颈动脉粥样硬化病人血单个核细胞中低密度脂蛋白受体基因表达的研究*
作者：王拥军 张力群 于 凯 刘 璐
单位：首都医科大学宣武医院(100053) 神经内科
关键词：颈动脉；动脉粥样硬化；低密度脂蛋白受体；基因表达
颈动脉粥样硬化病人血单个核细胞中 低密度脂蛋白受体基因表达的研究 摘要 研究颈动脉粥样硬化病人外周血单个核细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)基因表达与颈动脉粥样硬化程度的相关性。选择颈动脉粥样硬化病人35例和对照组31例，采用逆转录PCR (RT-PCR)定量测定LDLR的基因表达，以β-actin作为内标物。颈动脉粥样硬化病人外周血单核细胞LDLR基因表达量低于对照组，LDLR基因表达量与血中低密度脂蛋白(LDL)水平呈负相关。LDLR表达减少参与了颈动脉粥样硬化的发病过程。
Expression of LDLR Gene in Monocytic Cells in
, http://www.100md.com
the Patients with Carotid Atherosclerosis
Wang Yongjun,Zhang Liqun,Yu Kai,et al.
Department of Neurology,Xuanwu Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing (100053)
Abstract We have investigated low density lipoprotein receptor(LDLR)gene expression in periphery blood monocytic cells (PBMC)and their relation to carotid atheroslerosis.We studied 35 patient with carotid atherosclerosis and 31 control subjects.We quantified the expression of LDLR gene by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) with β-actin as the internal standard.LDLR gene expression was significantly reduced in the patient group,as compared to the control group.The levels of LDLR gene expression correlated negatively with serum low density lipoprotein (LDL) levels.The reduced expression of LDLR gene is responsible to carotid atherosclerosis.
, 百拇医药
Key words: Carotid artery;Atheroclerosis;Low density lipoprotein receptor;Gene expression
颈动脉粥样硬化是脑血管病重要的危险因素，颈动脉粥样硬化的发病是一个复杂的过程，其中涉及低密度脂蛋白(LDL)的代谢。LDL受体(LDLR)通过胞吞作用将LDL吞入细胞内，进而起到降解LDL的作用。1982年Scheider等首先从牛的肾上腺分离纯化了LDLR[1]，1983年Russell克隆了这一分子羧基端三分之一的cDNA[2]，1984年Yamamoto等报告了人LDLR的全基因顺序[3]，以后世界各地实验室对这一基因进行了广泛的研究，但是研究集中于基因多态性和粥样硬化斑块基因表达上，很少研究外周血单个核细胞LDLR的基因表达。LDLR主要存在于肝脏和外周血单核细胞上，测定LDLR受体的表达可以反映LDL的代谢状态，而LDL是动脉粥样硬化形成的重要因素，因此研究外周血单个核细胞LDLR的基因表达有助于理解动脉粥样硬化的发病机制。
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材料和方法
一、 研究对象 颈动脉粥样硬化的诊断使用颈动脉双功能超声(Duplex)[4]，以测得狭窄率作为颈动脉粥样硬化程度的指标。有多处斑块者，以狭窄率最高处计。共选择颈动脉粥样硬化组35例，其中男19例，女16例，平均年龄62.1±10.4岁。对照组31例，其中男17例，女14例，平均年龄59.9±6.5岁。
