刺激大鼠穹窿下器官诱发饮水和脑内c-fos表达的胆碱能机制
苏州大学医学院生理教研室；苏州215007 李旭平*；李金华；周晓鸥；徐智策；蒋星红**
关键词：穹窿下器官；饮水行为；c-fos；阿托品
摘要：实验以饮水行为及脑内c-fos表达为指标, 观察刺激大鼠穹窿下器官(SFO)的效应。结果显示, 刺激SFO能诱发明显的饮水行为, 与此同时, 前脑8个部位(终板血管器官、正中视前核、室旁核、视上核、下丘脑外侧区、穹窿周核背侧区、丘脑联合核和无名质)和后脑3个部位(最后区、孤束核和臂旁外侧核)的Fos蛋白表达明显增强。免疫组化双重染色结果显示, 刺激SFO能诱导视上核和室旁核中部分神经元呈Fos蛋白和加压素共同表达。脑室注射阿托品能部分阻断刺激SFO诱发的饮水行为, 脑内上述各部位所诱导的Fos蛋白表达也明显减弱。以上结果提示, M胆碱能机制参与刺激SFO诱发的饮水行为和脑内Fos蛋白的表达。
饮水行为在体液平衡调节中起重要作用[1], 其中枢调节机制尚不完全清楚。穹窿下器官(subfornical organ, SFO)是最早明确和饮水行为有关的一个室周器官, 被认为是整合外周和中枢体液平衡信号的关键部位[1~4]。SFO参与低血容量性脱水、细胞性脱水以及混合性脱水诱发的饮水[1,5,6]。多种致渴因子(如血管紧张素Ⅱ, 氨甲酰胆碱)注射到SFO以及电刺激该部位都能诱发饮水[6~10]。
, 百拇医药
c-fos是一种即刻快速反应基因, 可被神经递质、电刺激等多种刺激诱导而快速表达, 并作为神经元激活的标志。80年代末90年代初, c-fos技术被用于渴机制的研究, 并已成为研究饮水行为中枢机制的一种重要工具[11,12]。
形态学研究表明, SFO和许多脑区之间存在直接的神经联系。如正中视前核(median preoptic nucleus, MnPO)、终板血管器官(organum vasculosum of the lamina terminalis, OVLT)、室旁核(paraventricular nucleus, PVN)、视上核(supraoptic nucleus, SON)、臂旁外侧核(lateral parabrachial nucleus, LPBN)、孤束核(solitary tract nucleus, NST)[5,13,14]等。行为学研究已表明, 这些脑区和饮水行为有关[5]; 最近有报道, 向SFO微量注射血管紧张素Ⅱ、氨甲酰胆碱或血管紧张素I在诱发饮水的同时, 可诱导这些脑区的2-DG摄取或Fos蛋白表达[7,9], 但是刺激SFO能否诱导这些脑区的Fos蛋白表达, 至今还未见报道。
, 百拇医药
SFO内有胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)免疫反应阳性神经元[3,5,15]和胆碱能传入神经末梢[16]。在和SFO有联系的许多与饮水有关的核团内, 也都有胆碱能神经支配[16]; 但胆碱能机制是否参与刺激SFO的效应有待确定。
为此, 我们观察刺激SFO诱导的饮水行为和脑内Fos蛋白表达, 以及脑室注射阿托品对其的影响, 旨在探讨刺激SFO诱发饮水行为和脑内Fos蛋白表达的胆碱能机制。此外, 实验中还观察了刺激SFO诱导的PVN 和SON中加压素(vasopressin,VP)能神经元激活的情况。
1材料和方法
1.1 实验动物和分组实验用雄性Sprague-Dawley成年大鼠(210~250 g), 由苏州大学实验动物中心提供。在正常温控光照与自由摄食饮水条件下饲养一周后进行实验。实验分两部分: (1)刺激SFO。动物随机分为三组: SFO刺激组和两个对照组(SFO假刺激组、非SFO刺激组)。假刺激组的实验操作除刺激器不开通外, 其他步骤与刺激组相同; 非SFO刺激组的刺激部位在SFO以外, 其他步骤同刺激组。(2)脑室注射阿托品后刺激SFO。动物随机分为两组, 侧脑室注射阿托品+刺激SFO的实验组和侧脑室注射生理盐水+刺激SFO的对照组。
, 百拇医药
1.2 实验动物的准备
1.2.1 手术操作(1)SFO内埋电极: 大鼠经4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉后, 固定于立体定向仪上, 沿矢状轴作正中切口, 参照Paxinos和Watson图谱, 在颅骨表面定点, 用牙钻打孔, 将同心圆单极刺激电极埋植到SFO, 坐标为: Bregma -0.85~-0.9 mm, 颅骨表面下4.85~5.35 mm (非SFO刺激组的电极埋植到4.15~4.55 mm)。电极外径为0.4 mm, 内芯尖端裸露250 μm。电极用牙科水泥固定于颅骨表面。(2)侧脑室埋套管: 侧脑室定位坐标为Bregma -1.0 mm, L1.5 mm, 颅骨表面下3.5 mm, 埋入的套管外径为0.8 mm, 和SFO刺激电极一起用牙科水泥固定于颅骨表面。(3)术后训练: 术后3 d内给动物肌注青霉素4万U/只。在恢复期5 d内, 每天08∶00~12∶00之间, 使大鼠熟悉实验操作过程8~10 min, 以减少应激影响。
