氯氨酮和L-NAME抑制模拟高原低氧大鼠下丘脑NOS和生长抑素mRNA的表达
第三军医大学神经生物学教研室； 重庆 400038 阮怀珍；范晓棠
关键词：生长抑素mRNA；NOS；NMDA受体；急性高原低氧
摘要：
用高原低氧模型及原位杂交、 NADPH-d组织化学法, 探讨氯氨酮和L-NAME对急性高原低氧大鼠下丘脑一氧化氮合酶(NOS)和生长抑素mRNA (SS mRNA)表达的影响。结果表明, 急性高原低氧引起下丘脑NOS和SS mRNA过度表达, 如先用NMDA受体拮抗剂氯氨酮和NOS抑制剂L-NAME预处理, NOS和SS mRNA的表达均明显被抑制。结果提示, NMDA受体参与了急性高原低氧引起的下丘脑NOS和SS mRNA的表达, 可能与下丘脑内源性一氧化氮介导SS mRNA的表达有关。
缺氧可引起脑内兴奋性氨基酸, 特别是谷氨酸、 天门冬氨酸的大量释放[1], 通过NMDA受体影响中枢神经系统的生理和病理反应。 一氧化氮(NO)作为一种非典型性信息分子介导了与NMDA受体激活相关的生理过程, 并发现下丘脑内源性NO参与下丘脑多种神经递质的释放[2]。本文主要探讨NMDA受体激活是否参与急性高原低氧后下丘脑一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和生长抑素mRNA (somatostatin mRNA, SS mRNA)的表达, 及下丘脑内源性NO是否介导SS mRNA的表达。
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1 材料和方法
1.1 动物模型及分组 Wistar大鼠66只, 体重150～200 g, 由本校实验动物中心提供。如下随机分为: (1) 对照组(室温20℃, 常氧); (2) 低温低氧组(1、 7 d), 将动物置于模拟海拔6000 m的低压舱内(温度为4℃), 每天6 h; (3)单纯低氧组(1、 7 d), 舱内温度为20℃。(4)单纯低温组(1、 7d), 室内温度4℃, 常氧。(5) 氯氨酮+低温低氧组(1、 7 d)。 (6) L-NAME+低温低氧组(1、 7 d)。
1.2 生长抑素mRNA原位杂交法 实验毕, 按常规进行大鼠脑组织灌流、 固定, 取出下丘脑, 行冠状连续切片(35 μm), 然后以地高辛标记的反义cRNA探针 (400 bp)按文献[3]叙述步骤进行原位杂交前、 杂交和杂交后处理(杂交过程中的温度是恒定的, 不需要调节)。抗地高辛抗体工作浓度为1∶1000, 以NBT∶BCIP (400 μg/ml∶200 μg/ml)反应液显色。对照实验包括用2 μg/mg RNA酶A预处理切片30 min和用不含探针杂交缓冲液杂交, 结果均检测不到明显的杂交信号。
, 百拇医药
1.3 NADPH-d组织化学 游离的组织切片, 经0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.3)漂洗后与含有0.1% NADPH-d, 0.01% NBT和0.3% Triton X-100的0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.3)孵育60 min(37℃)。该反应用冷的TBS终止。
1.4 数据处理 在每一动物同一部位的下丘脑切片随机抽样4片, 经图像分析仪, 作阳性细胞计数(整个核团), 取均数作为该动物的SS mRNA数或NOS数。数据以x±s表示, 用电子计算机经双样本t检验程序(PDA-2)进行处理。
2 结果
2.1 急性高原低氧对大鼠下丘脑NOS的影响
正常大鼠下丘脑内NOS阳性神经元分布弥散, 数量较少, 而在低温低氧及单纯低氧大鼠下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)的大细胞部, 视上上核(supraoptic nucleus, SON)有密集深染的NOS阳性神经元, 室旁核的小细胞部、 背内侧核、 腹内侧核、 弓状核、 外侧区、 室周区、 乳头体前核可见深浅不一、 疏密不等的NOS阳性细胞。从表1可以看出下丘脑室旁核、 视上核NOS阳性神经元数在低温低氧1 d即达峰值, 7 d仍维持较高的水平。而单纯低温对大鼠下丘脑NOS阳性神经元的分布及数量无明显影响, 与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。用NMDA受体阻滞剂氯氨酮(ip, 40 mg/kg; ketemine), NOS抑制剂N-nitro-l-arginine methyl ester (ip, 30 mg/kg; L-NAME), 对高原低氧大鼠进行预处理, 30 min后置于低压氧舱内6 h, 观察到大鼠下丘脑NOS阳性神经元数较相应时间的高原低氧组明显减少(表1)。
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表1. 高原低氧对大鼠下丘脑室旁核、 视上核NOS阳性神经元数的影响
