碱性成纤维细胞生长因子增加大鼠血管一氧化氮及内皮素的生成
姜志胜；杨永宗(衡阳医学院心血管病研究所； 衡阳 421001)；赵文；庞永政；刘乃奎；唐朝枢北京医科大学第一医院心血管研究所； 北京 100034 姜志胜；杨永宗；赵文；庞永政；刘乃奎；唐朝枢
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；自发性高血压大鼠；主动脉；一氧化氮合酶；一氧化氮；内皮素
摘要：研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠血管一氧化氮(NO)及内皮素生成的影响。取SHR和WKY大鼠主动脉制成血管薄片, 以10、100 ng/ml bFGF(终浓度)分别孵育6 h, 测定血管组织中一氧化氮合酶(NOS)活性及孵育液中亚硝酸盐(NO?2)和内皮素含量。结果显示: SHR主动脉组织NOS活性较WKY的低17.6%(P<0.01), 血管薄片孵育液中NO?2含量低59.7%(P<0.01), 内皮素浓度高37.4%(P<0.01)。在低、高浓度bFGF刺激下, SHR主动脉组织NOS活性分别增高29.7%和59.6%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), 主动脉内皮素的生成分别增加24.1%和44.5%(均P<0.01); WKY大鼠主动脉组织NOS活性分别增高24.4%和53.7%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 主动脉内皮素的产生分别增加84.1%和93.1%(均P<0.01)。结果表明: bFGF对SHR和WKY大鼠主动脉NO及内皮素的产生具有调变作用。
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碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为广泛分布于体内的一种多功能生长因子, 该因子在有丝分裂中的作用已获公认。近年来, bFGF的非丝裂作用, 特别是对血压的调节作用, 引起了人们的高度重视。有报道, 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)主动脉壁FGF表达降低, 一氧化氮合酶(nitric monoxide synthase, NOS)含量下降, 应用外源FGF或转FGF基因可引起SHR血压降低[1]; 我们亦发现, bFGF可促进血管壁一氧化氮(nitric monoxide, NO)的产生[2], 调节血管舒张功能[3]; 应用外源bFGF可显著拮抗NOS抑制剂左旋硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NNA)诱导的大鼠高血压的形成[4]。这些实验结果均提示, bFGF刺激血管壁L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)/NO系统是其调控高血压的途径之一。但高血压的形成是一个多因素参与的复杂过程, 除NO等血管舒张因子系统外, 内皮素(endothelin, ET)等血管收缩因子系统的作用亦十分重要。高血压的形成与发展取决于血管舒张与收缩因子系统的失衡。本工作在SHR和WKY大鼠离体主动脉孵育模型上观察bFGF对血管ET和NO生成的影响, 以探讨bFGF调控高血压的机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 大鼠血压测定 以1 g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。颈总动脉插管, 连接多道生理记录仪, 静息20 min后, 测定平均动脉血压(MBP)。
1.2 大鼠离体主动脉血管薄片孵育 体重250～270 g的SHR和WKY大鼠(12周龄), 以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。迅速取出主动脉, 置于冰冷的含1% BSA Krebs-Henseleit(KH)液中, 去除外膜组织, 以Tissue slicer制备约0.5 mm厚薄片, 然后将血管薄片按下述分组分别置于盛KH液的器官培养孵育管中(每管约60 mg), 于37℃、 95% O2-5% CO2条件下振摇孵育6 h。
实验分组: SHR和WKY大鼠主动脉薄片分别分为对照组(不加bFGF),低和高浓度bFGF组(分别加入bFGF 10和100 ng/ml)。
, 百拇医药
1.3 亚硝酸盐(NO?2)含量测定 取孵育液按Green等的方法[5], 以酶标仪于570 nm下测定NO?2含量。
1.4 血管壁NOS活性测定[6] 取孵育完毕的血管组织用KH液洗涤后,以Ultra-Turex T25匀浆器制备组织匀浆, 4℃下离心, 3000 r/min, 10 min。取上清液以考马斯亮蓝法测定蛋白含量, 调整蛋白浓度为2 mg/ml。取含200 μg蛋白的上清液加入100 μl孵育buffer (含32 μmol/L L-Arg和1 Ci 3H-arginine), 37℃, 振摇孵育30 min, 然后加入50 μl冰冷终止液, 摇匀, 过Dowex AG 50w-Y8柱。测定洗脱的、反应生成的3H-精氨酸的放射活性, 计算出NOS活性(pmol/mg.pr/min)。
1.5 内皮素含量测定 孵育液内皮素含量用内皮素放免药盒测定。取孵育液1 ml加抑肽酶20 μl, 混匀, 4℃ 3000 r/min离心5 min, 取上清液按下表操作。
, 百拇医药
孵育液内皮素含量测定过程(单位: μl)
NSB
S0
S1-S6
样品管
缓冲液
200
100
-
-
标准品
-
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-
100
-
样 品
-
-
-
100
抗血清
-
100
100
100
摇匀, 4℃过夜
, 百拇医药
125I-内皮素
100
100
100
100
摇匀， 4℃ 18 h以上
分离剂
1000
1000
1000
1000
加样完毕， 4℃放置30 min， 3500 r/min离心20 min， 弃上清液， 测沉淀cpm数。
, 百拇医药
1.6 实验材料 SHR及WKY大鼠由阜外医院实验动物中心提供。bFGF、 3H-arginine、Dowex AG 50w-Y8等购自Sigma公司, ET药盒购自福瑞生物工程公司, 余均为国产市售分析纯试剂。
1.7 统计学分析 实验结果以 ±s表示。采用One-way ANOVA方差分析, 组间q检验。P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 bFGF对血管NO生成的影响
SHR血压为18.9±0.7 kPa, WKY大鼠的血压为12.7±0.7 kPa, 前者较后者高48.8%(P<0.01)。其主动脉薄片孵育液中NO?2含量较WKY组低59.7%(P<0.01)。bFGF显著刺激血管壁NO的生成。与10和100 ng/ml bFGF孵育6 h后, SHR主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), WKY大鼠主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 见表1。表 1. bFGF对大鼠主动脉薄片孵育液中亚硝酸盐含量、血管壁一氧化氮合酶活性及内皮素产生的影响
