用差异显示PCR法筛选与血管外膜细胞表型转化相关的基因
上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所；上海 200025 孙爱军；高平进；刘建军；姬开达；朱鼎良
关键词：血管外膜；成纤维细胞；肌成纤维细胞；差异显示聚合酶链反应；反义技术
摘要：为筛选血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)与肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)间表型转化有关的基因, 实验建立了大鼠胸主动脉AF和MF两种细胞模型, 用差异显示聚合酶链反应(DDPCR)技术获得表达差异片段, 对差异片段进行克隆和测序分析, 并用定量PCR和Northern blot对差别显示结果进行验证。用反义核酸转染技术观察骨桥蛋白(osteopontin, OPN)对AF迁移的影响。 结果表明, 两种表型细胞存在明显的基因表达差异, 其中一个在MF下调的差异片段与GenBank 中NADH脱氢酶亚单位5 (NADH dehydrogenase subunit 5, Nd5)基因高度同源。另一个在MF上调的差异片段与OPN基因同源。上述差异表达结果被定量PCR及Northern blot证实。此外还有4个表达序列标志(expressed sequencetag, EST)在GenBank中未查到同源序列。反义OPN寡脱氧核苷酸可抑制AF的迁移活动。结果提示, AF转化为MF可能与ND5基因下调、 OPN上调及其它未知基因的表达改变有关。应用反义技术适度抑制OPN表达在防治血管重塑中具有重要作用。
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在球囊扩张等机械性损伤刺激下, 血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)被迅速激活, 并转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)。MF兼有AF及血管平滑肌细胞(VSMC)的双重功能特性, 它能产生细胞外基质(ECM)和多种生物活性因子, MF增殖并迁移至中膜及内膜, 从而在血管重塑中起重要作用[1]。我们曾报道在体外培养条件下用转化生长因子β1(TGFβ1) 诱导AF转化为MF[2], 为研究外膜细胞在血管重塑中的作用和机制提供了合适的细胞模型。近年来有关MF与血管重塑关系的报道日益增多, 但对AF转化为MF的分子机制尚不了解。本研究采用差异显示聚合酶链反应(DDPCR)技术, 筛选出与AF转化为MF有关的基因。
1材料和方法
1.1 AF及MF两种表型细胞的建立及鉴定采用贴片法获得并培养WKY大鼠胸主动脉外膜的AF细胞, 实验使用3～5代细胞[3]; 用TGFβ1 (20 ng/ml)处理静止状态的AF细胞24 h后获MF。采用免疫细胞化学技术及透射电镜对AF和MF进行细胞表型鉴定。WKY大鼠由上海市高血压研究所提供, TGFβ1购自Valbiotech 公司。
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1.2 总RNA提取及逆转录反应用Trizol试剂(Gibco公司)分别提取AF及MF两种细胞的总RNA量。各取0.2 μg RNA, 用Beckman公司差异显示试剂盒的3′末端12个锚定引物合成cDNA第一链。
1.3 差异显示PCR两种细胞的逆转录产物分别与试剂盒5′末端20个随机引物配对, 进行PCR扩增 (每一组实验选2个锚定引物与8个随机引物配对, 共32个反应)。反应总体积为10 μl, 内含1×buffer, 3.75 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNTP、 荧光锚定引物和随机引物各0.35 μmol/L、 1 μl 逆转录产物、 0.05 U/μl高保真Taq DNA聚合酶。反应程序: 95℃ 2 min, 1个循环; 92℃ 15 s、 50℃ 30 s、 72℃ 2 min, 4个循环; 92℃ 15 s、 60℃ 30 s、 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃延伸7 min, 4℃保存。
1.4 分离差异片段配制5.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶, 长61 cm, 宽33 cm。扩增产物加荧光染料变性处理后, 经Genomyx LR电泳仪上样及Genomyx SC荧光成像系统扫描仪(Beckman公司)获取图像, 显示差异片段。