Table 1. Effects of altitude hypoxia on the numbers of NOS positive neurons in the hypothalamic PVN and SON
Group
PVN
SON
Control
22.3±2.4
27.2±2.7
Hypothermia
, 百拇医药
1 d
28.9±5.5
24.7±3.3
Hypothermia
7 d
26.8±6.4
26.9±4.1
Hypoxia
1 d
149.6±4.9**
80.6±5.8**
Hypoxia
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7 d
133.9±6.9**
82.4±4.6**
Hypothermia hypoxia
1 d
135.5±5.2**
75.6±5.1**
Hypothermia hypoxia
7 d
138.4±6.6**
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78.0±5.8**
Hypothermia hypoxia
1 d+Ket
35.2±2.5##
38.8±3.3##
Hypothermia hypoxia
7 d+Ket
45.9±3.9▲▲
42.1±3.8▲▲
Hypothermia hypoxia
, 百拇医药
1 d+L-NAME
15.2±2.4 ##
8.8±3.2##
Hypothermia hypoxia
7 d+L-NAME
16.6±3.8##
9.7±4.1##
2.2 高原低氧对大鼠下丘脑SS mRNA表达的影响
从原位杂交组织切片观察到正常大鼠下丘脑仅有少量的SS mRNA阳性神经元, 低温低氧组大鼠下丘脑室周核(periventricular nucleus, PeN)、 室旁核(PVN)和弓状核(arcuate nucleus, ARC) SS mRNA阳性神经元数较正常对照组明显增多(P<0.01), 且在1 d即达峰值, 7 d仍维持这一较高水平(表2; 图2A, B, 见图版Ⅱ)。单纯低氧组大鼠下丘脑室周核、 室旁核和弓状核SS mRNA阳性神经元分布与数目与低温低氧组相似, 而单纯低温对大鼠下丘脑SS mRNA阳性神经元无明显影响, 与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。 用NMDA受体阻滞剂氯氨酮(ip, 40 mg/kg)和一氧化氮合酶阻滞剂L-NAME(ip, 30 mg/kg) 对低氧大鼠进行预处理, 观察到下丘脑SS mRNA神经元数较相应时间低氧组大鼠明显减少(P<0.01, 表2, 图2C, D, 见图版Ⅱ)。
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表2. 高原低氧对大鼠下丘脑室周核、 室旁核和弓状核SS mRNA阳性神经元数的影响
Table 2. Effect of altitude hypoxia on the numbers of SS mRNA positive neurons in the hypothalamic PeN, PVN and ARC
Group
PeN
PVN
ARC
Control
18.3±1.5
11.0±2.7
, 百拇医药
12.1±0.9
Hypothermia
1 d
20.5±4.7
14.5±3.4
10.9±2.8
Hypothermia
7 d
22.3±3.7
13.8±4.4
11.9±4.6
Hypoxia
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1 d
42.3±4.1**
22.1±3.5**
17.9±2.0**
Hypoxia
7 d
43.0±4.7**
23.4±3.0**
14.9±2.9**
Hypothermia hypoxia
, 百拇医药
1 d
45.2±4.0**
23.5±2.2**
19.2±3.4**
Hypothermia hypoxia
7 d
44.9±3.1**
24.5±1.8**
21.9±2.9**
Hypothermia hypoxia
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1 d+Ket
24.5±4.1##
15.0±1.9##
14.5±4.7##
Hypothermia hypoxia
7 d+Ket
22.0±1.9▲▲
12.3±3.3▲▲
10.2±1.9▲▲
Hypothermia hypoxia
, http://www.100md.com
1 d+L-NAME
25.5±4.2##
18.6±2.1##
11.9±3.6##
Hypothermia hypoxia
7 d+L-NAME
27.3±3.3▲▲
17.9±4.1▲▲
16.6±2.8▲▲
Mean±SD, n=6; **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs 1 d of hypothermia hypoxia; ▲▲P<0.01 vs 7 d of hypothermia hypoxia.