, 百拇医药
Table 1. Effect of bFGF on nitrite content in incubation medium, NOS activity and endothelin production of rat aorta
NO?2
(nmol/mg.pr)
NOS (pmol/mg.pr 30 min)
Endothelin (pg/mg.pr)
SHR
WKY
SHR
WKY
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SHR
WKY
Control
54±13
133±11* *
105±13
127±16* *
1136±120
827±138* *
bFGF10
69±11*
, http://www.100md.com
158±12# #
136±5* *
158±4# #
1410±159* *
1522±126# #
bFGF100
91±9* *
167±16# #
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167±7* *
195±11# #
1642±182* *
1597±191# #
研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠血管一氧化氮(NO)及内皮素生成的影响。取SHR和WKY大鼠主动脉制成血管薄片, 以10、100 ng/ml bFGF(终浓度)分别孵育6 h, 测定血管组织中一氧化氮合酶(NOS)活性及孵育液中亚硝酸盐(NO?2)和内皮素含量。结果显示: SHR主动脉组织NOS活性较WKY的低17.6%(P<0.01), 血管薄片孵育液中NO?2含量低59.7%(P<0.01), 内皮素浓度高37.4%(P<0.01)。在低、高浓度bFGF刺激下, SHR主动脉组织NOS活性分别增高29.7%和59.6%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), 主动脉内皮素的生成分别增加24.1%和44.5%(均P<0.01); WKY大鼠主动脉组织NOS活性分别增高24.4%和53.7%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 主动脉内皮素的产生分别增加84.1%和93.1%(均P<0.01)。结果表明: bFGF对SHR和WKY大鼠主动脉NO及内皮素的产生具有调变作用。
, 百拇医药
关键词: 碱性成纤维细胞生长因子; 自发性高血压大鼠; 主动脉; 一氧化氮合酶; 一氧化氮; 内皮素
学科分类号: Q592.1
Basic fibroblast growth factor increases nitric oxide and
endothelin production in rat aorta
JIANG Zhi-Sheng
(Research Institute of Cardiovascular Diseases, Hengyang Medical College, Hengyang 421001)
YANG Yong-Zong
, http://www.100md.com
(Research Institute of Cardiovascular Diseases, Hengyang Medical College, Hengyang 421001)
ZHAO Wen
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
PANG Yong-Zheng
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
LIU Nai-Kui
, http://www.100md.com
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
TANG Chao-Shu
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
Abstract: The study was undertaken to investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on aortic production of nitric oxide (NO) and endothelin of aorta in spontaneously hypertensive rats (SHR) and WKY rats. Rat aortas were cut into vessel slices and incubated with 10 or 100 ng/ml bFGF for 6 hours. Nitric oxide synthase (NOS) activity in aortic slices and contents of NO?2 and endothelin in the medium were determined. The results showed that NOS activity in aortic slices of SHR was 17.6% lower than that of WKY (P<0.01). NO?2 and endothelin contents in the medium of SHR aortic slices were 59.7% lower and 37.4% higher than those of WKY aortic slices. Upon the exposure of low and high doses of bFGF, NOS activity in the aorta of SHR was increased by 29.7% and 59.6% (both P<0.01),respectively, while the NO?2 contents in the medium were increased respectively by 28.2% (P<0.05) and 70.5% (P<0.01). Aortic endothelin production was increased by 24.1% and 44.5%(both P<0.01) respectively while the NOS activity in the aorta of WKY was increased by 24.4% and 53.7% (both P<0.01). NO?2 contents in the medium were augmented by 18.8% (P<0.05)and 25.9% (P<0.01), respectively. Aortic endothelin production was increased by 84.1% and 93.1% (both P<0.01). It is concluded that bFGF may modulate the production of NO and endothelin in both SHR and WKY rats.
