鸡胚脊髓背角中神经营养活性物质的初步分离和检测
1中山医科大学生理学教研室；广州 510089;2军事医学科学院基础医学研究所；北京 100850；3中山医科大学生物学教研室；广州 510089；4兰州医学院组织学与胚胎学教研室；兰州 730000 刘耀波2*；薛庆善1；肖渝平3；王先荣4
关键词：脊髓背角；神经营养活性；背根神经节
摘要：从9 d龄鸡胚脊髓背、 腹角组织提取液中, 用Sephadex G-75凝胶层析法分离出DⅠ和DⅡ, VⅠ和VⅡ各组蛋白质组分, 体外培养检测各组分对鸡胚背根节的神经营养活性。结果表明, DⅡ组分具有明显的促背根节神经突起生长的作用, 而DⅠ组分无此作用; 经SDS-PAGE电泳检测, DⅡ组分中蛋白质的分子量范围是61～15 kD。而腹角的分离组分VⅠ和VⅡ对背根神经节神经突起的生长并无明显作用。
为了探讨脊椎动物在神经系统胚胎发育过程中, 脊神经节的神经元中枢突向脊髓背角定向生长, 并与背角内的靶细胞发生神经支配, 形成特异性的脊髓感觉神经通路的原因, 美国Crain实验室研究发现: 鼠胚的脊髓背角组织在与背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)联合培养过程中, 能够对DRG神经突起的生长产生诱导作用, 而腹角组织对DRG神经突起的生长似有抑制作用[1～3]。国内薛庆善等人的研究也证实了这一作用[4]。那么, 脊髓背、 腹角组织对DRG神经突起生长的不同作用的原因是什么呢？ 一般认为, 胚胎发育过程中神经突起的定向生长可能与来自靶细胞的神经营养因子有关[5]。本研究试图对胚胎发育早期阶段的鸡胚脊髓背角组织中可能存在的具有促DRG神经突起生长的神经营养活性物质进行初步分离。
, 百拇医药
选用9 d (Hamburger 35期)Hy-Line W-36鸡胚(受精蛋购自广东省生物药厂, 37℃孵育)1*#200只。打开鸡胚椎管, 分离胸腰段脊髓。在解剖显微镜下分离背角、 腹角组织, 并保存于4℃的Hanks液中。用0.02 mol/L PBS (pH7.4)置换Hanks液。冰浴下, 对背角、 腹角组织各匀浆15 min, 将匀浆液离心(Backman 超速低温离心机, 100*#000 g, 90 min, 4℃)后取上清液, 通过0.22 μm孔径滤膜过滤除菌, 分别得到背角、 腹角组织的提取液。采用Sephadex G-75凝胶层析柱(Pharmacia产品, 长度/直径: 90/1.5 cm)。将脊髓背角组织提取液(体积为5 ml, 蛋白质含量为31.5 mg)和腹角组织提取液(体积为5 ml, 蛋白质含量为25.9 mg)上样。洗脱液为0.02 mol/L PBS, 洗脱速度为每管1.5 ml/6 min, 在4℃下进行。将收集到的不同洗脱峰所对应的洗脱液, 在4℃下, 用超滤系统(Amicon 8010型, 超滤膜为Amicon PM-10), 以氮气为正压(0.3～0.5 MPa)浓缩至原体积的1/4。将各浓缩液分别离心(4*#000 r/min, 45 min, 4℃), 取上清液, 用孔径为0.22 μm的滤膜过滤除菌。使用标准牛血清白蛋白(Sigma产品), 并参照Bradford方法[6]绘制标准蛋白质曲线, 测定各组分的蛋白质浓度。即制成了拟进行生物活性检测的各蛋白质组分, 分别是: 背角组织提取液层析组分Ⅰ、 Ⅱ (记为DⅠ、 DⅡ); 腹角组织提取液层析组分Ⅰ、 Ⅱ (记为VⅠ、 VⅡ)。
, 百拇医药
利用薛庆善等[7]的培养法培养9 d龄鸡胚的DRG, 检测不同组分对DRG神经突起生长的影响。实验共分背角组 (DⅠ组、 DⅡ组和对照组) 与腹角组 (VⅠ组、 VⅡ组和对照组)两大组, 共6个小组。培养液为含20 %小牛血清的MEM(Gibco BRL产品)培养液(补加葡萄糖5.0 g/L、 HEPES 4.776 g/L、 NaHCO3 2.2 g/L)。对照组每个DRG加40 μl含20 %小牛血清的MEM培养液, 实验组每个DRG加30 μl含20 %小牛血清的MEM培养液和10 μl相应的待检测层析组分(各检测组分均用0.02 mol/L pH7.4的PBS稀释至其蛋白质浓度为100 μg/ml)。培养48 h后, 显微镜下观察DRG的生长情况。采用薛庆善等人[8]建立的同心圆测试格分析方法定量分析DRG神经突起的平均长度, 并进行t检验分析。
参考郭尧君改良的电泳及蛋白质银染方法[9]。首先用低分子量标准蛋白(上海生物化学研究所)作为标准, 绘制出标准分子量曲线。根据待测DⅡ组样品蛋白的Rf.值, 从标准曲线上查得样品蛋白质的分子量。得到DⅡ组样品蛋白的分子量范围。
, 百拇医药
实验结果如下:
1. 鸡胚脊髓背、 腹角组织提取液的层析分离
牛血清白蛋白标准浓度(X)与相应光密度值(Y)的标准曲线为:
X=-42.857+2197.8Y；R=0.9967
经考马斯亮蓝法测定, 脊髓背、 腹角组织提取液的蛋白质浓度分别为6.3、 5.2 mg/ml。分别经Sephadex G-75凝胶层析分离后, 各得到两个洗脱峰。经浓缩后得到各检测组分, 其中DⅠ组分和 DⅡ 组分的蛋白质浓度为4.1和1.88 mg/ml, VⅠ 组分和 VⅡ 组分的蛋白质浓度为4.2 和1.99 mg/ml。
2. 鸡胚脊髓背、 腹角组织各层析组分神经营养活性的检测
各组鸡胚DRG在培养48 h后, 均可见神经突起呈放射状从DRG向外延伸, 在DRG周围形成了由神经突起构成的纤维晕。总的来说, DⅡ组的DRG神经突起生长情况普遍比其它组好。根据前述的测量方法分别测量各组DRG神经突起的平均长度, 在第一大组中, DⅠ组、 DⅡ组和对照组各组(n=25)的神经突起平均长度分别为298.3±13.4、 507.15±20.4、 292.85±15.9 μm。经t-检验分析可见, DⅠ组与对照组无显著性差异(P>0.05), 而DⅡ组与对照组有显著性差异(P<0.001)。DⅡ组与DⅠ组相比, DRG神经突起的平均长度也有显著性差异(P<0.001)。在第二大组中, VⅠ组、 VⅡ组与对照组各组(n=25)的神经突起平均长度分别为303.15±11.8、 303.86±6.7、 297.3±14.4 μm。t检验分析表明, VⅠ组与VⅡ组之间以及VⅠ组、 VⅡ组与对照组之间均无显著性差异(P>0.05)。
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3. SDS-PAGE电泳测定层析组分的分子量
以Rf.为横坐标(X), 分子量的对数值为纵坐标(Y), 绘制成标准蛋白质分子量对数值的迁移率曲线: Log MW＝2.055-0.8925X, (R＝-0.9969)。DⅡ组分蛋白质溶液经SDS-PAGE垂直板电泳后经银染色, 肉眼观察可见有四条主要的蛋白质区带。相对迁移率分别为0.29、 0.43、 0.56、 0.97。从标准曲线上可查出分子量分布范围在61～15 kD之间(61、 47、 36、 15 kD) 。
神经营养活性物质在组织中的含量甚微, 多为分子量较小的蛋白质或多肽。本文以大量的鸡胚(1*#200只)脊髓背、腹角组织为来源, 初步分离了其中的神经营养活性物质。为了保持蛋白质组分的生物活性, 整个分离过程均保持在4℃以下, 并尽量缩短操作时间, 避免反复冻融。考虑到神经营养活性物质多属于分子量较低的蛋白质, 故采用超速离心技术, 尽可能去除杂质。选用Sephadex G-75为凝胶层析填料, 主要是由于它所适的分子量范围基本上涵盖了已知的神经营养因子的分子量范围[10～13]。
, 百拇医药
本研究初步分离到的脊髓背角组织提取液中的DⅡ活性组分, 为进一步纯化背角组织中的神经营养活性物质打下了基础。已知神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是脊髓背角组织中的神经营养因子之一, 但NGF仅以其对支配神经元的神经营养作用制约着神经节中存活的神经元数量, 调节脊神经节神经元的生长。而且NGF的作用范围和生物学效应具有相对广泛性而缺乏神经元靶细胞的细胞专一性。故NGF不是背角组织中促进并决定DRG神经突起向脊髓背角生长并发生神经支配关系的唯一因素[5]。而且Sephadex G-75凝胶层析本身的分辨率限制了层析组分的纯度还不能达到单种蛋白质成分的程度, 因而还需采用多种其它方法进一步对DⅡ组分作深度纯化, 以明确本文所分离的脊髓背角组织提取液中的促DRG神经突起生长活性物质是否属于已知神经营养因子的一种, 或者是一种新的神经营养因子。
综上所述, 本研究从脊髓背角组织提取液分离到的DⅡ组分具有促神经突起生长活性(61 ～15 kD)。这一活性组分的分离与鉴定提示, 脊髓背角组织能够促进DRG神经突起生长的可能原因[1～4], 是背角组织中含有的神经营养活性物质具有促使或诱导DRG神经突起生长的作用。但腹角组织中则缺乏这种活性物质。
, 百拇医药
参考文献
[1]Stanley MC, Edith RP. Selective innervation of target regions within fetal mouse spinal cord and medulla explants by isolated dorsal root ganglia in organotypic co-cultures. Dev Brain Res, 1982, 2:341～362.