, 百拇医药 1.2.2 实验操作(1)刺激SFO: 实验在08∶00~12∶00进行。动物在自由活动状态下, 通过埋植的电极对SFO进行电刺激。刺激方波为: 100 μA,10 Hz,1 ms, 刺激5 min。观察刺激后出现饮水行为的动物数, 从各组动物的总数中计算出诱饮率, 并记录刺激后1 h内的饮水量(从刻度滴管读取)和饮水次数。(2)脑室注射阿托品: 在刺激SFO前10 min, 将套管内芯抽出, 插入微量注射针头进行注射, 注射速度为1 μl/1 min, 留针时间至少1 min。给药10 min后刺激SFO(参数同前), 并计算诱饮率、1 h内饮水量和饮水次数。阿托品(北京制药厂)用0.9%的生理盐水配置, 注射量为15 nmol/3 μl,对照组注射生理盐水的容量同阿托品注射组。
1.3 免疫组化(1)Fos免疫组化: 刺激SFO后1 h, 用过量麻醉处死大鼠, 开胸, 经左心室快速灌流0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)100 ml, 接着灌注4%多聚甲醛(PFA)100 ml。取全脑置于4% PFA中后固定6 h, 转入20%蔗糖过夜, 次日作连续冰冻切片(40~60 μm), 参照脑图谱的核团范围, 每隔2张取1张切片, 放入PBS漂洗2次, 转入Fos抗体(兔抗鼠, 多克隆抗体, 浓度1∶3?000, 上海华美制剂公司)中孵育16 h, PBS漂洗2次后转入羊抗兔生物素化二抗IgG (1∶200, Vector公司)中1~2 h, PBS漂洗2次, 移入亲和素生物素试剂(avidin-biotin complex, ABC, 1∶200, Vector公司)1~2 h, 最后用0.05% DAB和0.02% H2O2显色。(2)双重染色: 选取刺激SFO组含有PVN和SON的切片, 在Fos免疫组化操作至DAB显色后, 置于VP抗体(1∶1?000, 兔抗大鼠多克隆抗体, Instar公司)16 h, 经PBS漂洗2次, 相继浸入二抗和ABC(1∶200, 0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制), 磷酸缓冲液漂洗2次后, 再用醋酸钠缓冲液漂洗1次, 最后用加硫酸镍的DAB和0.03% H2O2显色, 终止显色反应后, 贴片风干, 经二甲苯透明处理后用树胶封片。在25×10光镜下观察, 细胞核呈棕褐色沉着的为Fos样免疫反应(Fos-like immunoreactivity, FLI)阳性神经元, 胞浆呈灰蓝色的为VP免疫反应阳性神经元, 计算每个核团中相同平面与视野内FLI阳性神经元数和VP免疫反应阳性神经元数, 需要时摄片。
, 百拇医药
1.4 统计处理实验数据用mean±SE表示, 用SPSS统计软件包作ANOVA, 用Fisher′s Exact test 作诱饮率的比较, 用Excel 97制成图表。
2结果
2.1 刺激SFO诱发的饮水行为
SFO刺激组的8只大鼠中有6只出现饮水行为, 诱饮率为75%, 平均1 h内饮水次数为1.25±1.09, 饮水量为0.28±0.22 ml。两个对照组无一出现饮水, 诱饮率为0, 平均1 h内饮水次数和饮水量均为0。将SFO刺激组和两个对照组(非SFO刺激组和假刺激组)相比较, 诱饮率、饮水次数和饮水量都有显著差异(P<0.01)。说明刺激SFO能诱发明显的饮水行为, SFO是一个和饮水有关的部位。
2.2 刺激SFO诱发的脑内Fos蛋白表达
, http://www.100md.com
刺激SFO使前脑8个脑区和后脑3个脑区的Fos蛋白明显表达。前脑8个部位是终板血管器官(OVLT)、正中视前核(MnPO)、室旁核(PVN)、视上核(SON)、下丘脑外侧区(LHA)、穹窿周核背侧区(pefd)、丘脑联合核(Re)和无名质(SI); 后脑的3个部位是最后区(AP)、NST和LPBN。两个对照组的这些脑区或者没有或者只有很少量(0~10个)的FLI阳性神经元。SFO刺激组与这两个对照组相比, 差别都非常明显(P<0.01)。结果表明, 刺激SFO在诱发饮水行为的同时, 能激活脑内与饮水有关的一些核团。
2.3 刺激SFO激活PVN和SON神经元的化学性质
双染的实验结果显示, 刺激SFO诱发PVN和SON的FLI-阳性神经元中都有一部分同时呈VP免疫反应阳性。在PVN中这种共同表达Fos蛋白和VP的神经元占全部FLI-阳性神经元的(7.0±0.6)%, 在SON则占到(20.8±2.0)%。
, http://www.100md.com
