孵育法处理不液化精液的初步研究
作者：王新生 王沛涛 刘海宁
单位：青岛大学医学院附属医院 山东青岛 266003
关键词：精液不液化 体外 孵育
山东医药002103 摘要 为建立一种体外处理不液化精液的有效方法，将20例不育症患者不液化精液每份分成对照组、离心洗涤组(下称离心组)、孵育组，分别检测三组样本精子的多项功能指标。结果孵育组、离心组精子功能指标优于对照组(P<0.01或0.001)，孵育组精子回收率和某些指标优于离心组(P<0.05或0.01)。认为孵育法处理不液化精液的简便方法，效果可靠，值得推广应用。
中图分类号：R697 文献标识码：A
Abstract To establish an effective method of in vitro treating nonliquefying semen.The nonliquefying semen from20 patients with infertility were divided into contrast group,centrifugal group and incubation group.The functional pararmeters of the sperm of three groups were examined.Results showed that the parameters of the other two groups were better than that of the contrast group(P<0.01 or 0.001)and the retrieval rate and several functional parameters of sperm in the incubation group were better than centrifugal group obviously (P<0.05 or 0.01).This suggest the incubation method is effective methed of the treating of noniquefying semen,and is deserved to be widely used clinically.
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Keywords Nonliquefying In vitro Incubation
临床治疗精液不液化所致男性不育症多先应用各种体外处理技术对不液化精液进行处理，再行人工授精，此法常用且有效。处理精液的方法主要有精液吹打法、玻璃纤维滤过法、体外加酶法、离心洗涤法等，其中离心洗涤法较多采用〔1〕。本研究根据不液化精液的物理特性，采用孵育法处理不液化精液，对处理后精子的多项功能指标进行了对照观察分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 取20例不育夫妇的不液化精液(禁房事3～7天，37℃恒温水浴30分钟不液化)。精子体外处理介质为HAM′S/F10溶液(Hyclone)+10%小牛血清。宫颈粘液(CM)：健康女性月经中期宫颈粘液，评分10分以上。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2 1 精液处理方法 将每份不液化精液分为3份进行分组处理。①对照组(20例)：精液置洁净的容器中，置于37℃的水浴箱内，90分钟后进行实验观察。②离心组(20例)：按1∶9比例将精液与处理介质混合，轻轻搅拌后离心(1500r/min)15分钟弃上清；在沉淀物上加5ml处理介质，37℃恒温水浴箱内孵育60分钟，收集上层介质于离心管内，离心(1500r/min)15分钟弃上清，再加5ml处理介质，混匀后孵育10分钟，测定相关指标〔2〕。③孵育组(20)例：将不液化精液分别加入数个(据精液量定)盛有2ml处理介质的小烧杯内，精液量不超过0.5ml，轻轻搅拌一下，37℃水浴箱内孵育60分钟取出，分别将混合液中不液化的精液轻轻吸弃，收集剩余溶液于离心管内，离心(2000r/min)15分钟弃上清，沉淀部分加入0.5ml处理介质，轻轻摇匀，孵育10分钟。
1.2.2 精液指标测定 ①精子计数：精子稀释液稀释后用细胞计数板计数。②精子活率：染色法。③精子活动力：计数3、4级活动力精子的百分率。④精子尾部肿胀率：低渗溶液中精子尾部发生肿胀的百分率。⑤精子CM穿造试验：37℃恒温水浴箱内，精子30分钟穿过CM的距离〔3〕。
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1.2.3 统计学方法 计算各组精子观察指标，求出平均值和标准差。对不同组间同一观察指标进行统计学分析(精子回收率为精子计数与对照组精子计数比较所得)。
2 结果
本研究所用精液样本容积2～4.5ml，精子计数4000万～5000万，活动率47%～72%。结果显示，与对照组比较，孵育组和离心组精子活动率和精子活动力均有显著性提高，精子CM穿透力和尾部肿胀率也高于对照组(分别为P<0.01或0.001)。孵育组与离心组的精子回收率分别为45%和30%(P<0.001)，孵育组精子活率、活动力、精子CM穿透力和尾部肿胀率高于离心组(P<0.05或0.01)，见表1。
表1 三组精子检测结果比较(
±s)
, 百拇医药
活率(%)
活动力(%)