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3 讨论
大量的研究表明缺氧可致脑内氨基酸释放增加, 尤其是谷氨酸和天门冬氨酸大量释放, 可过度激活NMDA受体, 从而介导了兴奋性氨基酸的神经毒性作用, 通过NMDA受体激活电压门控Ca2+通道, 促使Ca2+病理性内流增加, 细胞内Ca2+的积聚导致神经元发生退行性改变和坏死[4,5]。NO作为一种非典型的神经递质和信息分子, 介导了许多与NMDA受体激活相关的生理、 病理过程, 如参与海马和皮层的长时程增强和抑制及脑缺血、 脑损伤的毒性作用[6]。 本文应用模拟高原低氧模型观察到下丘脑内NOS的强烈表达, NADPH-d组化法可见下丘脑室旁核、 视上核密集深染的NOS阳性神经元, 而NMDA受体阻滞剂氯氨酮可翻转低氧诱导的大鼠下丘脑NOS的表达, 说明缺氧引起下丘脑NOS的激活依赖于谷氨酸激活NMDA受体。并且, 该作用是通过增加细胞内钙激活NOS, 从而引起NO的合成和释放。大量的证据表明, NO的过量产生有神经毒性作用。NMDA受体拮抗剂有神经保护作用[7, 8], 目前认为， ketamine具有神经保护作用是由于它能较强地调节细胞内钙水平, 抑制NMDA受体的过度激活, 减少NO的产生, 从而减轻神经元的进行性溃变和坏死[9]。
, 百拇医药
生长抑素是一种作用广泛、 功效很强的神经递质或神经调节物, 它参与了机体多种生理功能的活动和调节。在体实验已经证实大鼠下丘脑正中隆起水平生长抑素的释放受各种应激(寒冷[10]、 电休克[11]、 乙醚刺激[12]、 制动[13])因素影响, 发生快速反应性释放增加。这些反应是通过快神经递质介导的, 谷氨酸是神经系统主要的兴奋性快神经递质。文献报道, 谷氨酸可快速而强烈刺激原代培养的下丘脑神经元生长抑素的释放。CGS19755, 一种NMDA受体的特异拮抗剂, 可翻转该作用, 表明谷氨酸可通过NMDA受体刺激生长抑素的释放[14]。海马脑片的电压箝记录表明谷氨酸激活NMDA受体增强生长抑素神经元的兴奋性[15]。目前研究证实, NMDA可引起下丘脑神经元生长抑素含量增加及稳定状态的生长抑素mRNA升高。本文运用NMDA受体阻滞剂ketamine对高原低氧大鼠进行预处理, 可见下丘脑SS mRNA 神经元数较高原低氧组大鼠明显减少, 说明谷氨酸激活NMDA受体与低氧大鼠下丘脑内生长抑素的合成密切相关。
谷氨酸不仅可直接兴奋下丘脑内生长抑素神经元, 而且可能通过NO调节生长抑素能神经元生长抑素的合成与释放。近来的研究结果表明下丘脑内源性的NO刺激下丘脑生长抑素的释放。GRF(生长抑素释放抑制素)可激活NOS, NO大量释放并弥散至相邻的生长抑素能神经元激活鸟苷酸环化酶, 使cGMP水平增高, 进而引起下丘脑室旁核SS mRNA含量增加。本实验运用NOS阻滞剂L-NAME对高原低氧的大鼠进行预处理, 下丘脑内SS mRNA 神经元数明显减少, 说明NO-cGMP通路可能介导了低氧大鼠下丘脑内生长抑素的合成。
, 百拇医药
总之, 急性高原低氧可激活NMDA受体, 一方面增加低氧大鼠下丘脑生长抑素mRNA的表达, 另一方面激活下丘脑内NOS产生NO, 进一步介导下丘脑内生长抑素的释放与合成。
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39670283)
Corresponding author. Tel: 023-68752233; E-mail: hzrun61@yahoo.com
阮怀珍(第三军医大学神经生物学教研室, 重庆 400038)
范晓棠(第三军医大学神经生物学教研室, 重庆 400038)
参 考 文 献
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[1] Krajnc D, Neff NH, Hadjiconstantinou M. Glutamate, glutamine and glutamine synthetase in the neonatal rat brain following hypoxia. Brain Res, 1996, 707 (1): 134～137.
[2] Moretto M,Lopez FJ,Vilar AN. Nitric oxide regulates luteinizing hormone-releasing hormone secretion. Endocrinology, 1993, 133: 2399～2402.
[3] Ruan HZ (阮怀珍), Li XC (李希成), Cai WQ (蔡文琴). Substance P and formalin enhance prepro-somatostin mRNA expression in the spinal cord of rats. Chin J Neurosci, 1998, 14 (2):105～108.