2.4 脑室注射阿托品对刺激SFO效应的影响
脑室注射阿托品后刺激SFO, 在14只动物中有5只出现饮水, 诱饮率为35.71%。而脑室注射生理盐水后刺激SFO, 在11只动物中有8只出现饮水, 诱饮率为72.73%, 高于阿托品组。阿托品组平均1 h饮水次数为0.43±0.65, 饮水量为0.06±0.11 ml, 明显少于对照组的饮水次数(1.09±0.94)和饮水量(0.27±0.25 ml)(P<0.05)。 表明脑室注射阿托品能明显抑制刺激SFO所诱发的饮水行为。
在所观察的前、后脑11个部位中, 预先脑室注射阿托品可使刺激SFO诱导的Fos蛋白表达量减少, 除AP以外, 都有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。实验结果表明, 阿托品在抑制饮水的同时, 能使刺激SFO诱导的绝大部分脑区的Fos蛋白表达明显减少。
3讨论
, http://www.100md.com
SFO是一个与饮水有关的重要脑区。由于它是一个缺乏血脑屏障的脑区, 并位于第三脑室上方[1,2], 因此对外周和中枢的多种致渴刺激都能发生反应而诱发饮水行为[1,5~10]。外周注射、脑室注射、向SFO微量注射血管紧张素Ⅱ或氨甲酰胆碱都能诱发饮水[5,8,9,18]。近年来发现, SFO含有血管紧张素Ⅱ受体和M-胆碱受体[3~5]。所以一般认为, 上述这些致渴因子诱发饮水是作用于相应受体的神经元。本实验刺激SFO也能诱发明显的饮水行为, 这与Smith刺激SFO能诱发饮水的实验结果[10]基本一致。看来, 电刺激很可能激活了SFO内多种神经元, 从而诱发饮水。
c-fos是即刻快速反应基因的一种, 能被多种刺激诱导而在神经元内表达。以往用c-fos技术研究中枢渴机制的文献表明, 脑室注射各种致渴因子或向SFO微量注射血管紧张素I在诱发饮水反应的同时, 能诱导一些脑区Fos蛋白表达[7,18]。这些脑区包括第三脑室前腹侧壁(AV3V)中的MnPO和OVLT、下丘脑外侧区、视上核和室旁核、Re、SI以及脑干的NST、LPBN和AP等。刺激SFO还能使上述一些脑区2-DG摄取量变化[9,19]。顺行和逆行束路追踪法表明, SFO和上述脑区之间有神经联系[5,13,14]。用药理学方法阻断上述致渴刺激诱发饮水的同时, 也使c-fos的表达抑制[5,21,23]。其他研究方法也支持这些部位和饮行为有关[5,20]。这些资料说明, 致渴因子诱发的饮水和这些c-fos表达的脑区有关。本实验直接电刺激SFO也能诱发饮水行为和上述广泛脑区的Fos蛋白表达明显增加, 提示刺激激活了SFO中多种神经元而通过传出联系兴奋了这些与饮水调节有关的核团。至于c-fos表达与饮水行为之间的关系, 迄今尚未完全明了。Herbert认为c-fos表达和饮水行为之间可能不存在直接的关系[11], 但他和大多数学者都认为, c-fos表达为研究和饮水行为有关的神经元活动提供了一个技术窗口, 可以用它来分析致渴刺激诱发饮水行为的脑机制[5,11]。我们的实验结果尚无法明确c-fos表达和饮水行为之间的确切关系, 但它的表达可从一个侧面反映刺激SFO诱发饮水行为的中枢机制。
, http://www.100md.com
下丘脑PVN 和SON是和饮水机制有密切关系的部位。以往解剖学和电生理学研究表明SFO和这两个部位有直接神经联系[13,14]。有资料表明, 致渴因子能激活PVN和SON中的VP能神经元[7,21], 电刺激SFO能使外周VP增加[17]。本实验进一步证明, 刺激SFO可激活PVN和SON中的一部分VP能神经元参与饮水反应, 因而提示, 刺激SFO既能诱发饮水行为, 又能促使VP分泌, 以维持体液平衡。
中枢胆碱能通路是介导饮水行为的神经通路之一, 其效应主要由M受体介导[8,21~23]。SFO内存在ChAT免疫反应阳性神经元[2,3], 与SFO有联系的和饮水有关的脑区大都有胆碱能神经支配和M受体分布[16]。拟胆碱药物氨甲酰胆碱注射到SFO能诱发饮水, 阿托品可阻断此效应[8]。将氨甲酰胆碱注射到和SFO有神经联系的前脑部位, 也能诱发饮水行为[20]。在我们的实验中, 用阿托品可部分阻断刺激SFO诱发的饮水行为, 还能使参与饮水的脑区内的Fos蛋白表达减弱, 说明刺激SFO可通过胆碱能通路实现其效应。由于阿托品未能完全阻断刺激SFO诱发的效应, 提示还有其他性质(如AngⅡ通路[5,24])的通路参与, 这有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Gross PM. The subfornical organ as a model of neurohumoral integration. Brain Res Bull, 1985, 15 (1): 65~70.