[2]Edith RP, Stanley MC. Preferential growth of neurites from isolated fetal mouse dorsal root ganglia in relation to specific regions of co-cultured spinal cord explants. Dev Brain Res, 1982, 2:363～382.
, 百拇医药
[3]Neil RS, Edith RP, Stanley MC. Specific neuritic pathways and arborizations formed by fetal mouse dorsal root ganglion cells within organized spinal cord explants in culture: A peroxidase-labeling study. Dev Brain Res, 1982, 2:383～395.
[4]Xue QS (薛庆善), Xiao YP (肖渝平). The effect of explants from dorsal and ventral spinal cord on the spinal ganglion neurite-outgrowth of chicken embryo. Chinese J Anat (解剖学杂志), 1995, 18:311～313 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药
[5]Snider WD. Functions of neurotrophins during development: what are the “knockouts” teaching us? Cell, 1994, 77:627～638.
[6]Bradford HM. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72:248～254.
[7]Xue QS (薛庆善), Wu LF (吴良芳), Bao TR (保天然). Modification of the hanging-drop culture technique and its application to the dorsal root ganglion of chicken embryo in vitro. Sichuan J Anat (四川解剖学杂志), 1993, 1:50～53 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药
[8]Xue QS (薛庆善), Xiao YP (肖渝平), Feng WM (冯武鸣). Application of the concentric circles test grid to the morphometric analysis. Sichuan J Anat (四川解剖学杂志), 1995, 3:65～69 (Chinese, English abstract).
[9]Guo RJ (郭尧君). The progress and improvement in SDS-PAGE. Prog Biochem Biophys (生物化学与生物物理进展), 1991, 18:32～37 (Chinese, English abstract).
[10]Bardshaw RW. Nerve growth factor. Ann Rev Biochem, 1978, 47:191～216.
, 百拇医药
[11]Hohn A, Leibrock J, Bailey K et al. Identification and characterization of a novel member of the nerve growth factor/brain-derived neurotrophic factor family. Nature, 1990, 344:339～341.
[12]Gotz R, Koster R, Winkler C et al. Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family. Nature, 1994, 372:266～269.
[13]Terenghi G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors. J Anat, 1999, 194:1～14.