, 百拇医药
Key words: basic fibroblast growth factor; spontaneously hypertensive rats; aorta; nitric oxide synthase; nitricoxide; endothelin
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为广泛分布于体内的一种多功能生长因子, 该因子在有丝分裂中的作用已获公认。近年来, bFGF的非丝裂作用, 特别是对血压的调节作用, 引起了人们的高度重视。有报道, 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)主动脉壁FGF表达降低, 一氧化氮合酶(nitric monoxide synthase, NOS)含量下降, 应用外源FGF或转FGF基因可引起SHR血压降低[1]; 我们亦发现, bFGF可促进血管壁一氧化氮(nitric monoxide, NO)的产生[2], 调节血管舒张功能[3]; 应用外源bFGF可显著拮抗NOS抑制剂左旋硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NNA)诱导的大鼠高血压的形成[4]。这些实验结果均提示, bFGF刺激血管壁L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)/NO系统是其调控高血压的途径之一。但高血压的形成是一个多因素参与的复杂过程, 除NO等血管舒张因子系统外, 内皮素(endothelin, ET)等血管收缩因子系统的作用亦十分重要。高血压的形成与发展取决于血管舒张与收缩因子系统的失衡。本工作在SHR和WKY大鼠离体主动脉孵育模型上观察bFGF对血管ET和NO生成的影响, 以探讨bFGF调控高血压的机制。
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1 材料和方法
1.1 大鼠血压测定 以1 g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。颈总动脉插管, 连接多道生理记录仪, 静息20 min后, 测定平均动脉血压(MBP)。
1.2 大鼠离体主动脉血管薄片孵育 体重250～270 g的SHR和WKY大鼠(12周龄), 以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。迅速取出主动脉, 置于冰冷的含1% BSA Krebs-Henseleit(KH)液中, 去除外膜组织, 以Tissue slicer制备约0.5 mm厚薄片, 然后将血管薄片按下述分组分别置于盛KH液的器官培养孵育管中(每管约60 mg), 于37℃、 95% O2-5% CO2条件下振摇孵育6 h。
实验分组: SHR和WKY大鼠主动脉薄片分别分为对照组(不加bFGF),低和高浓度bFGF组(分别加入bFGF 10和100 ng/ml)。
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1.3 亚硝酸盐(NO?2)含量测定 取孵育液按Green等的方法[5], 以酶标仪于570 nm下测定NO?2含量。
1.4 血管壁NOS活性测定[6] 取孵育完毕的血管组织用KH液洗涤后,以Ultra-Turex T25匀浆器制备组织匀浆, 4℃下离心, 3000 r/min, 10 min。取上清液以考马斯亮蓝法测定蛋白含量, 调整蛋白浓度为2 mg/ml。取含200 μg蛋白的上清液加入100 μl孵育buffer (含32 μmol/L L-Arg和1 Ci 3H-arginine), 37℃, 振摇孵育30 min, 然后加入50 μl冰冷终止液, 摇匀, 过Dowex AG 50w-Y8柱。测定洗脱的、反应生成的3H-精氨酸的放射活性, 计算出NOS活性(pmol/mg.pr/min)。
1.5 内皮素含量测定 孵育液内皮素含量用内皮素放免药盒测定。取孵育液1 ml加抑肽酶20 μl, 混匀, 4℃ 3000 r/min离心5 min, 取上清液按下表操作。
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孵育液内皮素含量测定过程(单位: μl)
NSB
S0
S1-S6
样品管
缓冲液
200
100
-
-
标准品
-
-
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100
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样 品
-
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100
抗血清
-
100
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摇匀, 4℃过夜
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100
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100
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摇匀， 4℃ 18 h以上
分离剂
1000
1000
1000
1000
加样完毕， 4℃放置30 min， 3500 r/min离心20 min， 弃上清液， 测沉淀cpm数。
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1.6 实验材料 SHR及WKY大鼠由阜外医院实验动物中心提供。bFGF、 3H-arginine、Dowex AG 50w-Y8等购自Sigma公司, ET药盒购自福瑞生物工程公司, 余均为国产市售分析纯试剂。
1.7 统计学分析 实验结果以 ±s表示。采用One-way ANOVA方差分析, 组间q检验。P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 bFGF对血管NO生成的影响
SHR血压为18.9±0.7 kPa, WKY大鼠的血压为12.7±0.7 kPa, 前者较后者高48.8%(P<0.01)。其主动脉薄片孵育液中NO?2含量较WKY组低59.7%(P<0.01)。bFGF显著刺激血管壁NO的生成。与10和100 ng/ml bFGF孵育6 h后, SHR主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), WKY大鼠主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 见表1。表 1. bFGF对大鼠主动脉薄片孵育液中亚硝酸盐含量、血管壁一氧化氮合酶活性及内皮素产生的影响
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Table 1. Effect of bFGF on nitrite content in incubation medium, NOS activity and endothelin production of rat aorta
NO?2 (nmol/mg.pr)
NOS (pmol/mg.pr 30 min)
Endothelin (pg/mg.pr)
SHR
WKY
SHR
WKY
SHR
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WKY
Control
54±13
133±11* *
105±13
127±16* *
1136±120
827±138* *
bFGF10
69±11*
158±12# #
136±5* *
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158±4# #
1410±159* *
1522±126# #
bFGF100
91±9* *
167±16# #
167±7* *
195±11# #
1642±182* *
1597±191# #
Mean±SD. n=6. * P<0.05, * * P<0.01 vs corresponding values of control SHR. # # P<0.01 vs corresponding values of WKY. bFGF10: 10 ng/ml bFGF in medium. bFGF100: 100 ng/ml bFGF in medium.