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1.5 差异片段的回收及再扩增经割胶系统(Beckman公司)切割差异片段凝胶, 用T7及M13引物(Beckman公司)对差异片段再扩增, 然后用QIAquick Gel 抽提试剂盒(QIAGEN公司)纯化扩增产物。
1.6 再扩增产物的克隆及序列分析将纯化产物连接到pMD18T载体(Takara公司), 转染DH5α感受态细胞, 经平板筛选单克隆, 扩增后抽提质粒DNA, 然后酶切鉴定。用末端荧光标记法进行DNA序列分析。所获测序结果通过Blast软件与GenBank收录序列进行同源性比较。
1.7 定量PCR使用离心式定量PCR仪(Corbett 公司), 用SYBR Green荧光染料(Molecular Probes公司)标记双链DNA, 通过实时检测DNA扩增测定模板的拷贝数。引物合成根据差异片段的测序结果。NADH脱氢酶亚单位5 (NADH dehydrogenase subunit 5, Nd5)基因上游引物5′GGT~AA~GGG~CTA~GGC~TTCC~GA3′, 下游引物5′CCA~CCCC~CTAA~CCTC~AAA~CAA3′; 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)基因上游引物5′GCT~TG~GCT~TAT~GGA~CTG~AGGT3′, 下游引物5′AC~GAA~GTT~TCA~CAG~CCA~TGAG3′。将PCR反转录产物分别稀释104、 106、 108和1010倍, 用这些稀释产物制备标准曲线。PCR反应总体积20 μl, 含RT产物0.5 μl, 1×buffer, 0.25 mmol/L dNTP, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.06 U/μl Taq酶, 引物各0.25 μmol/L, 荧光染料2 μl。反应程序: 92℃ 15 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 35个循环。结果以mRNA拷贝数表达。
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1.8 Northern blot鉴定[4]取RNA 30 μg, 经1%琼脂糖变性电泳后, 用虹吸法将变性RNA转移至尼龙膜(Sigma公司)。以OPN、 ND5再扩增产物为探针, 用[α~32P]dCTP标记(Takara公司), 并纯化之(QIAGEN公司)。杂交, 常规洗膜, -70℃放射自显影。以图像分析仪(复日Smart View 2000)测定各杂交带光密度值与面积。
1.9 人工合成OPN寡脱氧核苷酸由德国Tech Dragon Limited公司合成硫代修饰的OPN寡脱氧核苷酸。OPN反义核酸序列为5′AA~CCAC~TGCC~AGTC~TCAT3′, 正义核酸序列为5′ATG~AGA~CTG~GCA~GTG~GTT3′, 错配义核酸序列为5′AA~CTA~CTAT~CAGT~CTC~GT3′。
1.10 转染核酸/脂质体基础上的细胞迁移实验采用AF接种Transwell (Corning公司)下室, 约70%～80%融合后, 去血清同步48 h, 以含1.5 μmol/L反义OPN/脂质体的DMEM培养液预处理8 h, 继以行TGFβ刺激。另设空白对照组, 单纯TGFβ刺激组, 正义、 错配义OPN/脂质体组。TGFβ刺激24 h后, 在Transwell上室滴加1×105 AF悬液, 37℃温箱孵育2 h后取出上室, 棉签拭去室内AF, 对室膜外滤膜上细胞用4%多聚甲醛固定、 染色。随机取5个视野(×200)计数取均值。
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2结果
2.1 细胞表型鉴定
免疫细胞化学, 经TGFβ1处理的细胞中, 平滑肌α肌动蛋白(αSMactin)表达阳性, 胞浆中见大量微肌丝; 而在未经TGFβ1处理的AF细胞, 则αSMactin表达呈阴性。 透射电镜, 经TGFβ1处理的细胞, 胞膜下有大量微肌丝形成, 且胞浆内见到丰富的内质网; 未经TGFβ1处理的AF细胞, 胞膜下几乎无微肌丝。
后显示, 插入片段与原测序胶的片段大小相似, 表明所有的差异片段均已克隆到载体中。
2.3 差异片段的序列分析
测序结果与GenBank已知DNA序列进行同源性比较, 其中一个在MF中下调的差异片段(800 bp), 其序列与ND5基因序列呈98%同源性。另一个在MF中上调差异片段(900 bp), 与OPN基因存在96%的同源性。此外, 4个表达序列标志(expressed sequencetag, EST) 在GenBank中未查到同源序列。把这些EST与dbEST库进行比较, 从中找出部分重叠的大鼠ESTs, 经Autoassembler软件将其组装成Contig序列, 然后通过DNA Strider软件对电子克隆结果进行分析, 发现这几个EST不存在完整的开放阅读框。