[2]Dellmann HD. Structure of the subfornical organ: A review. Micro Res Tech, 1998, 41: 85~97.
[3]Weindl A, Bufler J, Winkler B et al. Neurotransmitters and receptors in the subfornical organ: Immunohistochemical and electrophysiological evidence. Prog Brain Res, 1992, 91: 261~269.
, 百拇医药
[4]Yang LM (杨丽明), Wang ZA (王志安), He RR (何瑞荣). Effects of angiotensin Ⅱ, atrial natriuretic peptide and arginine vasopressin on activity of subfornical organ neurons in rat brain slices. Acta Physiol Sin (生理学报),1993, 45 (3): 246~254 (Chinese， English abstract).
[5]Fitzsimons JT. Angiotensin, thirst and sodium appetite. Physiol Rev, 1998, 78 (3): 586~685.
[6]Lind RW, Thunhorst RL, Johnson AK. The subfornical organ and the integration of multiple factors in thirst. Physiol Behav, 1984, 32: 69~74.
, 百拇医药
[7]Xu ZC, Jiang XH. Drinking and Fos-immunoreactivity in rat brain induced by local injection of angiotensin I into the subfornical organ. Brain Res,1999, 817: 67~74.
[8]Menani JW, Saad WA. Effect of cholinergic and adrenergic stimulation of the subfornical organ on water intake. Pharmacol Biochem Behav, 1984, 20, 301~306.
[9]Terrel ML, Kadekaro M, Freeman S. Effects of chemical stimulation of the SFO on metabolic activity of the hypothalamo-neurohypophysial system in rats. Neurosci Lett, 1991, 134 (1):122~126.
, http://www.100md.com
[10]Smith PM, Beniner RJ, Ferguson AV. Subfornical organ stimulation elicits drinking. Brain Res Bull, 1995, 38 (3):209~313.
[11]Herbert J. Studying the central actions of angiotensin using the expression of immediate-early genes: expectations and limitations. Regul Pept,1996, 66: 13~18.
[12]Jane JM, Herbert J, Fitzsimons JT. Increased sodium appetite stimulates c-fos expression in the organ vasculosum of the lamina terminalis. Neuroscience, 1997, 78 (4):1167~1176.
, 百拇医药
[13]Miselis RR. The efferent projections of the subfornical organ of the rat: a circumventricular organ within a neural network subserving water balance. Brain Res, 1981, 230: 1~23.
[14]Swanson LW, Lind RW. Neural projections subserving the initiation of a specific motivated behavior in the rat: new projections from the subfornical organ. Brain Res, 1986, 379: 399~403.
[15]Achaval M, Schneider FL, Reissenweber NJ, et al. Acetylcholinesterase activity in the human subfornical organ. Arch Anat Hist Embr Norm Et Exp， (1991/1992), 74: 65~76.
, http://www.100md.com
[16]Spencer DG, Horvath EJ, Traber J. Direct autoradiographic determination of M1 and M2 muscarinic acetylcholine receptor distribution in the rat brain: relation to cholinergic nuclei and projections. Brain Res,1986, 380: 59~68.
[17]Ferguson AV, Kasting NW. Electrical stimulation in subfornical organ increases plasma vasopressin concentrations in the conscious rat. Am J Physiol, 1986, 251: R425~R428.
[18]Rowland NE, Li BH, Rozelle AK et al. Comparison of Fos-like immunoreactivity induced in rat brain by central injection of angiotensin Ⅱ and carbachol. Am J Physiol, 1994, 267(36):R792~R798.
, 百拇医药
[19]Ciriello.J, Gutman MB. Functional identification of central pressor pathways originating in the subfornical organ. Can J Physiol Pharmacol, 1990, 69(7):1034~1045.
[20]Swanson LW, Sharpe LG. Centrally induced drinking: comparison of angiotensin Ⅱ and carbachol sensitive sites in rats. Am J Physiol, 1973, 225 (3):R556~R573.
[21]Moellenhoff E, Lebrun CJ, Blume A et al. Central angiotensin AT1 and muscarinic receptors in ITF expression on intracerebroventricular Nacl. Am J Physiol,1998, 275(44):R234~R244.
, http://www.100md.com
[22]Block ML, Fisher A. Cholinergic and dopaminergic blocking agents modulate water intake elicited by deprivation, by hypovolemia, hypertonicity and isoproterenol. Pharmacol Biochem Behav, 1975, 3: 251~262.
[23]Lee WJ, Kim KS, Yang EK et al. Effect of brain angiotensin Ⅱ AT1, AT2 and cholinergic receptor antagonism on drinking in water-deprived rats. Regul Pept, 1996, 66: 41~46.
[24]Wright JW, Roberts KA, Stubley LA et al. Hypothalamic angiotensin release in response to Ang Ⅱ or glutamatic acid stimulation of the SFO in rats. Brain Res Bull, 1993, 31 (6):649~654.