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2.2 bFGF对血管壁NOS活性的影响
SHR主动脉组织NOS活性较WKY组低17.6%(P<0.01)。在10和100 ng/ml bFGF刺激下, SHR主动脉组织NOS活性分别增高29.7%和59.6%(均P<0.01), WKY大鼠主动脉组织NOS活性分别增高24.4%和53.7%(均P<0.01)。结果见表1。
2.3 bFGF对血管壁产生ET的影响
SHR主动脉内皮素的生成量较WKY的高37.4%(P<0.01)。bFGF对SHR及WKY大鼠主动脉组织内皮素的产生均有促进作用。在10和100 ng/ml bFGF刺激下, SHR主动脉内皮素的生成分别增加24.1%和44.5%(均P<0.01), WKY大鼠内皮素的产生分别增加84.1%和93.1%(均P<0.01)。结果见表1。
3 讨论
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由于bFGF具有促进血管平滑肌细胞增殖的作用, 以往学者都认为其有促高血压意义。但1996年Cuevas等[1]发现, SHR血管内皮细胞的FGF含量显著降低, NOS的表达亦减少, 内皮舒张功能明显异常。通过静脉注射FGF或转FGF基因, 提高血管壁FGF水平, 则诱导NOS高表达, 显著降低动脉血压, 提出了用FGF防治高血压的新策略。我们曾观察了bFGF对猴、兔、大鼠等不同动物血管壁L-Arg/NO系统的影响[2～4], 结果显示, bFGF增强L-Arg向细胞内的转运, 诱导NOS表达, 刺激NO生成和释放。bFGF对血管L-Arg/NOS/NO途径的各环节均有促进作用。
本实验发现, SHR较WKY大鼠血管NOS活性降低, NO的终末产物NO?2的生成减少, 孵育液中NO?2的生成量即可反映血管NO的含量; ET产生增多, 与文献报道一致[7]。ET由血管内皮细胞和平滑肌细胞生成, 其本身在细胞中不能贮存, 而是释放到细胞外, 因而孵育液中ET的含量即能反映血管ET的生成量。bFGF不仅增加WKY大鼠血管NOS活性及NO的产生, 同时也增加SHR血管NOS活性及NO的产生, 且作用的幅度大于WKY。有意义的是NO、ET生成量比率亦发生改变, SHR血管薄片与10和100 ng/ml bFGF孵育后, 孵育液中内皮素与NO?2浓度之比从21.2∶1分别降为20.6∶1(P>0.05)和18.0∶1(P<0.05)。而在WKY大鼠, 这一比率从6.2∶1升至9.7∶1和9.6∶1(均P<0.05)。这说明bFGF对SHR和WKY大鼠主动脉ET及NO产生和释放的刺激程度有所不同, 对于SHR大鼠, 该因子刺激NO产生与释放的程度超过对ET的刺激, 而对于WKY大鼠, bFGF的作用正好相反。
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高血压的发生发展为一涉及许多因素的网络调控过程, 其中, 调节血管舒缩功能的各种生物活性物质的失衡起着十分重要的作用, 具有强烈舒血管功能的NO与强烈收缩血管功能的ET的作用尤为受到高度重视。bFGF可显著促进SHR血管NO的产生, 虽然也能刺激ET的生成, 但ET生成量与NO产生量之比明显降低。表明bFGF作用的结果使SHR体内舒血管的力量增强。这进一步说明该因子的抗高血压效应不仅与促进NO的产生有关, 而且可能与整合调节NO与ET的产生进而改善血管舒缩功能密切相关。bFGF的这些作用值得深入探讨。
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39730220)
Corresponding author. Tel: 86-10-66171122-2577; Email: tangchaoshu@263.net
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姜志胜(衡阳医学院心血管病研究所, 衡阳 421001)
杨永宗(衡阳医学院心血管病研究所, 衡阳 421001)
赵文(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
庞永政(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
刘乃奎(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
参 考 文 献
[1] Cuevas P, Calvo MG, Carceller F et al. Correction of hypertension by normalization of endothelial levels of fibroblast growth factor and nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 11996～12001.
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[2] Jiang ZS (姜志胜), Wang XZ (王相智), Gong ML (龚曼丽) et al. Effect of basic fibroblast growth factor on nitric oxide production of monkey coronary artery. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1997, 29: 565 (in Chinese with English abstract).
[3] Wang XH (王晓红), Jiang ZS (姜志胜), Shabituofu DN et al. The effect of basic fibroblast growth factor on aortic relaxation and L-arginine/nitric oxide system. Chin J Pathophysiol (中国病理生理杂志), 1999, 15: 245～247 (in Chinese with English abstract).
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[4] Jiang ZS (姜志胜), Su JL (苏加林), Li X (李 夏) et al. Effect of bFGF on hypertension induced by NG-nitric-arginine in rats. Bas Med Sci Clin (基础医学与临床), 1999, 19: 61～64 (in Chinese with English abstract).
[5] Green LG, Wagner DA, Glogowskl J et al. Analysis of nitrate, nitrite and 15N-nitrate in biological fluids. Anal Biochem, 1982, 126: 131～136.
[6] Zhang XB (张新波), Huang HL (黄海鹭), Zhang LZ (张灵芝) et al. Measurement of nitric oxide synthase activity and its application. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1994, 26 (suppl): 173～176 (in Chinese with English abstract).
[7] Luscher TF. The endothelium in hypertension: bystander, target or mediator J Hypertension, 1994, 12 (suppl 10): s105～s116.