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2.4 定量PCR检测
ND5基因在AF中表达量为246.33±35.64, 在MF中表达量为86.66±10.96(n=3, P<0.01)。OPN在MF中表达量为1875.67±42.45, 在AF中表达量为211±53.39(n=3, P<0.01)。
2.5 Northern blot分析
ND5基因在AF中表达高于MF; OPN在MF中表达高于AF。
2.6.反义核酸对AF迁移活动的影响
反义核酸组AF迁移数目明显低于单纯TGFβ1刺激组(n=3, P<0.01)。正义核酸及错配义核酸组AF迁移数目与单纯TGFβ1刺激组比较无显著性差异。
3讨论
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多年来, 血管重塑的研究焦点都集中于血管内膜细胞及中膜VSMC。而晚近研究发现, 血管外膜细胞同样起作用, 特别是外膜AF在各种病理性损伤刺激下转化为MF, 后者增殖及迁移, 参与了血管新生内膜的形成, 在血管再狭窄等血管病变的发生和发展中起重要作用[5]。
MF是一种具有平滑肌细胞特征的成纤维细胞, 其特征性结构是胞浆内含平滑肌α肌动蛋白。MF主要由组织局部AF转型而来, 可产生ECM和多种因子, 在器官发育、 组织修复中起重要作用[6]。在众多的MF分化调控因子如PDGF、 GMCSF中, TGFβ被认为是MF表型的直接诱导因子, 因为它上调平滑肌α肌动蛋白的表达[7]。
本实验免疫细胞化学和透射电镜检查结果显示, AF细胞经TGFβ1刺激后, 细胞内出现平滑肌α肌动蛋白和大量微肌丝, 这些特征表明AF细胞已发生表型改变成为MF。在成功地建立血管的两种不同表型细胞模型的基础上, 我们从细胞表型转化这一功能入手, 分离和克隆与之有关的基因。
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1992年以来, 差别显示聚合酶链反应 (DDPCR) 技术已被广泛用于不同组织或细胞间基因表达谱的比较研究。作为一种差异表达基因的筛选技术, 它有快速、 有效的优点, 其产生的条带几乎可覆盖一个细胞所有基因的mRNA表达产物[8]。但在早期应用中, 该技术存在假阳性率高、 重复性较差等缺点。本实验使用的Genomyx电泳仪和荧光差别显示分析系统, 具有分辨率高、 重复性好、 快速、 高通量等优点, 可将感兴趣的DNA片段在计算机上定位后准确割胶, 其假阳性率远低于传统的DDPCR技术。尽管如此, 我们还采用了定量PCR和Northern blot 两种技术, 对DDPCR结果进行验证, 从而保证了结果的可靠性。
血管重塑中新生内膜的形成机制非常复杂。有报道, 定向冠状动脉旋切术后的病人血清OPN显著升高, 导致损伤血管腔至管壁OPN梯度的形成, 大量SMC、 AF/MF向内膜迁移并增殖, 形成新生内膜[9]。新近Opril提出假说: 受伤血管的VSMC释放一种趋化因子, 激活AF使之转化为MF, 后者迁移至内膜并增殖形成新生内膜[10]。本实验首次体外证实MF中OPN表达明显升高, 对AF起到趋化作用。纵然在这一过程中可能兼有其它因子的参与, 但本实验证实反义OPN对AF迁移与单纯TGFβ1刺激组比较有显著差异性, 从而肯定了OPN在趋化AF过程中起了举足轻重的作用。骨桥蛋白是一种酸性糖蛋白, 它含有GlyArgGlyAspSer (GRGDS)序列, 可与细胞表面整合素受体(integrin)结合[11]。这一结构决定了OPN在细胞粘附、 迁移中起重要作用。我们推测: 血管受损时, 外膜AF在自分泌或旁分泌TGFβ诱导下, 转化为MF, 后者迁移至内膜并增殖, 释放OPN等因子并产生ECM, 参与了新生内膜的形成。这一发现将有助于我们从AF/MF表型转化入手, 通过抑制OPN的过度表达, 达到减少新生内膜形成, 防治损伤后血管重塑的目的。
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NADH脱氢酶为呼吸链中的一个关键酶, 至少含8个亚单位, 参与细胞的能量代谢。NADH脱氢酶与NADPH共同构成血管壁的氧化酶系统(NADH/NADPH), 因此NADH脱氢酶的变化直接影响血管壁细胞的氧化还原途径, 乃至影响管壁的收缩反应[12]。
对于4个新发现的EST, 我们正在开展进一步的末端快速扩增法克隆全长。变化锚定与随机引物的组合继续寻找差异片段的工作也在同时进行。找到外膜参与血管重塑过程中与表型转化相关的基因网络中的各个结点, 将有助于我们更有效地调控整个网络的正常运作。
参考文献
[1] Schurch W, Seemayer TA,Gabbiani G. The myofibroblast. Am J Surg Pathol, 1998, 22:141～147.
