抗心律失常药RP62719对哺乳动物心室肌K+电流的抑制
哈尔滨医科大学生理教研室； 1药理教研室； 2病理生理教研室； 哈尔滨 150086 李玉荣；杨宝峰,1；徐长庆2；周晋1；杨永滨；张季叶；孙明智
关键词： RP62719； 内向整流钾电流； 瞬时外向钾电流； 延迟外向钾电流； 半数抑制浓度 (IC50)
摘要：Untitled Document使用全细胞膜片箝技术, 研究RP62719对内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)和延迟外向整流钾电流(IK)的作用, 并探讨其抗心律失常作用的机制。实验结果表明, 在指令电压为-100 mV时, RP62719可显著抑制豚鼠心室肌细胞IK1, 半数抑制浓度(IC50)为5.0±1.0 μmol/L。RP62719 10 μmol/L在+40 mV时对犬心室肌细胞Ito抑制率为84.0±4.4%, IC50为1.2±0.51 μmol/L。在+40 mV时, 50 μmol/L RP62719还可使豚鼠心室肌细胞IKstep 减少50.0±8.3%, IKtail减少56.0±4.9%, IC50分别为4.2/±0.8 μmol/L和3.3±0.75 μmol/L。提示RP62719抗心律失常的离子机制与其对IK1、Ito及IK的抑制有关。
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以往的研究表明, 苯吡喃衍生物RP62719可剂量依赖性地延长心房、心室的动作电位时程, 在多种心律失常模型上有抗心律失常作用。膜片箝实验证明, RP62179是内向整流钾电流(IK1)的特异性阻断剂[1,2], 对瞬时外向钾电流(Ito)也有一定抑制作用[3], 但关于RP62179 对延迟外向钾电流 (IK) 的影响报道较少。本实验拟以全细胞膜片箝技术, 观察RP62719对豚鼠心室肌细胞IK1和IK及犬心室肌细胞Ito的影响, 探讨其抗心律失常作用的离子机制。
将健康豚鼠(250～400 g)击昏后开胸暴露心脏, 迅速取心脏置于冰冷无钙液中, 并连于Langendoff灌流架的主动脉插管上进行逆行灌流。在细胞外液冲洗10 min后, 以无钙液灌流5 min, 再用含胶原酶Ⅰ型0.4 mg/ml的无钙液循环灌流5 min。之后, 每隔2 min剪下一小块心室肌置于贮存液中吹打震荡, 使细胞散开, 共取8～10次。细胞混悬液置于4℃冰箱中稳定1 h后备用[4]。给健康犬(18～25 kg), 静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后, 开胸取下心脏, 置于冰冷无钙液中。然后剪下连于左冠状动脉前降支的心肌组织块约1～1.5 cm3, 再将冠状动脉前降支连于Langendoff灌流架上进行灌流, 以含胶原酶1 mg/ml的无钙液循环灌流20 min, 其它步骤见豚鼠心室肌细胞制备[5]。
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细胞外液的组成(mmol/L) NaCl 126.0, KCl 5.4, MgCl2 1.0, CaCl2 1.0, NaH2PO4 0.33, glucose 10.0, HEPES 10.0, pH 7.4。贮存液: KCl 20.0, potassium glutamate 70.0, taurine 10.0, KH2PO4 10.0, glucose 10.0, EGTA 5.0, β-hydroxbutyric acid 10.0 及albumin 1.0%, pH 7.3。电极内液: KCl 20.0, potassium aspartate 110.0, MgCl2 1.0, HEPES 10.0, EGTA 5.0, GTP 0.1, Mg-ATP 5.0, pH 7.4。RP62719以蒸馏水配制, 系加拿大蒙特利尔心脏研究所提供。BaCl2、 CdCl2 (Sigma)均配制为0.2 mol/L,用于阻断IK1和/或ICa。
离子通道电流的记录及处理 取分离好的细胞悬液1～2滴置于装有细胞外液的浴槽中。细胞贴壁后, 用内充电极液的玻璃微电极与心室肌细胞形成高阻封接(>10 GΩ)。 通过Pclamp 6.02软件发放不同刺激参数的阶跃脉冲, 通道电流经探头输入Axopatch 200A膜片箝放大器, 并微机贮存。实验数据由clampfit软件进行统计学处理,以通道电流变化为纵坐标、指令电压(TP)为横坐标绘制I-V曲线, 得出均数±标准差。浴槽液温度为36±0.5℃, 灌流液系细胞外液或加入了RP62719及各种阻断剂, 流速为1～2 ml/min[6,7]。
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1. RP62719对豚鼠心室肌细胞IK1的影响