Received 2000-10-15Accepted 2000-12-15
This work was supported by the National Nature Science Foundation of China (No.39470244).
*Corresponding author. Tel: 010-66937914; E-mail: liuyb@nic.bmi.ac.cn, http://www.100md.com
关键词：脊髓背角；神经营养活性；背根神经节
摘要：从9 d龄鸡胚脊髓背、 腹角组织提取液中, 用Sephadex G-75凝胶层析法分离出DⅠ和DⅡ, VⅠ和VⅡ各组蛋白质组分, 体外培养检测各组分对鸡胚背根节的神经营养活性。结果表明, DⅡ组分具有明显的促背根节神经突起生长的作用, 而DⅠ组分无此作用; 经SDS-PAGE电泳检测, DⅡ组分中蛋白质的分子量范围是61～15 kD。而腹角的分离组分VⅠ和VⅡ对背根神经节神经突起的生长并无明显作用。
为了探讨脊椎动物在神经系统胚胎发育过程中, 脊神经节的神经元中枢突向脊髓背角定向生长, 并与背角内的靶细胞发生神经支配, 形成特异性的脊髓感觉神经通路的原因, 美国Crain实验室研究发现: 鼠胚的脊髓背角组织在与背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)联合培养过程中, 能够对DRG神经突起的生长产生诱导作用, 而腹角组织对DRG神经突起的生长似有抑制作用[1～3]。国内薛庆善等人的研究也证实了这一作用[4]。那么, 脊髓背、 腹角组织对DRG神经突起生长的不同作用的原因是什么呢？ 一般认为, 胚胎发育过程中神经突起的定向生长可能与来自靶细胞的神经营养因子有关[5]。本研究试图对胚胎发育早期阶段的鸡胚脊髓背角组织中可能存在的具有促DRG神经突起生长的神经营养活性物质进行初步分离。
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选用9 d (Hamburger 35期)Hy-Line W-36鸡胚(受精蛋购自广东省生物药厂, 37℃孵育)1*#200只。打开鸡胚椎管, 分离胸腰段脊髓。在解剖显微镜下分离背角、 腹角组织, 并保存于4℃的Hanks液中。用0.02 mol/L PBS (pH7.4)置换Hanks液。冰浴下, 对背角、 腹角组织各匀浆15 min, 将匀浆液离心(Backman 超速低温离心机, 100*#000 g, 90 min, 4℃)后取上清液, 通过0.22 μm孔径滤膜过滤除菌, 分别得到背角、 腹角组织的提取液。采用Sephadex G-75凝胶层析柱(Pharmacia产品, 长度/直径: 90/1.5 cm)。将脊髓背角组织提取液(体积为5 ml, 蛋白质含量为31.5 mg)和腹角组织提取液(体积为5 ml, 蛋白质含量为25.9 mg)上样。洗脱液为0.02 mol/L PBS, 洗脱速度为每管1.5 ml/6 min, 在4℃下进行。将收集到的不同洗脱峰所对应的洗脱液, 在4℃下, 用超滤系统(Amicon 8010型, 超滤膜为Amicon PM-10), 以氮气为正压(0.3～0.5 MPa)浓缩至原体积的1/4。将各浓缩液分别离心(4*#000 r/min, 45 min, 4℃), 取上清液, 用孔径为0.22 μm的滤膜过滤除菌。使用标准牛血清白蛋白(Sigma产品), 并参照Bradford方法[6]绘制标准蛋白质曲线, 测定各组分的蛋白质浓度。即制成了拟进行生物活性检测的各蛋白质组分, 分别是: 背角组织提取液层析组分Ⅰ、 Ⅱ (记为DⅠ、 DⅡ); 腹角组织提取液层析组分Ⅰ、 Ⅱ (记为VⅠ、 VⅡ)。
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利用薛庆善等[7]的培养法培养9 d龄鸡胚的DRG, 检测不同组分对DRG神经突起生长的影响。实验共分背角组 (DⅠ组、 DⅡ组和对照组) 与腹角组 (VⅠ组、 VⅡ组和对照组)两大组, 共6个小组。培养液为含20 %小牛血清的MEM(Gibco BRL产品)培养液(补加葡萄糖5.0 g/L、 HEPES 4.776 g/L、 NaHCO3 2.2 g/L)。对照组每个DRG加40 μl含20 %小牛血清的MEM培养液, 实验组每个DRG加30 μl含20 %小牛血清的MEM培养液和10 μl相应的待检测层析组分(各检测组分均用0.02 mol/L pH7.4的PBS稀释至其蛋白质浓度为100 μg/ml)。培养48 h后, 显微镜下观察DRG的生长情况。采用薛庆善等人[8]建立的同心圆测试格分析方法定量分析DRG神经突起的平均长度, 并进行t检验分析。
参考郭尧君改良的电泳及蛋白质银染方法[9]。首先用低分子量标准蛋白(上海生物化学研究所)作为标准, 绘制出标准分子量曲线。根据待测DⅡ组样品蛋白的Rf.值, 从标准曲线上查得样品蛋白质的分子量。得到DⅡ组样品蛋白的分子量范围。
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实验结果如下:
1. 鸡胚脊髓背、 腹角组织提取液的层析分离
牛血清白蛋白标准浓度(X)与相应光密度值(Y)的标准曲线为:
X=-42.857+2197.8Y；R=0.9967
经考马斯亮蓝法测定, 脊髓背、 腹角组织提取液的蛋白质浓度分别为6.3、 5.2 mg/ml。分别经Sephadex G-75凝胶层析分离后, 各得到两个洗脱峰。经浓缩后得到各检测组分, 其中DⅠ组分和 DⅡ 组分的蛋白质浓度为4.1和1.88 mg/ml, VⅠ 组分和 VⅡ 组分的蛋白质浓度为4.2 和1.99 mg/ml。
2. 鸡胚脊髓背、 腹角组织各层析组分神经营养活性的检测
各组鸡胚DRG在培养48 h后, 均可见神经突起呈放射状从DRG向外延伸, 在DRG周围形成了由神经突起构成的纤维晕。总的来说, DⅡ组的DRG神经突起生长情况普遍比其它组好。根据前述的测量方法分别测量各组DRG神经突起的平均长度, 在第一大组中, DⅠ组、 DⅡ组和对照组各组(n=25)的神经突起平均长度分别为298.3±13.4、 507.15±20.4、 292.85±15.9 μm。经t-检验分析可见, DⅠ组与对照组无显著性差异(P>0.05), 而DⅡ组与对照组有显著性差异(P<0.001)。DⅡ组与DⅠ组相比, DRG神经突起的平均长度也有显著性差异(P<0.001)。在第二大组中, VⅠ组、 VⅡ组与对照组各组(n=25)的神经突起平均长度分别为303.15±11.8、 303.86±6.7、 297.3±14.4 μm。t检验分析表明, VⅠ组与VⅡ组之间以及VⅠ组、 VⅡ组与对照组之间均无显著性差异(P>0.05)。
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3. SDS-PAGE电泳测定层析组分的分子量
以Rf.为横坐标(X), 分子量的对数值为纵坐标(Y), 绘制成标准蛋白质分子量对数值的迁移率曲线: Log MW＝2.055-0.8925X, (R＝-0.9969)。DⅡ组分蛋白质溶液经SDS-PAGE垂直板电泳后经银染色, 肉眼观察可见有四条主要的蛋白质区带。相对迁移率分别为0.29、 0.43、 0.56、 0.97。从标准曲线上可查出分子量分布范围在61～15 kD之间(61、 47、 36、 15 kD) 。
神经营养活性物质在组织中的含量甚微, 多为分子量较小的蛋白质或多肽。本文以大量的鸡胚(1*#200只)脊髓背、腹角组织为来源, 初步分离了其中的神经营养活性物质。为了保持蛋白质组分的生物活性, 整个分离过程均保持在4℃以下, 并尽量缩短操作时间, 避免反复冻融。考虑到神经营养活性物质多属于分子量较低的蛋白质, 故采用超速离心技术, 尽可能去除杂质。选用Sephadex G-75为凝胶层析填料, 主要是由于它所适的分子量范围基本上涵盖了已知的神经营养因子的分子量范围[10～13]。
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本研究初步分离到的脊髓背角组织提取液中的DⅡ活性组分, 为进一步纯化背角组织中的神经营养活性物质打下了基础。已知神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是脊髓背角组织中的神经营养因子之一, 但NGF仅以其对支配神经元的神经营养作用制约着神经节中存活的神经元数量, 调节脊神经节神经元的生长。而且NGF的作用范围和生物学效应具有相对广泛性而缺乏神经元靶细胞的细胞专一性。故NGF不是背角组织中促进并决定DRG神经突起向脊髓背角生长并发生神经支配关系的唯一因素[5]。而且Sephadex G-75凝胶层析本身的分辨率限制了层析组分的纯度还不能达到单种蛋白质成分的程度, 因而还需采用多种其它方法进一步对DⅡ组分作深度纯化, 以明确本文所分离的脊髓背角组织提取液中的促DRG神经突起生长活性物质是否属于已知神经营养因子的一种, 或者是一种新的神经营养因子。
综上所述, 本研究从脊髓背角组织提取液分离到的DⅡ组分具有促神经突起生长活性(61 ～15 kD)。这一活性组分的分离与鉴定提示, 脊髓背角组织能够促进DRG神经突起生长的可能原因[1～4], 是背角组织中含有的神经营养活性物质具有促使或诱导DRG神经突起生长的作用。但腹角组织中则缺乏这种活性物质。
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参考文献
[1]Stanley MC, Edith RP. Selective innervation of target regions within fetal mouse spinal cord and medulla explants by isolated dorsal root ganglia in organotypic co-cultures. Dev Brain Res, 1982, 2:341～362.