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[4] Frandsen A, Schousboe A. Excitatory amino acid-mediated cytotoxicity and calcium homeostasis in cultured neurons. J Neurochem, 1993, 60: 1202～1211.
[5] Cazevieille C, Safa R, Osborne NN. Melatonin protects primary cultures of rat cortical neurones from NMDA excitotoxicity and hypoxia reoxygenation. Brain Res, 1997, 768 (1-2):120～124.
[6] Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J, 1992, 6: 3051～3064.
, 百拇医药
[7] Choi DW. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron, 1988, 1: 623～634.
[8] Meldrum B, Garthwaite J. Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol Sci, 1990, 11: 379～387.
[9] Pfenninger E, Himmelseher S. Neuroprotection by ketamine at the cellular level. Anaesthesist, 1997, 46 (Suppl 1): S47～54.
[10] Arancibia S, Tapia-Arancibia L. Effect of acute exposure to cold on SRIF release in unanesthetized rats and its temporal correlation with the cold induced TRH peak. Exp Clin Endocrinol, 1987, 6: 265～268.
, 百拇医药
[11] Benyassi A, Gavalda A, Armario A et al. Role of Somatostatin in the acute immobilization stress-induced GH decrease in rat. Life Sci, 1993, 52: 361～370.
[12] Arimura A, Smith WD, Schally AV et al. Blockade of the stress-induced decrease in blood GH by anti-somatostatin serum in rats. Endocrinology, 1976, 98: 540～543.
[13] Aguila MC, Pickle RL, Yu WH et al. Roles of somatostatin and growth hormone-releasing factor in ether stress inhibition of growth hormone-release. Neuroendocrinology, 1991, 54: 515～520.
, 百拇医药
[14] Rage F, Benyassi A, Arancibia S et al. Gamma-aminobutyric acid-glutamate interaction in the control of somatostatin release from hypothalamic neurons in primary culture: in vivo corroboration. Endocrinology, 1992, 130 (2): 1056～1062.
[15] Fontana-G, De-Bernardi-R, Ferro-F et al. Characterization of the glutamate receptors mediating release of somatostatin from cultured hippocampal neurons. J Neurochem, 1996, 66 (1): 161～168.