当电极尖端与豚鼠心室肌细胞形成高阻封接并进一步形成全细胞构型后, 施予-60 mV保持电压, 使指令电压从-120 mV到0 mV之间变化, 每次持续300 ms阶跃10 mV。 用Cd2+ (0.2 mmol/L) 阻断ICa后, 可见到一内向电流IK1。 当指令电压在-100 mV时, IK1可达 5769.1±764.9 pA; 分别给予5、 50μmol/L RP62719时, IK1峰值明显减少, 分别为3?836.9±807 pA和2?333.0±809 pA (P<0.001 n=6)。其半数抑制浓度(IC50)为5.0±1.0 μmol/L。用细胞外液冲洗20 min, IK1恢复约80%, IK1峰值为4054.8±782.6 pA。
2. RP62719对犬心室肌细胞Ito的影响
当电极尖端与犬心室肌细胞形成全细胞构型后, 在浴液中加入下列阻断剂, 使终浓度为Cd2+ 0.2 mmol/L, Ba2+ 0.2 mmol/L及ryanodine 20 μmol/L, 分别阻断ICa, IK1和ICa·cl。当保持电压为-80 mV, 步阶电压为10 mV, 指令电压在从-40 mV到+40 mV除极电压间, 持续时间为100 ms时, 在犬心室肌细胞上可记录到Ito; 当指令电压为+40 mV时, 该电流峰值为824.0±132.5 pA。分别给予1、10 μmol/L RP62719, 可见到 Ito峰值减小。10 μmol/L RP62719可使峰电流减小84.0±4.4%, 与对照组相比差异显著(P<0.001, n=7)。同时, RP62719对Ito的抑制效应具有浓度依赖性, IC50为1.2±0.51 μmol/L。 洗脱后Ito峰值恢复至539.4±35.1 pA 。
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3. RP62719对豚鼠心室肌细胞IK的影响
在灌流的细胞外液中加入Cd2+和Ba2+使终浓度为0.2 mmol/L, 分别阻断ICa和IK1。当保持电压为-60 mV、指令电压+40 mV、持续时间200 ms、刺激频率1 Hz时, 在6个豚鼠心室肌细胞上记录到延迟外向钾电流IKstep及其尾电流IKtail, 其峰电流分别为581.9±120.2 pA 和404.8±48.0 pA。 在分别给予5、50 μmol/L RP62719后, IKstep分别为456.1±74.1和239.6±68.8 pA, 其抑制率为22.0±4.0%和50.0±8.3%。与对照组相比差异显著(P<0.01,n=6)。而IKtail则分别为287.2±34.0 pA 和183.5±35.9 pA, 分别抑制了29.0±8.4%和56.0±4.9%, 差异显著(P<0.01,n=6)。其IC50 在IKstep为4.2±0.8 μmol/L, IKtail为3.3±0.75 μmol/L, 且具有浓度依赖性关系, RP62719对IK的作用表现为可逆性。
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Mclarnon研究证明, RP62719是Ⅲ类抗心律失常药物, 其延长动作电位时程的作用与抑制Ito有关[3]。但该研究抑制大鼠心室肌细胞Ito使用的药物浓度较高, 达1～60 mmol/L。我们的研究证明, RP62719抑制犬心室肌细胞Ito的IC50只有1～2 μmol/L, 这种浓度差异可能与动物种属有关。Escnde Denis等通过膜片箝实验认为, RP62719的抗心律失常作用是由于该药特异性地阻断了心肌内向整流钾电流IK1的结果, 并将其作为IK1的特异阻断剂[1,8]。但本研究证明, RP62719对IK1、Ito、IKstep及IKtail均有抑制作用, 且抑制Ito作用强于IK1、IKstep及IKtail 。此点是否与动物种属不同有关, 尚待进一步研究。RP62719对上述钾电流的抑制作用与RP58866的作用相似[4,5]。其对IKstep 和IKtail抑制作用与IK的两种组分IKr 和IKs的关系也有待于进一步深入研究。一个较理想的抗心律失常药物, 应对多种离子通道有抑制作用。 本实验证明RP62719对IK1、 Ito、 IKstep及 IKtail均有抑制作用, 由于动作电位时程在多个环节延长, 因而此作用可能是该药作为Ⅲ类抗心律失常药发挥作用的重要离子机制。
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参考文献
[1]Escande D, Mestre M, Cavero I et al. RP58866 and its active enantiomer RP62719 (terikalant): Blockers of the inward rectifier K+ current acting as pure class Ⅲ antiarrhymic agents. J Cardiovasc Pharmacol, 1992,20 Suppl 2: Sl06～S113.