尾部肿胀率(%)
CM穿透力(cm)
对照组
56.23±12.54
34.25±7.54
67.23±9.36
2.31±0.45
孵育组
83.76±13.15*
86.34±9.34**
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90.48±8.62*
4.32±0.37**
离心组
77.54±10.87*
63.76±7.84*
77.51±10.10＃
3.26±0.56**
注：与对照组比较，*P<0.01，**P<0.001，＃P<0.053 讨论
刚射出的精液在精囊分泌的凝固因子作用下呈粘厚、凝冻状，射出体外10～20分钟后，在前列腺分泌的液化因子作用下液化。精液液化因子是由一系列的蛋白水解酶组成。精液不液化不仅可影响精子活力和存活率，也会影响其穿透宫颈粘液的能力，导致不育。
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不液化精液的处理方法较多，但各种方法均有缺陷。如加酶法因淀粉酶浓度过高会对精子造成损伤，影响精子正常的结构和功能〔4〕。BSA柱能够筛出质量较高的精子，并可去除精液中的死精子、炎性细胞及其它杂质，但操作相对复杂，费用较高，精子的回收率偏低。本文结果显示，离心组、孵育组处理后的精液和对照组相比，其精子活动率，精子穿透能力等均明显提高(P<0.01或0.001)。而比较两种处理方法可以看出，孵育法处理后，精子的功能指标好于离心法，特别是精子回收率和精子CM穿透能力，差异有显著性(P<0.001或0.01)。离心法将精液离心沉淀后上游，离心后精子在沉淀物内的运动能力受到较大的影响，由于少部分的精子可以上游到处理介质内，故致精子回收率较低，反复离心对精子也会造成损伤。孵育法使不液化精液中的精子在离心处理前即与处理介质长时间充分接触，大量活动力好的精子游入处理介质中，由于粘滞度很高的精浆同处理介质间有较好的不相互融合性，因此孵育一定时间后，将不液化部分的精液连同其中残留的死精子、炎症细胞等吸弃，将孵育后的介质溶液经过离心浓缩，就可以获得数量较多、活动率高、活动力强的精子。本文结果证实，孵育法是临床处理不液化精液的可靠方法，为因男方精液不液化的不育夫妇提供了一种有效治疗方法，值得推广应用。
, 百拇医药
参考文献
1.邵世修，姜学军，王瑞东，等.不液化精液体外处理的初步研究.青岛医学院学报，1998，34(1)：39.
2.郭应禄，胡礼泉主编.临床男科学.第一版，武汉：湖北科学技术出版社，1996，270.
3.吕德斌，黄平治主编.实用简明男性学.第一版，哈尔滨：哈尔滨出版社，1988，153.
4.Janp,Rob E ,Catharima S,et al.Pregnamcy rate is significantly higher in vitro fertilization Procedure with speimatozoa isolated from norliquefying semdn in which liquefication is reduced by amylase.Feitil Steril,1989，51(1)：149.
(2000-09-10 收稿), 百拇医药
单位：青岛大学医学院附属医院 山东青岛 266003
关键词：精液不液化 体外 孵育
山东医药002103 摘要 为建立一种体外处理不液化精液的有效方法，将20例不育症患者不液化精液每份分成对照组、离心洗涤组(下称离心组)、孵育组，分别检测三组样本精子的多项功能指标。结果孵育组、离心组精子功能指标优于对照组(P<0.01或0.001)，孵育组精子回收率和某些指标优于离心组(P<0.05或0.01)。认为孵育法处理不液化精液的简便方法，效果可靠，值得推广应用。
中图分类号：R697 文献标识码：A
Abstract To establish an effective method of in vitro treating nonliquefying semen.The nonliquefying semen from20 patients with infertility were divided into contrast group,centrifugal group and incubation group.The functional pararmeters of the sperm of three groups were examined.Results showed that the parameters of the other two groups were better than that of the contrast group(P<0.01 or 0.001)and the retrieval rate and several functional parameters of sperm in the incubation group were better than centrifugal group obviously (P<0.05 or 0.01).This suggest the incubation method is effective methed of the treating of noniquefying semen,and is deserved to be widely used clinically.