[2]Gao Pingjin, Zhao Hanfang, Zhu Dingliang et al. Transfor~ming growth factor β induces transdifferentiation of vascular adventitial fibroblast involvement of protein kinase Cα. Natl Med J Chin, 1999, 79:784～785.
, http://www.100md.com
[3]Zhu DL, Herembert T, Marche P. Increased proliferation of adventitial fibroblasts from spontaneously hypertensive rat aorta. J Hypertens, 1991, 9:1161～1168.
[4]J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南.第2版, 北京:科学出版社, 1992, 367～377.
[5]Shi Y, O′Brien JE, Fard A et al. Adventitial myofibroblasts contribute to neointimal formation in injured porcine coronary arteries. Circulation, 1996, 94:1655～1664.
, 百拇医药 [6]Gabbiani G. The cellular derivation and the life span of the myofibroblast. Pathol Res Pract, 1996, 192:708～711.
[7]Desmouliere A, Geimoz A, Gabbiani F et al. Transforming growth factorβ1 induces αsmooth muscle actin expression in granulation tissue myofibroblast and in quiescent and growing cultured fibroblasts. J Cell Biol, 1993, 122:103～111.
[8]Liang P, Parde AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257:967～971.
, 百拇医药
[9]Panda D, Kundu GC, Lee BT et al. Potential roles of osteopontin and alphaVbeta3 integrin in the development of coronary artery restenosis after angioplasty. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:9308～9313.
[10]Oparil S. Hormones and vasoprotection. Hypertension， 1999, 33(part II):170～176.
[11]Liaw L, Skinner MP, Raines EW et al. The adhensive and migratory effets of OPN are mediated via distinct cells surface integrins. J Clin Invest, 1995, 95:713～724.
[12]Zalba G, Beaumont J, San Jose G et al. Vascular oxidant stress: molecular mechanism and pathophysiological implications. J Physiol Biochem, 2000, 56:57～66., 百拇医药
关键词：血管外膜；成纤维细胞；肌成纤维细胞；差异显示聚合酶链反应；反义技术
摘要：为筛选血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)与肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)间表型转化有关的基因, 实验建立了大鼠胸主动脉AF和MF两种细胞模型, 用差异显示聚合酶链反应(DDPCR)技术获得表达差异片段, 对差异片段进行克隆和测序分析, 并用定量PCR和Northern blot对差别显示结果进行验证。用反义核酸转染技术观察骨桥蛋白(osteopontin, OPN)对AF迁移的影响。 结果表明, 两种表型细胞存在明显的基因表达差异, 其中一个在MF下调的差异片段与GenBank 中NADH脱氢酶亚单位5 (NADH dehydrogenase subunit 5, Nd5)基因高度同源。另一个在MF上调的差异片段与OPN基因同源。上述差异表达结果被定量PCR及Northern blot证实。此外还有4个表达序列标志(expressed sequencetag, EST)在GenBank中未查到同源序列。反义OPN寡脱氧核苷酸可抑制AF的迁移活动。结果提示, AF转化为MF可能与ND5基因下调、 OPN上调及其它未知基因的表达改变有关。应用反义技术适度抑制OPN表达在防治血管重塑中具有重要作用。