[2]Edith RP, Stanley MC. Preferential growth of neurites from isolated fetal mouse dorsal root ganglia in relation to specific regions of co-cultured spinal cord explants. Dev Brain Res, 1982, 2:363～382.
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[3]Neil RS, Edith RP, Stanley MC. Specific neuritic pathways and arborizations formed by fetal mouse dorsal root ganglion cells within organized spinal cord explants in culture: A peroxidase-labeling study. Dev Brain Res, 1982, 2:383～395.
[4]Xue QS (薛庆善), Xiao YP (肖渝平). The effect of explants from dorsal and ventral spinal cord on the spinal ganglion neurite-outgrowth of chicken embryo. Chinese J Anat (解剖学杂志), 1995, 18:311～313 (Chinese, English abstract).
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[5]Snider WD. Functions of neurotrophins during development: what are the “knockouts” teaching us? Cell, 1994, 77:627～638.
[6]Bradford HM. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72:248～254.
[7]Xue QS (薛庆善), Wu LF (吴良芳), Bao TR (保天然). Modification of the hanging-drop culture technique and its application to the dorsal root ganglion of chicken embryo in vitro. Sichuan J Anat (四川解剖学杂志), 1993, 1:50～53 (Chinese, English abstract).
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[8]Xue QS (薛庆善), Xiao YP (肖渝平), Feng WM (冯武鸣). Application of the concentric circles test grid to the morphometric analysis. Sichuan J Anat (四川解剖学杂志), 1995, 3:65～69 (Chinese, English abstract).
[9]Guo RJ (郭尧君). The progress and improvement in SDS-PAGE. Prog Biochem Biophys (生物化学与生物物理进展), 1991, 18:32～37 (Chinese, English abstract).
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[11]Hohn A, Leibrock J, Bailey K et al. Identification and characterization of a novel member of the nerve growth factor/brain-derived neurotrophic factor family. Nature, 1990, 344:339～341.
[12]Gotz R, Koster R, Winkler C et al. Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family. Nature, 1994, 372:266～269.
[13]Terenghi G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors. J Anat, 1999, 194:1～14.
Received 2000-10-15Accepted 2000-12-15
This work was supported by the National Nature Science Foundation of China (No.39470244).
*Corresponding author. Tel: 010-66937914; E-mail: liuyb@nic.bmi.ac.cn, http://www.100md.com