[2]Rees SA, Curtis MJ. Specific IK1 blockade: a new antiarrhythmic mechanism? Effect of RP58866 on ventricular arrhythmias in rat, rabbit, and primate. Circulation, 1993, 87 (6): 1979～1989.
, 百拇医药
[3]Mclarnon JG, Xu R. Actions of the benzopyran compound terikalant on macroscopic currents in rat ventricular myocytes. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 275 (1): 389～396.
[4]Yang BF (杨宝峰), Li GR (李贵荣), Xu CQ (徐长庆) et al. Effects of RP58866 on transmembrane K+ currents in mammalian ventricular myocyte. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1999, 20 (6): 537～540.
[5]Yang BF (杨宝峰), Sun JP (孙建平), Li GR (李贵荣), et al. Actions of class Ⅲ antiarrhymic agent RP58866 on inward rectifier K+ current and transient outward K+ current in guinea pig and dog. Acta Pharm Sin (药学学报), 1999, 34 (10): 730～733.
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[6]Yang BF (杨宝峰), Li YR (李玉荣), Xu CQ (徐长庆)et al. Voltage-dependent inhibition of the delayed outward potassium current by benzytetrahydropalmatine in isolated atrial single cell in guinea pig heart. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学与毒理学杂志), 1994, 8 (2): 92～96.
[7]Yang BF, Xu CQ, Luo DL et al. Effects of artemisinin on transmembrane K+ currents in mammalian ventricular myocytes. Asia-Pac J Pharmacol, 1998, 13: 9～17.
[8]Escande D, Mestre M, Hardy JC et al. RP58866, a pure class Ⅲ antiarrhythmic agent, specifically blocks the inwardly rectifying K+ current in heart cells. Circulation, 1989, 80 Suppl 2: 607., 百拇医药
关键词： RP62719； 内向整流钾电流； 瞬时外向钾电流； 延迟外向钾电流； 半数抑制浓度 (IC50)
摘要：Untitled Document使用全细胞膜片箝技术, 研究RP62719对内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)和延迟外向整流钾电流(IK)的作用, 并探讨其抗心律失常作用的机制。实验结果表明, 在指令电压为-100 mV时, RP62719可显著抑制豚鼠心室肌细胞IK1, 半数抑制浓度(IC50)为5.0±1.0 μmol/L。RP62719 10 μmol/L在+40 mV时对犬心室肌细胞Ito抑制率为84.0±4.4%, IC50为1.2±0.51 μmol/L。在+40 mV时, 50 μmol/L RP62719还可使豚鼠心室肌细胞IKstep 减少50.0±8.3%, IKtail减少56.0±4.9%, IC50分别为4.2/±0.8 μmol/L和3.3±0.75 μmol/L。提示RP62719抗心律失常的离子机制与其对IK1、Ito及IK的抑制有关。
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以往的研究表明, 苯吡喃衍生物RP62719可剂量依赖性地延长心房、心室的动作电位时程, 在多种心律失常模型上有抗心律失常作用。膜片箝实验证明, RP62179是内向整流钾电流(IK1)的特异性阻断剂[1,2], 对瞬时外向钾电流(Ito)也有一定抑制作用[3], 但关于RP62179 对延迟外向钾电流 (IK) 的影响报道较少。本实验拟以全细胞膜片箝技术, 观察RP62719对豚鼠心室肌细胞IK1和IK及犬心室肌细胞Ito的影响, 探讨其抗心律失常作用的离子机制。