Received 1999-07-05 Revised 1999-12-05, 百拇医药
关键词：生长抑素mRNA；NOS；NMDA受体；急性高原低氧
摘要：
用高原低氧模型及原位杂交、 NADPH-d组织化学法, 探讨氯氨酮和L-NAME对急性高原低氧大鼠下丘脑一氧化氮合酶(NOS)和生长抑素mRNA (SS mRNA)表达的影响。结果表明, 急性高原低氧引起下丘脑NOS和SS mRNA过度表达, 如先用NMDA受体拮抗剂氯氨酮和NOS抑制剂L-NAME预处理, NOS和SS mRNA的表达均明显被抑制。结果提示, NMDA受体参与了急性高原低氧引起的下丘脑NOS和SS mRNA的表达, 可能与下丘脑内源性一氧化氮介导SS mRNA的表达有关。
缺氧可引起脑内兴奋性氨基酸, 特别是谷氨酸、 天门冬氨酸的大量释放[1], 通过NMDA受体影响中枢神经系统的生理和病理反应。 一氧化氮(NO)作为一种非典型性信息分子介导了与NMDA受体激活相关的生理过程, 并发现下丘脑内源性NO参与下丘脑多种神经递质的释放[2]。本文主要探讨NMDA受体激活是否参与急性高原低氧后下丘脑一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和生长抑素mRNA (somatostatin mRNA, SS mRNA)的表达, 及下丘脑内源性NO是否介导SS mRNA的表达。
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1 材料和方法
1.1 动物模型及分组 Wistar大鼠66只, 体重150～200 g, 由本校实验动物中心提供。如下随机分为: (1) 对照组(室温20℃, 常氧); (2) 低温低氧组(1、 7 d), 将动物置于模拟海拔6000 m的低压舱内(温度为4℃), 每天6 h; (3)单纯低氧组(1、 7 d), 舱内温度为20℃。(4)单纯低温组(1、 7d), 室内温度4℃, 常氧。(5) 氯氨酮+低温低氧组(1、 7 d)。 (6) L-NAME+低温低氧组(1、 7 d)。
1.2 生长抑素mRNA原位杂交法 实验毕, 按常规进行大鼠脑组织灌流、 固定, 取出下丘脑, 行冠状连续切片(35 μm), 然后以地高辛标记的反义cRNA探针 (400 bp)按文献[3]叙述步骤进行原位杂交前、 杂交和杂交后处理(杂交过程中的温度是恒定的, 不需要调节)。抗地高辛抗体工作浓度为1∶1000, 以NBT∶BCIP (400 μg/ml∶200 μg/ml)反应液显色。对照实验包括用2 μg/mg RNA酶A预处理切片30 min和用不含探针杂交缓冲液杂交, 结果均检测不到明显的杂交信号。
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1.3 NADPH-d组织化学 游离的组织切片, 经0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.3)漂洗后与含有0.1% NADPH-d, 0.01% NBT和0.3% Triton X-100的0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.3)孵育60 min(37℃)。该反应用冷的TBS终止。
1.4 数据处理 在每一动物同一部位的下丘脑切片随机抽样4片, 经图像分析仪, 作阳性细胞计数(整个核团), 取均数作为该动物的SS mRNA数或NOS数。数据以x±s表示, 用电子计算机经双样本t检验程序(PDA-2)进行处理。
2 结果
2.1 急性高原低氧对大鼠下丘脑NOS的影响
正常大鼠下丘脑内NOS阳性神经元分布弥散, 数量较少, 而在低温低氧及单纯低氧大鼠下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)的大细胞部, 视上上核(supraoptic nucleus, SON)有密集深染的NOS阳性神经元, 室旁核的小细胞部、 背内侧核、 腹内侧核、 弓状核、 外侧区、 室周区、 乳头体前核可见深浅不一、 疏密不等的NOS阳性细胞。从表1可以看出下丘脑室旁核、 视上核NOS阳性神经元数在低温低氧1 d即达峰值, 7 d仍维持较高的水平。而单纯低温对大鼠下丘脑NOS阳性神经元的分布及数量无明显影响, 与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。用NMDA受体阻滞剂氯氨酮(ip, 40 mg/kg; ketemine), NOS抑制剂N-nitro-l-arginine methyl ester (ip, 30 mg/kg; L-NAME), 对高原低氧大鼠进行预处理, 30 min后置于低压氧舱内6 h, 观察到大鼠下丘脑NOS阳性神经元数较相应时间的高原低氧组明显减少(表1)。
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表1. 高原低氧对大鼠下丘脑室旁核、 视上核NOS阳性神经元数的影响
Table 1. Effects of altitude hypoxia on the numbers of NOS positive neurons in the hypothalamic PVN and SON
