Tod ML, et al. Hypoxia reduces potassium currents in cultured rat pulmonary but not mesenteric arterial myocytes. Am J Physiol, 1993, 264:L116～L123.
[14]Wang J, Juhaszova M, Rubin LJ, et al. Hypoxia inhibits gene expression of voltage-gated K+ channel alpha subunits in pulmonary artery smooth muscle cells. J Clin Invest, 1997, 100:2347～2353.
[15]Zhang L, Xiao D. Effect of chronic hypoxia on Ca2+ mobilization and Ca2+ sensitivity of myofilament in uterine arteries. Am J Physiol, 1998, 274:H132～H138.
, 百拇医药
[16]Mei JM, Hu DY, Chen HS, et al. Effect of MCI-254, a calcium sensitizer, on cardiac dysfunction in endotoxic shock in rabbits. Shock, 2000, 13:459～463.
Received 2000-10-26Accepted 2000-12-05
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39870829).
*Corresponding author. Tel: 021-64370080 ext 154; E-mail: zfwang@sunm.shcnc.ac.cn, 百拇医药