[25]Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Sydney: Sydney Academic Press, 1982., 百拇医药
关键词：穹窿下器官；饮水行为；c-fos；阿托品
摘要：实验以饮水行为及脑内c-fos表达为指标, 观察刺激大鼠穹窿下器官(SFO)的效应。结果显示, 刺激SFO能诱发明显的饮水行为, 与此同时, 前脑8个部位(终板血管器官、正中视前核、室旁核、视上核、下丘脑外侧区、穹窿周核背侧区、丘脑联合核和无名质)和后脑3个部位(最后区、孤束核和臂旁外侧核)的Fos蛋白表达明显增强。免疫组化双重染色结果显示, 刺激SFO能诱导视上核和室旁核中部分神经元呈Fos蛋白和加压素共同表达。脑室注射阿托品能部分阻断刺激SFO诱发的饮水行为, 脑内上述各部位所诱导的Fos蛋白表达也明显减弱。以上结果提示, M胆碱能机制参与刺激SFO诱发的饮水行为和脑内Fos蛋白的表达。
饮水行为在体液平衡调节中起重要作用[1], 其中枢调节机制尚不完全清楚。穹窿下器官(subfornical organ, SFO)是最早明确和饮水行为有关的一个室周器官, 被认为是整合外周和中枢体液平衡信号的关键部位[1~4]。SFO参与低血容量性脱水、细胞性脱水以及混合性脱水诱发的饮水[1,5,6]。多种致渴因子(如血管紧张素Ⅱ, 氨甲酰胆碱)注射到SFO以及电刺激该部位都能诱发饮水[6~10]。
, 百拇医药
c-fos是一种即刻快速反应基因, 可被神经递质、电刺激等多种刺激诱导而快速表达, 并作为神经元激活的标志。80年代末90年代初, c-fos技术被用于渴机制的研究, 并已成为研究饮水行为中枢机制的一种重要工具[11,12]。
形态学研究表明, SFO和许多脑区之间存在直接的神经联系。如正中视前核(median preoptic nucleus, MnPO)、终板血管器官(organum vasculosum of the lamina terminalis, OVLT)、室旁核(paraventricular nucleus, PVN)、视上核(supraoptic nucleus, SON)、臂旁外侧核(lateral parabrachial nucleus, LPBN)、孤束核(solitary tract nucleus, NST)[5,13,14]等。行为学研究已表明, 这些脑区和饮水行为有关[5]; 最近有报道, 向SFO微量注射血管紧张素Ⅱ、氨甲酰胆碱或血管紧张素I在诱发饮水的同时, 可诱导这些脑区的2-DG摄取或Fos蛋白表达[7,9], 但是刺激SFO能否诱导这些脑区的Fos蛋白表达, 至今还未见报道。
, 百拇医药
SFO内有胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)免疫反应阳性神经元[3,5,15]和胆碱能传入神经末梢[16]。在和SFO有联系的许多与饮水有关的核团内, 也都有胆碱能神经支配[16]; 但胆碱能机制是否参与刺激SFO的效应有待确定。
为此, 我们观察刺激SFO诱导的饮水行为和脑内Fos蛋白表达, 以及脑室注射阿托品对其的影响, 旨在探讨刺激SFO诱发饮水行为和脑内Fos蛋白表达的胆碱能机制。此外, 实验中还观察了刺激SFO诱导的PVN 和SON中加压素(vasopressin,VP)能神经元激活的情况。
1材料和方法
1.1 实验动物和分组实验用雄性Sprague-Dawley成年大鼠(210~250 g), 由苏州大学实验动物中心提供。在正常温控光照与自由摄食饮水条件下饲养一周后进行实验。实验分两部分: (1)刺激SFO。动物随机分为三组: SFO刺激组和两个对照组(SFO假刺激组、非SFO刺激组)。假刺激组的实验操作除刺激器不开通外, 其他步骤与刺激组相同; 非SFO刺激组的刺激部位在SFO以外, 其他步骤同刺激组。(2)脑室注射阿托品后刺激SFO。动物随机分为两组, 侧脑室注射阿托品+刺激SFO的实验组和侧脑室注射生理盐水+刺激SFO的对照组。
, 百拇医药
1.2 实验动物的准备
1.2.1 手术操作(1)SFO内埋电极: 大鼠经4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉后, 固定于立体定向仪上, 沿矢状轴作正中切口, 参照Paxinos和Watson图谱, 在颅骨表面定点, 用牙钻打孔, 将同心圆单极刺激电极埋植到SFO, 坐标为: Bregma -0.85~-0.9 mm, 颅骨表面下4.85~5.35 mm (非SFO刺激组的电极埋植到4.15~4.55 mm)。电极外径为0.4 mm, 内芯尖端裸露250 μm。电极用牙科水泥固定于颅骨表面。(2)侧脑室埋套管: 侧脑室定位坐标为Bregma -1.0 mm, L1.5 mm, 颅骨表面下3.5 mm, 埋入的套管外径为0.8 mm, 和SFO刺激电极一起用牙科水泥固定于颅骨表面。(3)术后训练: 术后3 d内给动物肌注青霉素4万U/只。在恢复期5 d内, 每天08∶00~12∶00之间, 使大鼠熟悉实验操作过程8~10 min, 以减少应激影响。