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在球囊扩张等机械性损伤刺激下, 血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)被迅速激活, 并转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)。MF兼有AF及血管平滑肌细胞(VSMC)的双重功能特性, 它能产生细胞外基质(ECM)和多种生物活性因子, MF增殖并迁移至中膜及内膜, 从而在血管重塑中起重要作用[1]。我们曾报道在体外培养条件下用转化生长因子β1(TGFβ1) 诱导AF转化为MF[2], 为研究外膜细胞在血管重塑中的作用和机制提供了合适的细胞模型。近年来有关MF与血管重塑关系的报道日益增多, 但对AF转化为MF的分子机制尚不了解。本研究采用差异显示聚合酶链反应(DDPCR)技术, 筛选出与AF转化为MF有关的基因。
1材料和方法
1.1 AF及MF两种表型细胞的建立及鉴定采用贴片法获得并培养WKY大鼠胸主动脉外膜的AF细胞, 实验使用3～5代细胞[3]; 用TGFβ1 (20 ng/ml)处理静止状态的AF细胞24 h后获MF。采用免疫细胞化学技术及透射电镜对AF和MF进行细胞表型鉴定。WKY大鼠由上海市高血压研究所提供, TGFβ1购自Valbiotech 公司。
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1.2 总RNA提取及逆转录反应用Trizol试剂(Gibco公司)分别提取AF及MF两种细胞的总RNA量。各取0.2 μg RNA, 用Beckman公司差异显示试剂盒的3′末端12个锚定引物合成cDNA第一链。
1.3 差异显示PCR两种细胞的逆转录产物分别与试剂盒5′末端20个随机引物配对, 进行PCR扩增 (每一组实验选2个锚定引物与8个随机引物配对, 共32个反应)。反应总体积为10 μl, 内含1×buffer, 3.75 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNTP、 荧光锚定引物和随机引物各0.35 μmol/L、 1 μl 逆转录产物、 0.05 U/μl高保真Taq DNA聚合酶。反应程序: 95℃ 2 min, 1个循环; 92℃ 15 s、 50℃ 30 s、 72℃ 2 min, 4个循环; 92℃ 15 s、 60℃ 30 s、 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃延伸7 min, 4℃保存。
1.4 分离差异片段配制5.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶, 长61 cm, 宽33 cm。扩增产物加荧光染料变性处理后, 经Genomyx LR电泳仪上样及Genomyx SC荧光成像系统扫描仪(Beckman公司)获取图像, 显示差异片段。
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1.5 差异片段的回收及再扩增经割胶系统(Beckman公司)切割差异片段凝胶, 用T7及M13引物(Beckman公司)对差异片段再扩增, 然后用QIAquick Gel 抽提试剂盒(QIAGEN公司)纯化扩增产物。
1.6 再扩增产物的克隆及序列分析将纯化产物连接到pMD18T载体(Takara公司), 转染DH5α感受态细胞, 经平板筛选单克隆, 扩增后抽提质粒DNA, 然后酶切鉴定。用末端荧光标记法进行DNA序列分析。所获测序结果通过Blast软件与GenBank收录序列进行同源性比较。
1.7 定量PCR使用离心式定量PCR仪(Corbett 公司), 用SYBR Green荧光染料(Molecular Probes公司)标记双链DNA, 通过实时检测DNA扩增测定模板的拷贝数。引物合成根据差异片段的测序结果。NADH脱氢酶亚单位5 (NADH dehydrogenase subunit 5, Nd5)基因上游引物5′GGT~AA~GGG~CTA~GGC~TTCC~GA3′, 下游引物5′CCA~CCCC~CTAA~CCTC~AAA~CAA3′; 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)基因上游引物5′GCT~TG~GCT~TAT~GGA~CTG~AGGT3′, 下游引物5′AC~GAA~GTT~TCA~CAG~CCA~TGAG3′。将PCR反转录产物分别稀释104、 106、 108和1010倍, 用这些稀释产物制备标准曲线。PCR反应总体积20 μl, 含RT产物0.5 μl, 1×buffer, 0.25 mmol/L dNTP, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.06 U/μl Taq酶, 引物各0.25 μmol/L, 荧光染料2 μl。反应程序: 92℃ 15 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 35个循环。结果以mRNA拷贝数表达。
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1.8 Northern blot鉴定[4]取RNA 30 μg, 经1%琼脂糖变性电泳后, 用虹吸法将变性RNA转移至尼龙膜(Sigma公司)。以OPN、 ND5再扩增产物为探针, 用[α~32P]dCTP标记(Takara公司), 并纯化之(QIAGEN公司)。杂交, 常规洗膜, -70℃放射自显影。以图像分析仪(复日Smart View 2000)测定各杂交带光密度值与面积。