Received 1999-08-02 Revised 2000-01-07, 百拇医药
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；自发性高血压大鼠；主动脉；一氧化氮合酶；一氧化氮；内皮素
摘要：研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠血管一氧化氮(NO)及内皮素生成的影响。取SHR和WKY大鼠主动脉制成血管薄片, 以10、100 ng/ml bFGF(终浓度)分别孵育6 h, 测定血管组织中一氧化氮合酶(NOS)活性及孵育液中亚硝酸盐(NO?2)和内皮素含量。结果显示: SHR主动脉组织NOS活性较WKY的低17.6%(P<0.01), 血管薄片孵育液中NO?2含量低59.7%(P<0.01), 内皮素浓度高37.4%(P<0.01)。在低、高浓度bFGF刺激下, SHR主动脉组织NOS活性分别增高29.7%和59.6%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), 主动脉内皮素的生成分别增加24.1%和44.5%(均P<0.01); WKY大鼠主动脉组织NOS活性分别增高24.4%和53.7%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 主动脉内皮素的产生分别增加84.1%和93.1%(均P<0.01)。结果表明: bFGF对SHR和WKY大鼠主动脉NO及内皮素的产生具有调变作用。
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碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为广泛分布于体内的一种多功能生长因子, 该因子在有丝分裂中的作用已获公认。近年来, bFGF的非丝裂作用, 特别是对血压的调节作用, 引起了人们的高度重视。有报道, 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)主动脉壁FGF表达降低, 一氧化氮合酶(nitric monoxide synthase, NOS)含量下降, 应用外源FGF或转FGF基因可引起SHR血压降低[1]; 我们亦发现, bFGF可促进血管壁一氧化氮(nitric monoxide, NO)的产生[2], 调节血管舒张功能[3]; 应用外源bFGF可显著拮抗NOS抑制剂左旋硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NNA)诱导的大鼠高血压的形成[4]。这些实验结果均提示, bFGF刺激血管壁L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)/NO系统是其调控高血压的途径之一。但高血压的形成是一个多因素参与的复杂过程, 除NO等血管舒张因子系统外, 内皮素(endothelin, ET)等血管收缩因子系统的作用亦十分重要。高血压的形成与发展取决于血管舒张与收缩因子系统的失衡。本工作在SHR和WKY大鼠离体主动脉孵育模型上观察bFGF对血管ET和NO生成的影响, 以探讨bFGF调控高血压的机制。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 大鼠血压测定 以1 g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。颈总动脉插管, 连接多道生理记录仪, 静息20 min后, 测定平均动脉血压(MBP)。
1.2 大鼠离体主动脉血管薄片孵育 体重250～270 g的SHR和WKY大鼠(12周龄), 以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。迅速取出主动脉, 置于冰冷的含1% BSA Krebs-Henseleit(KH)液中, 去除外膜组织, 以Tissue slicer制备约0.5 mm厚薄片, 然后将血管薄片按下述分组分别置于盛KH液的器官培养孵育管中(每管约60 mg), 于37℃、 95% O2-5% CO2条件下振摇孵育6 h。
实验分组: SHR和WKY大鼠主动脉薄片分别分为对照组(不加bFGF),低和高浓度bFGF组(分别加入bFGF 10和100 ng/ml)。
, 百拇医药
1.3 亚硝酸盐(NO?2)含量测定 取孵育液按Green等的方法[5], 以酶标仪于570 nm下测定NO?2含量。
1.4 血管壁NOS活性测定[6] 取孵育完毕的血管组织用KH液洗涤后,以Ultra-Turex T25匀浆器制备组织匀浆, 4℃下离心, 3000 r/min, 10 min。取上清液以考马斯亮蓝法测定蛋白含量, 调整蛋白浓度为2 mg/ml。取含200 μg蛋白的上清液加入100 μl孵育buffer (含32 μmol/L L-Arg和1 Ci 3H-arginine), 37℃, 振摇孵育30 min, 然后加入50 μl冰冷终止液, 摇匀, 过Dowex AG 50w-Y8柱。测定洗脱的、反应生成的3H-精氨酸的放射活性, 计算出NOS活性(pmol/mg.pr/min)。
1.5 内皮素含量测定 孵育液内皮素含量用内皮素放免药盒测定。取孵育液1 ml加抑肽酶20 μl, 混匀, 4℃ 3000 r/min离心5 min, 取上清液按下表操作。
, 百拇医药
孵育液内皮素含量测定过程(单位: μl)
NSB
S0
S1-S6
样品管
缓冲液
200
100
-
-
标准品
-
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-
100
-
样 品
-
-
-
100
抗血清
-
100
100
100
摇匀, 4℃过夜
, 百拇医药
125I-内皮素
100
100
100
100
摇匀， 4℃ 18 h以上
分离剂
1000
1000
1000
1000
加样完毕， 4℃放置30 min， 3500 r/min离心20 min， 弃上清液， 测沉淀cpm数。
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1.6 实验材料 SHR及WKY大鼠由阜外医院实验动物中心提供。bFGF、 3H-arginine、Dowex AG 50w-Y8等购自Sigma公司, ET药盒购自福瑞生物工程公司, 余均为国产市售分析纯试剂。
1.7 统计学分析 实验结果以 ±s表示。采用One-way ANOVA方差分析, 组间q检验。P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 bFGF对血管NO生成的影响
SHR血压为18.9±0.7 kPa, WKY大鼠的血压为12.7±0.7 kPa, 前者较后者高48.8%(P<0.01)。其主动脉薄片孵育液中NO?2含量较WKY组低59.7%(P<0.01)。bFGF显著刺激血管壁NO的生成。与10和100 ng/ml bFGF孵育6 h后, SHR主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), WKY大鼠主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 见表1。表 1. bFGF对大鼠主动脉薄片孵育液中亚硝酸盐含量、血管壁一氧化氮合酶活性及内皮素产生的影响