, 百拇医药 1.2.2 实验操作(1)刺激SFO: 实验在08∶00~12∶00进行。动物在自由活动状态下, 通过埋植的电极对SFO进行电刺激。刺激方波为: 100 μA,10 Hz,1 ms, 刺激5 min。观察刺激后出现饮水行为的动物数, 从各组动物的总数中计算出诱饮率, 并记录刺激后1 h内的饮水量(从刻度滴管读取)和饮水次数。(2)脑室注射阿托品: 在刺激SFO前10 min, 将套管内芯抽出, 插入微量注射针头进行注射, 注射速度为1 μl/1 min, 留针时间至少1 min。给药10 min后刺激SFO(参数同前), 并计算诱饮率、1 h内饮水量和饮水次数。阿托品(北京制药厂)用0.9%的生理盐水配置, 注射量为15 nmol/3 μl,对照组注射生理盐水的容量同阿托品注射组。
1.3 免疫组化(1)Fos免疫组化: 刺激SFO后1 h, 用过量麻醉处死大鼠, 开胸, 经左心室快速灌流0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)100 ml, 接着灌注4%多聚甲醛(PFA)100 ml。取全脑置于4% PFA中后固定6 h, 转入20%蔗糖过夜, 次日作连续冰冻切片(40~60 μm), 参照脑图谱的核团范围, 每隔2张取1张切片, 放入PBS漂洗2次, 转入Fos抗体(兔抗鼠, 多克隆抗体, 浓度1∶3?000, 上海华美制剂公司)中孵育16 h, PBS漂洗2次后转入羊抗兔生物素化二抗IgG (1∶200, Vector公司)中1~2 h, PBS漂洗2次, 移入亲和素生物素试剂(avidin-biotin complex, ABC, 1∶200, Vector公司)1~2 h, 最后用0.05% DAB和0.02% H2O2显色。(2)双重染色: 选取刺激SFO组含有PVN和SON的切片, 在Fos免疫组化操作至DAB显色后, 置于VP抗体(1∶1?000, 兔抗大鼠多克隆抗体, Instar公司)16 h, 经PBS漂洗2次, 相继浸入二抗和ABC(1∶200, 0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制), 磷酸缓冲液漂洗2次后, 再用醋酸钠缓冲液漂洗1次, 最后用加硫酸镍的DAB和0.03% H2O2显色, 终止显色反应后, 贴片风干, 经二甲苯透明处理后用树胶封片。在25×10光镜下观察, 细胞核呈棕褐色沉着的为Fos样免疫反应(Fos-like immunoreactivity, FLI)阳性神经元, 胞浆呈灰蓝色的为VP免疫反应阳性神经元, 计算每个核团中相同平面与视野内FLI阳性神经元数和VP免疫反应阳性神经元数, 需要时摄片。
, 百拇医药
1.4 统计处理实验数据用mean±SE表示, 用SPSS统计软件包作ANOVA, 用Fisher′s Exact test 作诱饮率的比较, 用Excel 97制成图表。
2结果
2.1 刺激SFO诱发的饮水行为
SFO刺激组的8只大鼠中有6只出现饮水行为, 诱饮率为75%, 平均1 h内饮水次数为1.25±1.09, 饮水量为0.28±0.22 ml。两个对照组无一出现饮水, 诱饮率为0, 平均1 h内饮水次数和饮水量均为0。将SFO刺激组和两个对照组(非SFO刺激组和假刺激组)相比较, 诱饮率、饮水次数和饮水量都有显著差异(P<0.01)。说明刺激SFO能诱发明显的饮水行为, SFO是一个和饮水有关的部位。
2.2 刺激SFO诱发的脑内Fos蛋白表达
, http://www.100md.com
刺激SFO使前脑8个脑区和后脑3个脑区的Fos蛋白明显表达。前脑8个部位是终板血管器官(OVLT)、正中视前核(MnPO)、室旁核(PVN)、视上核(SON)、下丘脑外侧区(LHA)、穹窿周核背侧区(pefd)、丘脑联合核(Re)和无名质(SI); 后脑的3个部位是最后区(AP)、NST和LPBN。两个对照组的这些脑区或者没有或者只有很少量(0~10个)的FLI阳性神经元。SFO刺激组与这两个对照组相比, 差别都非常明显(P<0.01)。结果表明, 刺激SFO在诱发饮水行为的同时, 能激活脑内与饮水有关的一些核团。
2.3 刺激SFO激活PVN和SON神经元的化学性质
双染的实验结果显示, 刺激SFO诱发PVN和SON的FLI-阳性神经元中都有一部分同时呈VP免疫反应阳性。在PVN中这种共同表达Fos蛋白和VP的神经元占全部FLI-阳性神经元的(7.0±0.6)%, 在SON则占到(20.8±2.0)%。