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Keywords Nonliquefying In vitro Incubation
临床治疗精液不液化所致男性不育症多先应用各种体外处理技术对不液化精液进行处理，再行人工授精，此法常用且有效。处理精液的方法主要有精液吹打法、玻璃纤维滤过法、体外加酶法、离心洗涤法等，其中离心洗涤法较多采用〔1〕。本研究根据不液化精液的物理特性，采用孵育法处理不液化精液，对处理后精子的多项功能指标进行了对照观察分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 取20例不育夫妇的不液化精液(禁房事3～7天，37℃恒温水浴30分钟不液化)。精子体外处理介质为HAM′S/F10溶液(Hyclone)+10%小牛血清。宫颈粘液(CM)：健康女性月经中期宫颈粘液，评分10分以上。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2 1 精液处理方法 将每份不液化精液分为3份进行分组处理。①对照组(20例)：精液置洁净的容器中，置于37℃的水浴箱内，90分钟后进行实验观察。②离心组(20例)：按1∶9比例将精液与处理介质混合，轻轻搅拌后离心(1500r/min)15分钟弃上清；在沉淀物上加5ml处理介质，37℃恒温水浴箱内孵育60分钟，收集上层介质于离心管内，离心(1500r/min)15分钟弃上清，再加5ml处理介质，混匀后孵育10分钟，测定相关指标〔2〕。③孵育组(20)例：将不液化精液分别加入数个(据精液量定)盛有2ml处理介质的小烧杯内，精液量不超过0.5ml，轻轻搅拌一下，37℃水浴箱内孵育60分钟取出，分别将混合液中不液化的精液轻轻吸弃，收集剩余溶液于离心管内，离心(2000r/min)15分钟弃上清，沉淀部分加入0.5ml处理介质，轻轻摇匀，孵育10分钟。
1.2.2 精液指标测定 ①精子计数：精子稀释液稀释后用细胞计数板计数。②精子活率：染色法。③精子活动力：计数3、4级活动力精子的百分率。④精子尾部肿胀率：低渗溶液中精子尾部发生肿胀的百分率。⑤精子CM穿造试验：37℃恒温水浴箱内，精子30分钟穿过CM的距离〔3〕。
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1.2.3 统计学方法 计算各组精子观察指标，求出平均值和标准差。对不同组间同一观察指标进行统计学分析(精子回收率为精子计数与对照组精子计数比较所得)。
2 结果
本研究所用精液样本容积2～4.5ml，精子计数4000万～5000万，活动率47%～72%。结果显示，与对照组比较，孵育组和离心组精子活动率和精子活动力均有显著性提高，精子CM穿透力和尾部肿胀率也高于对照组(分别为P<0.01或0.001)。孵育组与离心组的精子回收率分别为45%和30%(P<0.001)，孵育组精子活率、活动力、精子CM穿透力和尾部肿胀率高于离心组(P<0.05或0.01)，见表1。
表1 三组精子检测结果比较(
±s), 百拇医药
活率(%)
活动力(%)
尾部肿胀率(%)
CM穿透力(cm)
对照组
56.23±12.54
34.25±7.54
67.23±9.36
2.31±0.45
孵育组
83.76±13.15*
86.34±9.34**
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90.48±8.62*
4.32±0.37**
离心组
77.54±10.87*
63.76±7.84*
77.51±10.10＃
3.26±0.56**
注：与对照组比较，*P<0.01，**P<0.001，＃P<0.053 讨论
刚射出的精液在精囊分泌的凝固因子作用下呈粘厚、凝冻状，射出体外10～20分钟后，在前列腺分泌的液化因子作用下液化。精液液化因子是由一系列的蛋白水解酶组成。精液不液化不仅可影响精子活力和存活率，也会影响其穿透宫颈粘液的能力，导致不育。
, http://www.100md.com
不液化精液的处理方法较多，但各种方法均有缺陷。如加酶法因淀粉酶浓度过高会对精子造成损伤，影响精子正常的结构和功能〔4〕。BSA柱能够筛出质量较高的精子，并可去除精液中的死精子、炎性细胞及其它杂质，但操作相对复杂，费用较高，精子的回收率偏低。本文结果显示，离心组、孵育组处理后的精液和对照组相比，其精子活动率，精子穿透能力等均明显提高(P<0.01或0.001)。而比较两种处理方法可以看出，孵育法处理后，精子的功能指标好于离心法，特别是精子回收率和精子CM穿透能力，差异有显著性(P<0.001或0.01)。离心法将精液离心沉淀后上游，离心后精子在沉淀物内的运动能力受到较大的影响，由于少部分的精子可以上游到处理介质内，故致精子回收率较低，反复离心对精子也会造成损伤。孵育法使不液化精液中的精子在离心处理前即与处理介质长时间充分接触，大量活动力好的精子游入处理介质中，由于粘滞度很高的精浆同处理介质间有较好的不相互融合性，因此孵育一定时间后，将不液化部分的精液连同其中残留的死精子、炎症细胞等吸弃，将孵育后的介质溶液经过离心浓缩，就可以获得数量较多、活动率高、活动力强的精子。本文结果证实，孵育法是临床处理不液化精液的可靠方法，为因男方精液不液化的不育夫妇提供了一种有效治疗方法，值得推广应用。
, 百拇医药
参考文献
1.邵世修，姜学军，王瑞东，等.不液化精液体外处理的初步研究.青岛医学院学报，1998，34(1)：39.
2.郭应禄，胡礼泉主编.临床男科学.第一版，武汉：湖北科学技术出版社，1996，270.
3.吕德斌，黄平治主编.实用简明男性学.第一版，哈尔滨：哈尔滨出版社，1988，153.
4.Janp,Rob E ,Catharima S,et al.Pregnamcy rate is significantly higher in vitro fertilization Procedure with speimatozoa isolated from norliquefying semdn in which liquefication is reduced by amylase.Feitil Steril,1989，51(1)：149.
(2000-09-10 收稿), 百拇医药