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Table 1. Effect of bFGF on nitrite content in incubation medium, NOS activity and endothelin production of rat aorta
NO?2
(nmol/mg.pr)
NOS (pmol/mg.pr 30 min)
Endothelin (pg/mg.pr)
SHR
WKY
SHR
WKY
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SHR
WKY
Control
54±13
133±11* *
105±13
127±16* *
1136±120
827±138* *
bFGF10
69±11*
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158±12# #
136±5* *
158±4# #
1410±159* *
1522±126# #
bFGF100
91±9* *
167±16# #
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167±7* *
195±11# #
1642±182* *
1597±191# #
研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠血管一氧化氮(NO)及内皮素生成的影响。取SHR和WKY大鼠主动脉制成血管薄片, 以10、100 ng/ml bFGF(终浓度)分别孵育6 h, 测定血管组织中一氧化氮合酶(NOS)活性及孵育液中亚硝酸盐(NO?2)和内皮素含量。结果显示: SHR主动脉组织NOS活性较WKY的低17.6%(P<0.01), 血管薄片孵育液中NO?2含量低59.7%(P<0.01), 内皮素浓度高37.4%(P<0.01)。在低、高浓度bFGF刺激下, SHR主动脉组织NOS活性分别增高29.7%和59.6%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), 主动脉内皮素的生成分别增加24.1%和44.5%(均P<0.01); WKY大鼠主动脉组织NOS活性分别增高24.4%和53.7%(均P<0.01), 主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 主动脉内皮素的产生分别增加84.1%和93.1%(均P<0.01)。结果表明: bFGF对SHR和WKY大鼠主动脉NO及内皮素的产生具有调变作用。
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关键词: 碱性成纤维细胞生长因子; 自发性高血压大鼠; 主动脉; 一氧化氮合酶; 一氧化氮; 内皮素
学科分类号: Q592.1
Basic fibroblast growth factor increases nitric oxide and
endothelin production in rat aorta
JIANG Zhi-Sheng
(Research Institute of Cardiovascular Diseases, Hengyang Medical College, Hengyang 421001)
YANG Yong-Zong
, http://www.100md.com
(Research Institute of Cardiovascular Diseases, Hengyang Medical College, Hengyang 421001)
ZHAO Wen
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
PANG Yong-Zheng
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
LIU Nai-Kui
, http://www.100md.com
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
TANG Chao-Shu
(Institute of Cardiovascular Research, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
Abstract: The study was undertaken to investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on aortic production of nitric oxide (NO) and endothelin of aorta in spontaneously hypertensive rats (SHR) and WKY rats. Rat aortas were cut into vessel slices and incubated with 10 or 100 ng/ml bFGF for 6 hours. Nitric oxide synthase (NOS) activity in aortic slices and contents of NO?2 and endothelin in the medium were determined. The results showed that NOS activity in aortic slices of SHR was 17.6% lower than that of WKY (P<0.01). NO?2 and endothelin contents in the medium of SHR aortic slices were 59.7% lower and 37.4% higher than those of WKY aortic slices. Upon the exposure of low and high doses of bFGF, NOS activity in the aorta of SHR was increased by 29.7% and 59.6% (both P<0.01),respectively, while the NO?2 contents in the medium were increased respectively by 28.2% (P<0.05) and 70.5% (P<0.01). Aortic endothelin production was increased by 24.1% and 44.5%(both P<0.01) respectively while the NOS activity in the aorta of WKY was increased by 24.4% and 53.7% (both P<0.01). NO?2 contents in the medium were augmented by 18.8% (P<0.05)and 25.9% (P<0.01), respectively. Aortic endothelin production was increased by 84.1% and 93.1% (both P<0.01). It is concluded that bFGF may modulate the production of NO and endothelin in both SHR and WKY rats.