1.9 人工合成OPN寡脱氧核苷酸由德国Tech Dragon Limited公司合成硫代修饰的OPN寡脱氧核苷酸。OPN反义核酸序列为5′AA~CCAC~TGCC~AGTC~TCAT3′, 正义核酸序列为5′ATG~AGA~CTG~GCA~GTG~GTT3′, 错配义核酸序列为5′AA~CTA~CTAT~CAGT~CTC~GT3′。
1.10 转染核酸/脂质体基础上的细胞迁移实验采用AF接种Transwell (Corning公司)下室, 约70%～80%融合后, 去血清同步48 h, 以含1.5 μmol/L反义OPN/脂质体的DMEM培养液预处理8 h, 继以行TGFβ刺激。另设空白对照组, 单纯TGFβ刺激组, 正义、 错配义OPN/脂质体组。TGFβ刺激24 h后, 在Transwell上室滴加1×105 AF悬液, 37℃温箱孵育2 h后取出上室, 棉签拭去室内AF, 对室膜外滤膜上细胞用4%多聚甲醛固定、 染色。随机取5个视野(×200)计数取均值。
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2结果
2.1 细胞表型鉴定
免疫细胞化学, 经TGFβ1处理的细胞中, 平滑肌α肌动蛋白(αSMactin)表达阳性, 胞浆中见大量微肌丝; 而在未经TGFβ1处理的AF细胞, 则αSMactin表达呈阴性。 透射电镜, 经TGFβ1处理的细胞, 胞膜下有大量微肌丝形成, 且胞浆内见到丰富的内质网; 未经TGFβ1处理的AF细胞, 胞膜下几乎无微肌丝。
后显示, 插入片段与原测序胶的片段大小相似, 表明所有的差异片段均已克隆到载体中。
2.3 差异片段的序列分析
测序结果与GenBank已知DNA序列进行同源性比较, 其中一个在MF中下调的差异片段(800 bp), 其序列与ND5基因序列呈98%同源性。另一个在MF中上调差异片段(900 bp), 与OPN基因存在96%的同源性。此外, 4个表达序列标志(expressed sequencetag, EST) 在GenBank中未查到同源序列。把这些EST与dbEST库进行比较, 从中找出部分重叠的大鼠ESTs, 经Autoassembler软件将其组装成Contig序列, 然后通过DNA Strider软件对电子克隆结果进行分析, 发现这几个EST不存在完整的开放阅读框。
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2.4 定量PCR检测
ND5基因在AF中表达量为246.33±35.64, 在MF中表达量为86.66±10.96(n=3, P<0.01)。OPN在MF中表达量为1875.67±42.45, 在AF中表达量为211±53.39(n=3, P<0.01)。
2.5 Northern blot分析
ND5基因在AF中表达高于MF; OPN在MF中表达高于AF。
2.6.反义核酸对AF迁移活动的影响
反义核酸组AF迁移数目明显低于单纯TGFβ1刺激组(n=3, P<0.01)。正义核酸及错配义核酸组AF迁移数目与单纯TGFβ1刺激组比较无显著性差异。
3讨论
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多年来, 血管重塑的研究焦点都集中于血管内膜细胞及中膜VSMC。而晚近研究发现, 血管外膜细胞同样起作用, 特别是外膜AF在各种病理性损伤刺激下转化为MF, 后者增殖及迁移, 参与了血管新生内膜的形成, 在血管再狭窄等血管病变的发生和发展中起重要作用[5]。
MF是一种具有平滑肌细胞特征的成纤维细胞, 其特征性结构是胞浆内含平滑肌α肌动蛋白。MF主要由组织局部AF转型而来, 可产生ECM和多种因子, 在器官发育、 组织修复中起重要作用[6]。在众多的MF分化调控因子如PDGF、 GMCSF中, TGFβ被认为是MF表型的直接诱导因子, 因为它上调平滑肌α肌动蛋白的表达[7]。
本实验免疫细胞化学和透射电镜检查结果显示, AF细胞经TGFβ1刺激后, 细胞内出现平滑肌α肌动蛋白和大量微肌丝, 这些特征表明AF细胞已发生表型改变成为MF。在成功地建立血管的两种不同表型细胞模型的基础上, 我们从细胞表型转化这一功能入手, 分离和克隆与之有关的基因。
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1992年以来, 差别显示聚合酶链反应 (DDPCR) 技术已被广泛用于不同组织或细胞间基因表达谱的比较研究。作为一种差异表达基因的筛选技术, 它有快速、 有效的优点, 其产生的条带几乎可覆盖一个细胞所有基因的mRNA表达产物[8]。但在早期应用中, 该技术存在假阳性率高、 重复性较差等缺点。本实验使用的Genomyx电泳仪和荧光差别显示分析系统, 具有分辨率高、 重复性好、 快速、 高通量等优点, 可将感兴趣的DNA片段在计算机上定位后准确割胶, 其假阳性率远低于传统的DDPCR技术。尽管如此, 我们还采用了定量PCR和Northern blot 两种技术, 对DDPCR结果进行验证, 从而保证了结果的可靠性。