将健康豚鼠(250～400 g)击昏后开胸暴露心脏, 迅速取心脏置于冰冷无钙液中, 并连于Langendoff灌流架的主动脉插管上进行逆行灌流。在细胞外液冲洗10 min后, 以无钙液灌流5 min, 再用含胶原酶Ⅰ型0.4 mg/ml的无钙液循环灌流5 min。之后, 每隔2 min剪下一小块心室肌置于贮存液中吹打震荡, 使细胞散开, 共取8～10次。细胞混悬液置于4℃冰箱中稳定1 h后备用[4]。给健康犬(18～25 kg), 静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后, 开胸取下心脏, 置于冰冷无钙液中。然后剪下连于左冠状动脉前降支的心肌组织块约1～1.5 cm3, 再将冠状动脉前降支连于Langendoff灌流架上进行灌流, 以含胶原酶1 mg/ml的无钙液循环灌流20 min, 其它步骤见豚鼠心室肌细胞制备[5]。
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细胞外液的组成(mmol/L) NaCl 126.0, KCl 5.4, MgCl2 1.0, CaCl2 1.0, NaH2PO4 0.33, glucose 10.0, HEPES 10.0, pH 7.4。贮存液: KCl 20.0, potassium glutamate 70.0, taurine 10.0, KH2PO4 10.0, glucose 10.0, EGTA 5.0, β-hydroxbutyric acid 10.0 及albumin 1.0%, pH 7.3。电极内液: KCl 20.0, potassium aspartate 110.0, MgCl2 1.0, HEPES 10.0, EGTA 5.0, GTP 0.1, Mg-ATP 5.0, pH 7.4。RP62719以蒸馏水配制, 系加拿大蒙特利尔心脏研究所提供。BaCl2、 CdCl2 (Sigma)均配制为0.2 mol/L,用于阻断IK1和/或ICa。
离子通道电流的记录及处理 取分离好的细胞悬液1～2滴置于装有细胞外液的浴槽中。细胞贴壁后, 用内充电极液的玻璃微电极与心室肌细胞形成高阻封接(>10 GΩ)。 通过Pclamp 6.02软件发放不同刺激参数的阶跃脉冲, 通道电流经探头输入Axopatch 200A膜片箝放大器, 并微机贮存。实验数据由clampfit软件进行统计学处理,以通道电流变化为纵坐标、指令电压(TP)为横坐标绘制I-V曲线, 得出均数±标准差。浴槽液温度为36±0.5℃, 灌流液系细胞外液或加入了RP62719及各种阻断剂, 流速为1～2 ml/min[6,7]。
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1. RP62719对豚鼠心室肌细胞IK1的影响
当电极尖端与豚鼠心室肌细胞形成高阻封接并进一步形成全细胞构型后, 施予-60 mV保持电压, 使指令电压从-120 mV到0 mV之间变化, 每次持续300 ms阶跃10 mV。 用Cd2+ (0.2 mmol/L) 阻断ICa后, 可见到一内向电流IK1。 当指令电压在-100 mV时, IK1可达 5769.1±764.9 pA; 分别给予5、 50μmol/L RP62719时, IK1峰值明显减少, 分别为3?836.9±807 pA和2?333.0±809 pA (P<0.001 n=6)。其半数抑制浓度(IC50)为5.0±1.0 μmol/L。用细胞外液冲洗20 min, IK1恢复约80%, IK1峰值为4054.8±782.6 pA。
2. RP62719对犬心室肌细胞Ito的影响
当电极尖端与犬心室肌细胞形成全细胞构型后, 在浴液中加入下列阻断剂, 使终浓度为Cd2+ 0.2 mmol/L, Ba2+ 0.2 mmol/L及ryanodine 20 μmol/L, 分别阻断ICa, IK1和ICa·cl。当保持电压为-80 mV, 步阶电压为10 mV, 指令电压在从-40 mV到+40 mV除极电压间, 持续时间为100 ms时, 在犬心室肌细胞上可记录到Ito; 当指令电压为+40 mV时, 该电流峰值为824.0±132.5 pA。分别给予1、10 μmol/L RP62719, 可见到 Ito峰值减小。10 μmol/L RP62719可使峰电流减小84.0±4.4%, 与对照组相比差异显著(P<0.001, n=7)。同时, RP62719对Ito的抑制效应具有浓度依赖性, IC50为1.2±0.51 μmol/L。 洗脱后Ito峰值恢复至539.4±35.1 pA 。
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3. RP62719对豚鼠心室肌细胞IK的影响
在灌流的细胞外液中加入Cd2+和Ba2+使终浓度为0.2 mmol/L, 分别阻断ICa和IK1。当保持电压为-60 mV、指令电压+40 mV、持续时间200 ms、刺激频率1 Hz时, 在6个豚鼠心室肌细胞上记录到延迟外向钾电流IKstep及其尾电流IKtail, 其峰电流分别为581.9±120.2 pA 和404.8±48.0 pA。 在分别给予5、50 μmol/L RP62719后, IKstep分别为456.1±74.1和239.6±68.8 pA, 其抑制率为22.0±4.0%和50.0±8.3%。与对照组相比差异显著(P<0.01,n=6)。而IKtail则分别为287.2±34.0 pA 和183.5±35.9 pA, 分别抑制了29.0±8.4%和56.0±4.9%, 差异显著(P<0.01,n=6)。其IC50 在IKstep为4.2±0.8 μmol/L, IKtail为3.3±0.75 μmol/L, 且具有浓度依赖性关系, RP62719对IK的作用表现为可逆性。