, http://www.100md.com
2.4 脑室注射阿托品对刺激SFO效应的影响
脑室注射阿托品后刺激SFO, 在14只动物中有5只出现饮水, 诱饮率为35.71%。而脑室注射生理盐水后刺激SFO, 在11只动物中有8只出现饮水, 诱饮率为72.73%, 高于阿托品组。阿托品组平均1 h饮水次数为0.43±0.65, 饮水量为0.06±0.11 ml, 明显少于对照组的饮水次数(1.09±0.94)和饮水量(0.27±0.25 ml)(P<0.05)。 表明脑室注射阿托品能明显抑制刺激SFO所诱发的饮水行为。
在所观察的前、后脑11个部位中, 预先脑室注射阿托品可使刺激SFO诱导的Fos蛋白表达量减少, 除AP以外, 都有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。实验结果表明, 阿托品在抑制饮水的同时, 能使刺激SFO诱导的绝大部分脑区的Fos蛋白表达明显减少。
3讨论
, http://www.100md.com
SFO是一个与饮水有关的重要脑区。由于它是一个缺乏血脑屏障的脑区, 并位于第三脑室上方[1,2], 因此对外周和中枢的多种致渴刺激都能发生反应而诱发饮水行为[1,5~10]。外周注射、脑室注射、向SFO微量注射血管紧张素Ⅱ或氨甲酰胆碱都能诱发饮水[5,8,9,18]。近年来发现, SFO含有血管紧张素Ⅱ受体和M-胆碱受体[3~5]。所以一般认为, 上述这些致渴因子诱发饮水是作用于相应受体的神经元。本实验刺激SFO也能诱发明显的饮水行为, 这与Smith刺激SFO能诱发饮水的实验结果[10]基本一致。看来, 电刺激很可能激活了SFO内多种神经元, 从而诱发饮水。
c-fos是即刻快速反应基因的一种, 能被多种刺激诱导而在神经元内表达。以往用c-fos技术研究中枢渴机制的文献表明, 脑室注射各种致渴因子或向SFO微量注射血管紧张素I在诱发饮水反应的同时, 能诱导一些脑区Fos蛋白表达[7,18]。这些脑区包括第三脑室前腹侧壁(AV3V)中的MnPO和OVLT、下丘脑外侧区、视上核和室旁核、Re、SI以及脑干的NST、LPBN和AP等。刺激SFO还能使上述一些脑区2-DG摄取量变化[9,19]。顺行和逆行束路追踪法表明, SFO和上述脑区之间有神经联系[5,13,14]。用药理学方法阻断上述致渴刺激诱发饮水的同时, 也使c-fos的表达抑制[5,21,23]。其他研究方法也支持这些部位和饮行为有关[5,20]。这些资料说明, 致渴因子诱发的饮水和这些c-fos表达的脑区有关。本实验直接电刺激SFO也能诱发饮水行为和上述广泛脑区的Fos蛋白表达明显增加, 提示刺激激活了SFO中多种神经元而通过传出联系兴奋了这些与饮水调节有关的核团。至于c-fos表达与饮水行为之间的关系, 迄今尚未完全明了。Herbert认为c-fos表达和饮水行为之间可能不存在直接的关系[11], 但他和大多数学者都认为, c-fos表达为研究和饮水行为有关的神经元活动提供了一个技术窗口, 可以用它来分析致渴刺激诱发饮水行为的脑机制[5,11]。我们的实验结果尚无法明确c-fos表达和饮水行为之间的确切关系, 但它的表达可从一个侧面反映刺激SFO诱发饮水行为的中枢机制。
, http://www.100md.com
下丘脑PVN 和SON是和饮水机制有密切关系的部位。以往解剖学和电生理学研究表明SFO和这两个部位有直接神经联系[13,14]。有资料表明, 致渴因子能激活PVN和SON中的VP能神经元[7,21], 电刺激SFO能使外周VP增加[17]。本实验进一步证明, 刺激SFO可激活PVN和SON中的一部分VP能神经元参与饮水反应, 因而提示, 刺激SFO既能诱发饮水行为, 又能促使VP分泌, 以维持体液平衡。
中枢胆碱能通路是介导饮水行为的神经通路之一, 其效应主要由M受体介导[8,21~23]。SFO内存在ChAT免疫反应阳性神经元[2,3], 与SFO有联系的和饮水有关的脑区大都有胆碱能神经支配和M受体分布[16]。拟胆碱药物氨甲酰胆碱注射到SFO能诱发饮水, 阿托品可阻断此效应[8]。将氨甲酰胆碱注射到和SFO有神经联系的前脑部位, 也能诱发饮水行为[20]。在我们的实验中, 用阿托品可部分阻断刺激SFO诱发的饮水行为, 还能使参与饮水的脑区内的Fos蛋白表达减弱, 说明刺激SFO可通过胆碱能通路实现其效应。由于阿托品未能完全阻断刺激SFO诱发的效应, 提示还有其他性质(如AngⅡ通路[5,24])的通路参与, 这有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Gross PM. The subfornical organ as a model of neurohumoral integration. Brain Res Bull, 1985, 15 (1): 65~70.