Group
PVN
SON
Control
22.3±2.4
27.2±2.7
Hypothermia
, 百拇医药
1 d
28.9±5.5
24.7±3.3
Hypothermia
7 d
26.8±6.4
26.9±4.1
Hypoxia
1 d
149.6±4.9**
80.6±5.8**
Hypoxia
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7 d
133.9±6.9**
82.4±4.6**
Hypothermia hypoxia
1 d
135.5±5.2**
75.6±5.1**
Hypothermia hypoxia
7 d
138.4±6.6**
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78.0±5.8**
Hypothermia hypoxia
1 d+Ket
35.2±2.5##
38.8±3.3##
Hypothermia hypoxia
7 d+Ket
45.9±3.9▲▲
42.1±3.8▲▲
Hypothermia hypoxia
, 百拇医药
1 d+L-NAME
15.2±2.4 ##
8.8±3.2##
Hypothermia hypoxia
7 d+L-NAME
16.6±3.8##
9.7±4.1##
2.2 高原低氧对大鼠下丘脑SS mRNA表达的影响
从原位杂交组织切片观察到正常大鼠下丘脑仅有少量的SS mRNA阳性神经元, 低温低氧组大鼠下丘脑室周核(periventricular nucleus, PeN)、 室旁核(PVN)和弓状核(arcuate nucleus, ARC) SS mRNA阳性神经元数较正常对照组明显增多(P<0.01), 且在1 d即达峰值, 7 d仍维持这一较高水平(表2; 图2A, B, 见图版Ⅱ)。单纯低氧组大鼠下丘脑室周核、 室旁核和弓状核SS mRNA阳性神经元分布与数目与低温低氧组相似, 而单纯低温对大鼠下丘脑SS mRNA阳性神经元无明显影响, 与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。 用NMDA受体阻滞剂氯氨酮(ip, 40 mg/kg)和一氧化氮合酶阻滞剂L-NAME(ip, 30 mg/kg) 对低氧大鼠进行预处理, 观察到下丘脑SS mRNA神经元数较相应时间低氧组大鼠明显减少(P<0.01, 表2, 图2C, D, 见图版Ⅱ)。
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表2. 高原低氧对大鼠下丘脑室周核、 室旁核和弓状核SS mRNA阳性神经元数的影响
Table 2. Effect of altitude hypoxia on the numbers of SS mRNA positive neurons in the hypothalamic PeN, PVN and ARC
Group
PeN
PVN
ARC
Control
18.3±1.5
11.0±2.7
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12.1±0.9
Hypothermia
1 d
20.5±4.7
14.5±3.4
10.9±2.8
Hypothermia
7 d
22.3±3.7
13.8±4.4
11.9±4.6
Hypoxia
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1 d
42.3±4.1**
22.1±3.5**
17.9±2.0**
Hypoxia
7 d
43.0±4.7**
23.4±3.0**
14.9±2.9**
Hypothermia hypoxia
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1 d
45.2±4.0**
23.5±2.2**
19.2±3.4**
Hypothermia hypoxia
7 d
44.9±3.1**
24.5±1.8**
21.9±2.9**
Hypothermia hypoxia
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1 d+Ket
24.5±4.1##
15.0±1.9##
14.5±4.7##
Hypothermia hypoxia
7 d+Ket
22.0±1.9▲▲
12.3±3.3▲▲
10.2±1.9▲▲
Hypothermia hypoxia
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1 d+L-NAME
25.5±4.2##
18.6±2.1##
11.9±3.6##
Hypothermia hypoxia
7 d+L-NAME
27.3±3.3▲▲
17.9±4.1▲▲
16.6±2.8▲▲
Mean±SD, n=6; **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs 1 d of hypothermia hypoxia; ▲▲P<0.01 vs 7 d of hypothermia hypoxia.