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Mclarnon研究证明, RP62719是Ⅲ类抗心律失常药物, 其延长动作电位时程的作用与抑制Ito有关[3]。但该研究抑制大鼠心室肌细胞Ito使用的药物浓度较高, 达1～60 mmol/L。我们的研究证明, RP62719抑制犬心室肌细胞Ito的IC50只有1～2 μmol/L, 这种浓度差异可能与动物种属有关。Escnde Denis等通过膜片箝实验认为, RP62719的抗心律失常作用是由于该药特异性地阻断了心肌内向整流钾电流IK1的结果, 并将其作为IK1的特异阻断剂[1,8]。但本研究证明, RP62719对IK1、Ito、IKstep及IKtail均有抑制作用, 且抑制Ito作用强于IK1、IKstep及IKtail 。此点是否与动物种属不同有关, 尚待进一步研究。RP62719对上述钾电流的抑制作用与RP58866的作用相似[4,5]。其对IKstep 和IKtail抑制作用与IK的两种组分IKr 和IKs的关系也有待于进一步深入研究。一个较理想的抗心律失常药物, 应对多种离子通道有抑制作用。 本实验证明RP62719对IK1、 Ito、 IKstep及 IKtail均有抑制作用, 由于动作电位时程在多个环节延长, 因而此作用可能是该药作为Ⅲ类抗心律失常药发挥作用的重要离子机制。
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参考文献
[1]Escande D, Mestre M, Cavero I et al. RP58866 and its active enantiomer RP62719 (terikalant): Blockers of the inward rectifier K+ current acting as pure class Ⅲ antiarrhymic agents. J Cardiovasc Pharmacol, 1992,20 Suppl 2: Sl06～S113.
[2]Rees SA, Curtis MJ. Specific IK1 blockade: a new antiarrhythmic mechanism? Effect of RP58866 on ventricular arrhythmias in rat, rabbit, and primate. Circulation, 1993, 87 (6): 1979～1989.
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[3]Mclarnon JG, Xu R. Actions of the benzopyran compound terikalant on macroscopic currents in rat ventricular myocytes. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 275 (1): 389～396.
[4]Yang BF (杨宝峰), Li GR (李贵荣), Xu CQ (徐长庆) et al. Effects of RP58866 on transmembrane K+ currents in mammalian ventricular myocyte. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1999, 20 (6): 537～540.
[5]Yang BF (杨宝峰), Sun JP (孙建平), Li GR (李贵荣), et al. Actions of class Ⅲ antiarrhymic agent RP58866 on inward rectifier K+ current and transient outward K+ current in guinea pig and dog. Acta Pharm Sin (药学学报), 1999, 34 (10): 730～733.
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[6]Yang BF (杨宝峰), Li YR (李玉荣), Xu CQ (徐长庆)et al. Voltage-dependent inhibition of the delayed outward potassium current by benzytetrahydropalmatine in isolated atrial single cell in guinea pig heart. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学与毒理学杂志), 1994, 8 (2): 92～96.
[7]Yang BF, Xu CQ, Luo DL et al. Effects of artemisinin on transmembrane K+ currents in mammalian ventricular myocytes. Asia-Pac J Pharmacol, 1998, 13: 9～17.
[8]Escande D, Mestre M, Hardy JC et al. RP58866, a pure class Ⅲ antiarrhythmic agent, specifically blocks the inwardly rectifying K+ current in heart cells. Circulation, 1989, 80 Suppl 2: 607., 百拇医药