[2]Dellmann HD. Structure of the subfornical organ: A review. Micro Res Tech, 1998, 41: 85~97.
[3]Weindl A, Bufler J, Winkler B et al. Neurotransmitters and receptors in the subfornical organ: Immunohistochemical and electrophysiological evidence. Prog Brain Res, 1992, 91: 261~269.
, 百拇医药
[4]Yang LM (杨丽明), Wang ZA (王志安), He RR (何瑞荣). Effects of angiotensin Ⅱ, atrial natriuretic peptide and arginine vasopressin on activity of subfornical organ neurons in rat brain slices. Acta Physiol Sin (生理学报),1993, 45 (3): 246~254 (Chinese， English abstract).
[5]Fitzsimons JT. Angiotensin, thirst and sodium appetite. Physiol Rev, 1998, 78 (3): 586~685.
[6]Lind RW, Thunhorst RL, Johnson AK. The subfornical organ and the integration of multiple factors in thirst. Physiol Behav, 1984, 32: 69~74.
, 百拇医药
[7]Xu ZC, Jiang XH. Drinking and Fos-immunoreactivity in rat brain induced by local injection of angiotensin I into the subfornical organ. Brain Res,1999, 817: 67~74.
[8]Menani JW, Saad WA. Effect of cholinergic and adrenergic stimulation of the subfornical organ on water intake. Pharmacol Biochem Behav, 1984, 20, 301~306.
[9]Terrel ML, Kadekaro M, Freeman S. Effects of chemical stimulation of the SFO on metabolic activity of the hypothalamo-neurohypophysial system in rats. Neurosci Lett, 1991, 134 (1):122~126.
, http://www.100md.com
[10]Smith PM, Beniner RJ, Ferguson AV. Subfornical organ stimulation elicits drinking. Brain Res Bull, 1995, 38 (3):209~313.
[11]Herbert J. Studying the central actions of angiotensin using the expression of immediate-early genes: expectations and limitations. Regul Pept,1996, 66: 13~18.
[12]Jane JM, Herbert J, Fitzsimons JT. Increased sodium appetite stimulates c-fos expression in the organ vasculosum of the lamina terminalis. Neuroscience, 1997, 78 (4):1167~1176.
, 百拇医药
[13]Miselis RR. The efferent projections of the subfornical organ of the rat: a circumventricular organ within a neural network subserving water balance. Brain Res, 1981, 230: 1~23.
[14]Swanson LW, Lind RW. Neural projections subserving the initiation of a specific motivated behavior in the rat: new projections from the subfornical organ. Brain Res, 1986, 379: 399~403.
[15]Achaval M, Schneider FL, Reissenweber NJ, et al. Acetylcholinesterase activity in the human subfornical organ. Arch Anat Hist Embr Norm Et Exp， (1991/1992), 74: 65~76.
, http://www.100md.com
[16]Spencer DG, Horvath EJ, Traber J. Direct autoradiographic determination of M1 and M2 muscarinic acetylcholine receptor distribution in the rat brain: relation to cholinergic nuclei and projections. Brain Res,1986, 380: 59~68.
[17]Ferguson AV, Kasting NW. Electrical stimulation in subfornical organ increases plasma vasopressin concentrations in the conscious rat. Am J Physiol, 1986, 251: R425~R428.
[18]Rowland NE, Li BH, Rozelle AK et al. Comparison of Fos-like immunoreactivity induced in rat brain by central injection of angiotensin Ⅱ and carbachol. Am J Physiol, 1994, 267(36):R792~R798.
, 百拇医药
[19]Ciriello.J, Gutman MB. Functional identification of central pressor pathways originating in the subfornical organ. Can J Physiol Pharmacol, 1990, 69(7):1034~1045.
[20]Swanson LW, Sharpe LG. Centrally induced drinking: comparison of angiotensin Ⅱ and carbachol sensitive sites in rats. Am J Physiol, 1973, 225 (3):R556~R573.
[21]Moellenhoff E, Lebrun CJ, Blume A et al. Central angiotensin AT1 and muscarinic receptors in ITF expression on intracerebroventricular Nacl. Am J Physiol,1998, 275(44):R234~R244.
, http://www.100md.com
[22]Block ML, Fisher A. Cholinergic and dopaminergic blocking agents modulate water intake elicited by deprivation, by hypovolemia, hypertonicity and isoproterenol. Pharmacol Biochem Behav, 1975, 3: 251~262.
[23]Lee WJ, Kim KS, Yang EK et al. Effect of brain angiotensin Ⅱ AT1, AT2 and cholinergic receptor antagonism on drinking in water-deprived rats. Regul Pept, 1996, 66: 41~46.
[24]Wright JW, Roberts KA, Stubley LA et al. Hypothalamic angiotensin release in response to Ang Ⅱ or glutamatic acid stimulation of the SFO in rats. Brain Res Bull, 1993, 31 (6):649~654.
[25]Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Sydney: Sydney Academic Press, 1982., 百拇医药