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3 讨论
大量的研究表明缺氧可致脑内氨基酸释放增加, 尤其是谷氨酸和天门冬氨酸大量释放, 可过度激活NMDA受体, 从而介导了兴奋性氨基酸的神经毒性作用, 通过NMDA受体激活电压门控Ca2+通道, 促使Ca2+病理性内流增加, 细胞内Ca2+的积聚导致神经元发生退行性改变和坏死[4,5]。NO作为一种非典型的神经递质和信息分子, 介导了许多与NMDA受体激活相关的生理、 病理过程, 如参与海马和皮层的长时程增强和抑制及脑缺血、 脑损伤的毒性作用[6]。 本文应用模拟高原低氧模型观察到下丘脑内NOS的强烈表达, NADPH-d组化法可见下丘脑室旁核、 视上核密集深染的NOS阳性神经元, 而NMDA受体阻滞剂氯氨酮可翻转低氧诱导的大鼠下丘脑NOS的表达, 说明缺氧引起下丘脑NOS的激活依赖于谷氨酸激活NMDA受体。并且, 该作用是通过增加细胞内钙激活NOS, 从而引起NO的合成和释放。大量的证据表明, NO的过量产生有神经毒性作用。NMDA受体拮抗剂有神经保护作用[7, 8], 目前认为， ketamine具有神经保护作用是由于它能较强地调节细胞内钙水平, 抑制NMDA受体的过度激活, 减少NO的产生, 从而减轻神经元的进行性溃变和坏死[9]。
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生长抑素是一种作用广泛、 功效很强的神经递质或神经调节物, 它参与了机体多种生理功能的活动和调节。在体实验已经证实大鼠下丘脑正中隆起水平生长抑素的释放受各种应激(寒冷[10]、 电休克[11]、 乙醚刺激[12]、 制动[13])因素影响, 发生快速反应性释放增加。这些反应是通过快神经递质介导的, 谷氨酸是神经系统主要的兴奋性快神经递质。文献报道, 谷氨酸可快速而强烈刺激原代培养的下丘脑神经元生长抑素的释放。CGS19755, 一种NMDA受体的特异拮抗剂, 可翻转该作用, 表明谷氨酸可通过NMDA受体刺激生长抑素的释放[14]。海马脑片的电压箝记录表明谷氨酸激活NMDA受体增强生长抑素神经元的兴奋性[15]。目前研究证实, NMDA可引起下丘脑神经元生长抑素含量增加及稳定状态的生长抑素mRNA升高。本文运用NMDA受体阻滞剂ketamine对高原低氧大鼠进行预处理, 可见下丘脑SS mRNA 神经元数较高原低氧组大鼠明显减少, 说明谷氨酸激活NMDA受体与低氧大鼠下丘脑内生长抑素的合成密切相关。
谷氨酸不仅可直接兴奋下丘脑内生长抑素神经元, 而且可能通过NO调节生长抑素能神经元生长抑素的合成与释放。近来的研究结果表明下丘脑内源性的NO刺激下丘脑生长抑素的释放。GRF(生长抑素释放抑制素)可激活NOS, NO大量释放并弥散至相邻的生长抑素能神经元激活鸟苷酸环化酶, 使cGMP水平增高, 进而引起下丘脑室旁核SS mRNA含量增加。本实验运用NOS阻滞剂L-NAME对高原低氧的大鼠进行预处理, 下丘脑内SS mRNA 神经元数明显减少, 说明NO-cGMP通路可能介导了低氧大鼠下丘脑内生长抑素的合成。
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总之, 急性高原低氧可激活NMDA受体, 一方面增加低氧大鼠下丘脑生长抑素mRNA的表达, 另一方面激活下丘脑内NOS产生NO, 进一步介导下丘脑内生长抑素的释放与合成。
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Corresponding author. Tel: 023-68752233; E-mail: hzrun61@yahoo.com
阮怀珍(第三军医大学神经生物学教研室, 重庆 400038)
范晓棠(第三军医大学神经生物学教研室, 重庆 400038)
参 考 文 献
, http://www.100md.com
[1] Krajnc D, Neff NH, Hadjiconstantinou M. Glutamate, glutamine and glutamine synthetase in the neonatal rat brain following hypoxia. Brain Res, 1996, 707 (1): 134～137.
[2] Moretto M,Lopez FJ,Vilar AN. Nitric oxide regulates luteinizing hormone-releasing hormone secretion. Endocrinology, 1993, 133: 2399～2402.