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Key words: basic fibroblast growth factor; spontaneously hypertensive rats; aorta; nitric oxide synthase; nitricoxide; endothelin
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为广泛分布于体内的一种多功能生长因子, 该因子在有丝分裂中的作用已获公认。近年来, bFGF的非丝裂作用, 特别是对血压的调节作用, 引起了人们的高度重视。有报道, 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)主动脉壁FGF表达降低, 一氧化氮合酶(nitric monoxide synthase, NOS)含量下降, 应用外源FGF或转FGF基因可引起SHR血压降低[1]; 我们亦发现, bFGF可促进血管壁一氧化氮(nitric monoxide, NO)的产生[2], 调节血管舒张功能[3]; 应用外源bFGF可显著拮抗NOS抑制剂左旋硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NNA)诱导的大鼠高血压的形成[4]。这些实验结果均提示, bFGF刺激血管壁L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)/NO系统是其调控高血压的途径之一。但高血压的形成是一个多因素参与的复杂过程, 除NO等血管舒张因子系统外, 内皮素(endothelin, ET)等血管收缩因子系统的作用亦十分重要。高血压的形成与发展取决于血管舒张与收缩因子系统的失衡。本工作在SHR和WKY大鼠离体主动脉孵育模型上观察bFGF对血管ET和NO生成的影响, 以探讨bFGF调控高血压的机制。
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1 材料和方法
1.1 大鼠血压测定 以1 g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。颈总动脉插管, 连接多道生理记录仪, 静息20 min后, 测定平均动脉血压(MBP)。
1.2 大鼠离体主动脉血管薄片孵育 体重250～270 g的SHR和WKY大鼠(12周龄), 以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。迅速取出主动脉, 置于冰冷的含1% BSA Krebs-Henseleit(KH)液中, 去除外膜组织, 以Tissue slicer制备约0.5 mm厚薄片, 然后将血管薄片按下述分组分别置于盛KH液的器官培养孵育管中(每管约60 mg), 于37℃、 95% O2-5% CO2条件下振摇孵育6 h。
实验分组: SHR和WKY大鼠主动脉薄片分别分为对照组(不加bFGF),低和高浓度bFGF组(分别加入bFGF 10和100 ng/ml)。
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1.3 亚硝酸盐(NO?2)含量测定 取孵育液按Green等的方法[5], 以酶标仪于570 nm下测定NO?2含量。
1.4 血管壁NOS活性测定[6] 取孵育完毕的血管组织用KH液洗涤后,以Ultra-Turex T25匀浆器制备组织匀浆, 4℃下离心, 3000 r/min, 10 min。取上清液以考马斯亮蓝法测定蛋白含量, 调整蛋白浓度为2 mg/ml。取含200 μg蛋白的上清液加入100 μl孵育buffer (含32 μmol/L L-Arg和1 Ci 3H-arginine), 37℃, 振摇孵育30 min, 然后加入50 μl冰冷终止液, 摇匀, 过Dowex AG 50w-Y8柱。测定洗脱的、反应生成的3H-精氨酸的放射活性, 计算出NOS活性(pmol/mg.pr/min)。
1.5 内皮素含量测定 孵育液内皮素含量用内皮素放免药盒测定。取孵育液1 ml加抑肽酶20 μl, 混匀, 4℃ 3000 r/min离心5 min, 取上清液按下表操作。
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孵育液内皮素含量测定过程(单位: μl)
NSB
S0
S1-S6
样品管
缓冲液
200
100
-
-
标准品
-
-
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100
-
样 品
-
-
-
100
抗血清
-
100
100
100
摇匀, 4℃过夜
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100
100
100
100
摇匀， 4℃ 18 h以上
分离剂
1000
1000
1000
1000
加样完毕， 4℃放置30 min， 3500 r/min离心20 min， 弃上清液， 测沉淀cpm数。
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1.6 实验材料 SHR及WKY大鼠由阜外医院实验动物中心提供。bFGF、 3H-arginine、Dowex AG 50w-Y8等购自Sigma公司, ET药盒购自福瑞生物工程公司, 余均为国产市售分析纯试剂。
1.7 统计学分析 实验结果以 ±s表示。采用One-way ANOVA方差分析, 组间q检验。P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 bFGF对血管NO生成的影响
SHR血压为18.9±0.7 kPa, WKY大鼠的血压为12.7±0.7 kPa, 前者较后者高48.8%(P<0.01)。其主动脉薄片孵育液中NO?2含量较WKY组低59.7%(P<0.01)。bFGF显著刺激血管壁NO的生成。与10和100 ng/ml bFGF孵育6 h后, SHR主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加28.2%(P<0.05)和70.5%(P<0.01), WKY大鼠主动脉薄片孵育液中NO?2含量分别增加18.8%和25.9%(均P<0.01), 见表1。表 1. bFGF对大鼠主动脉薄片孵育液中亚硝酸盐含量、血管壁一氧化氮合酶活性及内皮素产生的影响
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Table 1. Effect of bFGF on nitrite content in incubation medium, NOS activity and endothelin production of rat aorta
NO?2 (nmol/mg.pr)
NOS (pmol/mg.pr 30 min)
Endothelin (pg/mg.pr)
SHR
WKY
SHR
WKY
SHR
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WKY
Control
54±13
133±11* *
105±13
127±16* *
1136±120
827±138* *
bFGF10
69±11*
158±12# #
136±5* *
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158±4# #
1410±159* *
1522±126# #
bFGF100
91±9* *
167±16# #
167±7* *
195±11# #
1642±182* *
1597±191# #
Mean±SD. n=6. * P<0.05, * * P<0.01 vs corresponding values of control SHR. # # P<0.01 vs corresponding values of WKY. bFGF10: 10 ng/ml bFGF in medium. bFGF100: 100 ng/ml bFGF in medium.