血管重塑中新生内膜的形成机制非常复杂。有报道, 定向冠状动脉旋切术后的病人血清OPN显著升高, 导致损伤血管腔至管壁OPN梯度的形成, 大量SMC、 AF/MF向内膜迁移并增殖, 形成新生内膜[9]。新近Opril提出假说: 受伤血管的VSMC释放一种趋化因子, 激活AF使之转化为MF, 后者迁移至内膜并增殖形成新生内膜[10]。本实验首次体外证实MF中OPN表达明显升高, 对AF起到趋化作用。纵然在这一过程中可能兼有其它因子的参与, 但本实验证实反义OPN对AF迁移与单纯TGFβ1刺激组比较有显著差异性, 从而肯定了OPN在趋化AF过程中起了举足轻重的作用。骨桥蛋白是一种酸性糖蛋白, 它含有GlyArgGlyAspSer (GRGDS)序列, 可与细胞表面整合素受体(integrin)结合[11]。这一结构决定了OPN在细胞粘附、 迁移中起重要作用。我们推测: 血管受损时, 外膜AF在自分泌或旁分泌TGFβ诱导下, 转化为MF, 后者迁移至内膜并增殖, 释放OPN等因子并产生ECM, 参与了新生内膜的形成。这一发现将有助于我们从AF/MF表型转化入手, 通过抑制OPN的过度表达, 达到减少新生内膜形成, 防治损伤后血管重塑的目的。
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NADH脱氢酶为呼吸链中的一个关键酶, 至少含8个亚单位, 参与细胞的能量代谢。NADH脱氢酶与NADPH共同构成血管壁的氧化酶系统(NADH/NADPH), 因此NADH脱氢酶的变化直接影响血管壁细胞的氧化还原途径, 乃至影响管壁的收缩反应[12]。
对于4个新发现的EST, 我们正在开展进一步的末端快速扩增法克隆全长。变化锚定与随机引物的组合继续寻找差异片段的工作也在同时进行。找到外膜参与血管重塑过程中与表型转化相关的基因网络中的各个结点, 将有助于我们更有效地调控整个网络的正常运作。
参考文献
[1] Schurch W, Seemayer TA,Gabbiani G. The myofibroblast. Am J Surg Pathol, 1998, 22:141～147.
[2]Gao Pingjin, Zhao Hanfang, Zhu Dingliang et al. Transfor~ming growth factor β induces transdifferentiation of vascular adventitial fibroblast involvement of protein kinase Cα. Natl Med J Chin, 1999, 79:784～785.
, http://www.100md.com
[3]Zhu DL, Herembert T, Marche P. Increased proliferation of adventitial fibroblasts from spontaneously hypertensive rat aorta. J Hypertens, 1991, 9:1161～1168.
[4]J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南.第2版, 北京:科学出版社, 1992, 367～377.
[5]Shi Y, O′Brien JE, Fard A et al. Adventitial myofibroblasts contribute to neointimal formation in injured porcine coronary arteries. Circulation, 1996, 94:1655～1664.
, 百拇医药 [6]Gabbiani G. The cellular derivation and the life span of the myofibroblast. Pathol Res Pract, 1996, 192:708～711.
[7]Desmouliere A, Geimoz A, Gabbiani F et al. Transforming growth factorβ1 induces αsmooth muscle actin expression in granulation tissue myofibroblast and in quiescent and growing cultured fibroblasts. J Cell Biol, 1993, 122:103～111.
[8]Liang P, Parde AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257:967～971.
, 百拇医药
[9]Panda D, Kundu GC, Lee BT et al. Potential roles of osteopontin and alphaVbeta3 integrin in the development of coronary artery restenosis after angioplasty. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:9308～9313.
[10]Oparil S. Hormones and vasoprotection. Hypertension， 1999, 33(part II):170～176.
[11]Liaw L, Skinner MP, Raines EW et al. The adhensive and migratory effets of OPN are mediated via distinct cells surface integrins. J Clin Invest, 1995, 95:713～724.
[12]Zalba G, Beaumont J, San Jose G et al. Vascular oxidant stress: molecular mechanism and pathophysiological implications. J Physiol Biochem, 2000, 56:57～66., 百拇医药