[3] Ruan HZ (阮怀珍), Li XC (李希成), Cai WQ (蔡文琴). Substance P and formalin enhance prepro-somatostin mRNA expression in the spinal cord of rats. Chin J Neurosci, 1998, 14 (2):105～108.
, http://www.100md.com
[4] Frandsen A, Schousboe A. Excitatory amino acid-mediated cytotoxicity and calcium homeostasis in cultured neurons. J Neurochem, 1993, 60: 1202～1211.
[5] Cazevieille C, Safa R, Osborne NN. Melatonin protects primary cultures of rat cortical neurones from NMDA excitotoxicity and hypoxia reoxygenation. Brain Res, 1997, 768 (1-2):120～124.
[6] Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J, 1992, 6: 3051～3064.
, 百拇医药
[7] Choi DW. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron, 1988, 1: 623～634.
[8] Meldrum B, Garthwaite J. Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol Sci, 1990, 11: 379～387.
[9] Pfenninger E, Himmelseher S. Neuroprotection by ketamine at the cellular level. Anaesthesist, 1997, 46 (Suppl 1): S47～54.
[10] Arancibia S, Tapia-Arancibia L. Effect of acute exposure to cold on SRIF release in unanesthetized rats and its temporal correlation with the cold induced TRH peak. Exp Clin Endocrinol, 1987, 6: 265～268.
, 百拇医药
[11] Benyassi A, Gavalda A, Armario A et al. Role of Somatostatin in the acute immobilization stress-induced GH decrease in rat. Life Sci, 1993, 52: 361～370.
[12] Arimura A, Smith WD, Schally AV et al. Blockade of the stress-induced decrease in blood GH by anti-somatostatin serum in rats. Endocrinology, 1976, 98: 540～543.
[13] Aguila MC, Pickle RL, Yu WH et al. Roles of somatostatin and growth hormone-releasing factor in ether stress inhibition of growth hormone-release. Neuroendocrinology, 1991, 54: 515～520.
, 百拇医药
[14] Rage F, Benyassi A, Arancibia S et al. Gamma-aminobutyric acid-glutamate interaction in the control of somatostatin release from hypothalamic neurons in primary culture: in vivo corroboration. Endocrinology, 1992, 130 (2): 1056～1062.
[15] Fontana-G, De-Bernardi-R, Ferro-F et al. Characterization of the glutamate receptors mediating release of somatostatin from cultured hippocampal neurons. J Neurochem, 1996, 66 (1): 161～168.
Received 1999-07-05 Revised 1999-12-05, 百拇医药