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2.2 bFGF对血管壁NOS活性的影响
SHR主动脉组织NOS活性较WKY组低17.6%(P<0.01)。在10和100 ng/ml bFGF刺激下, SHR主动脉组织NOS活性分别增高29.7%和59.6%(均P<0.01), WKY大鼠主动脉组织NOS活性分别增高24.4%和53.7%(均P<0.01)。结果见表1。
2.3 bFGF对血管壁产生ET的影响
SHR主动脉内皮素的生成量较WKY的高37.4%(P<0.01)。bFGF对SHR及WKY大鼠主动脉组织内皮素的产生均有促进作用。在10和100 ng/ml bFGF刺激下, SHR主动脉内皮素的生成分别增加24.1%和44.5%(均P<0.01), WKY大鼠内皮素的产生分别增加84.1%和93.1%(均P<0.01)。结果见表1。
3 讨论
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由于bFGF具有促进血管平滑肌细胞增殖的作用, 以往学者都认为其有促高血压意义。但1996年Cuevas等[1]发现, SHR血管内皮细胞的FGF含量显著降低, NOS的表达亦减少, 内皮舒张功能明显异常。通过静脉注射FGF或转FGF基因, 提高血管壁FGF水平, 则诱导NOS高表达, 显著降低动脉血压, 提出了用FGF防治高血压的新策略。我们曾观察了bFGF对猴、兔、大鼠等不同动物血管壁L-Arg/NO系统的影响[2～4], 结果显示, bFGF增强L-Arg向细胞内的转运, 诱导NOS表达, 刺激NO生成和释放。bFGF对血管L-Arg/NOS/NO途径的各环节均有促进作用。
本实验发现, SHR较WKY大鼠血管NOS活性降低, NO的终末产物NO?2的生成减少, 孵育液中NO?2的生成量即可反映血管NO的含量; ET产生增多, 与文献报道一致[7]。ET由血管内皮细胞和平滑肌细胞生成, 其本身在细胞中不能贮存, 而是释放到细胞外, 因而孵育液中ET的含量即能反映血管ET的生成量。bFGF不仅增加WKY大鼠血管NOS活性及NO的产生, 同时也增加SHR血管NOS活性及NO的产生, 且作用的幅度大于WKY。有意义的是NO、ET生成量比率亦发生改变, SHR血管薄片与10和100 ng/ml bFGF孵育后, 孵育液中内皮素与NO?2浓度之比从21.2∶1分别降为20.6∶1(P>0.05)和18.0∶1(P<0.05)。而在WKY大鼠, 这一比率从6.2∶1升至9.7∶1和9.6∶1(均P<0.05)。这说明bFGF对SHR和WKY大鼠主动脉ET及NO产生和释放的刺激程度有所不同, 对于SHR大鼠, 该因子刺激NO产生与释放的程度超过对ET的刺激, 而对于WKY大鼠, bFGF的作用正好相反。
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高血压的发生发展为一涉及许多因素的网络调控过程, 其中, 调节血管舒缩功能的各种生物活性物质的失衡起着十分重要的作用, 具有强烈舒血管功能的NO与强烈收缩血管功能的ET的作用尤为受到高度重视。bFGF可显著促进SHR血管NO的产生, 虽然也能刺激ET的生成, 但ET生成量与NO产生量之比明显降低。表明bFGF作用的结果使SHR体内舒血管的力量增强。这进一步说明该因子的抗高血压效应不仅与促进NO的产生有关, 而且可能与整合调节NO与ET的产生进而改善血管舒缩功能密切相关。bFGF的这些作用值得深入探讨。
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39730220)
Corresponding author. Tel: 86-10-66171122-2577; Email: tangchaoshu@263.net
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姜志胜(衡阳医学院心血管病研究所, 衡阳 421001)
杨永宗(衡阳医学院心血管病研究所, 衡阳 421001)
赵文(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
庞永政(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
刘乃奎(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所, 北京 100034)
参 考 文 献
[1] Cuevas P, Calvo MG, Carceller F et al. Correction of hypertension by normalization of endothelial levels of fibroblast growth factor and nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 11996～12001.
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[2] Jiang ZS (姜志胜), Wang XZ (王相智), Gong ML (龚曼丽) et al. Effect of basic fibroblast growth factor on nitric oxide production of monkey coronary artery. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1997, 29: 565 (in Chinese with English abstract).
[3] Wang XH (王晓红), Jiang ZS (姜志胜), Shabituofu DN et al. The effect of basic fibroblast growth factor on aortic relaxation and L-arginine/nitric oxide system. Chin J Pathophysiol (中国病理生理杂志), 1999, 15: 245～247 (in Chinese with English abstract).
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[4] Jiang ZS (姜志胜), Su JL (苏加林), Li X (李 夏) et al. Effect of bFGF on hypertension induced by NG-nitric-arginine in rats. Bas Med Sci Clin (基础医学与临床), 1999, 19: 61～64 (in Chinese with English abstract).
[5] Green LG, Wagner DA, Glogowskl J et al. Analysis of nitrate, nitrite and 15N-nitrate in biological fluids. Anal Biochem, 1982, 126: 131～136.
[6] Zhang XB (张新波), Huang HL (黄海鹭), Zhang LZ (张灵芝) et al. Measurement of nitric oxide synthase activity and its application. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1994, 26 (suppl): 173～176 (in Chinese with English abstract).
[7] Luscher TF. The endothelium in hypertension: bystander, target or mediator J Hypertension, 1994, 12 (suppl 10): s105～s116.
Received 1999-08-02 Revised 2000-01-07, 百拇医药