二、血单个核细胞LDLR基因表达的测定 所有受检者于晨8～9点空腹采集静脉血5ml，0.2%EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞(PBMC)。用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取总RNA，使用Oligo(dT)随机引物逆转录获得cDNA模板。取逆转录cDNA模板10μl，加入一定量的LDLR引物和内标物β-actin引物在PE2400基因扩增仪中进行PCR扩增。扩增产物经2%琼脂糖电泳，电泳完毕后，在GDS 8000凝胶扫描仪中进行扫描，测定LDLR和β-actin产物的光密度，以LDLR/β-actin光密度的比值表示LDLR基因表达水平。
, 百拇医药
LDLR和β-actin扩增引物按照Pietsch设计的引物[5]，LDLR的引物顺序为：5′-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3′，5′-TCTGTCTCGAGGGGAGCTG-3′，扩增产物为258bp。β-actin的引物顺序为：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增产物540bp。
逆转录方法：取2μg总RNA(约8μl)，依次加入5×Buffer 4μl，2.5mmol/LdNTP3μl,0.5μg/μl随机引物Oligo(dT)1μl，40μ/μl RNAsin 1μl，0.1MDTT 2μl，200μ/μl mmlv反转录酶1μl，加入去RNA酶水，使总体积达20μl。37℃1h，95℃ 5 min止反应。
取反转录产物10μl，依次加入10×Buffer5μl，25mM MgCl25μl，2.5mM dNTP4μl，CD36上游引物(40pM)2μl，下游引物(40pM)2μl，β-actin上游引物(20pM)2μl，下游引物(20pM)2μl，5μ/μl Taq DNA合成酶1μl，加双蒸水补总体积至50μl。变性95℃30秒，退火58℃1min，延伸72℃1min，循环30次，终延伸72℃10min。
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三、 血清LDL含量测定 血清LDL测定采用中生试剂公司提供的试剂盒，操作完全按照试剂盒的要求。
四、统计学方法 所有数据采用SPSS软件处理，数值表达为均数±标准差，两样本均数比较采用Student t检验，两变量相关分析采用直线相关与回归。
结果
一、RT-PCR产物 电泳定量，LDLR cDNA片段为260bp，β-actin cDNA片段为540bp，分别与所设计的相应的cDNA片段相同，表明扩增产物即为本实验的目的基因片段(图1)。
图1 RT-PCR扩增LDLR和β-actin基因片段琼脂糖凝胶电泳
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二、颈动脉粥样硬化组和对照组LDLR mRNA表达水平分别取颈动脉粥样硬化患者和正常对照者PBMC提取的总RNA，测定LDLR mRNA量。发现颈动脉粥样硬化患 者的LDLR mRNA表达量(0.25±0.10)低于正常对照组(0.49±0.17)，两者有显著性差异(P<0.001)。
三、人PBMC LDLR mRNA表达量与血浆中LDL关系将人PBMC LDLR mRNA表达量与血清中LDL含量显示于图2。从图中可见LDLR与LDL存在负相关，相关分析表明r=0.26,P<0.05，回归方程为LDL=153.87～57.40LDLR。
图2 人PBMC LDLR mRNA表达量与血浆中LDL关系
, 百拇医药
讨论
LDLR是血浆胆固醇降解代谢的主要途径。其在胆固醇代谢中有双重作用：一方面增加循环中中密度脂蛋白(IDL)的清除，以减少LDL的产生：另一方面，LDLR介导细胞摄取LDL以增加LDL的降解。细胞培养的研究提示，细胞LDLR表达量受细胞内胆固醇浓度的调节，当细胞内有大量胆固醇堆积时，LDLR表达量减少。已经证实血浆胆固醇水平很大程度上取决于LDLR基因表达水平的高低[6]，即LDLR表达水平降低，则血浆胆固醇降解受阻，造成高脂血症，而高脂血症与动脉粥样硬化直接相关。Wang等[7]在颈动脉和冠状动脉组织中对LDLR mRNA含量的RT-PCR测定结果表明，动脉粥样硬化斑块中LDLR转录水平明显低于正常动脉组织，直接提示动脉粥样硬化形成与LDLR低表达相关。
LDLR大部分分布在肝脏，新鲜人外周血单个核细胞表面具有LDLR，其表达水平的高低代表人体内其他细胞特别是肝细胞的LDLR状况[8]。本研究结果发现动脉粥样硬化患者的单个核细胞LDLR水平较正常对照组明显降低。
, http://www.100md.com
对所有受检者PBMC LDLR mRNA表达量与血浆中LDL水平做相关分析表明有统计意义两者是负相关。LDLR表达的调控是负向调节的，采取适当措施解除抑制LDLR表达的因素，有可能成为防治动脉粥样硬化的有效手段，动物实验发现正红花油对LDLR的表达可能有正向调节作用。[9]。
对颈动脉粥样硬化形成机制的研究目的在于采取有效措施预防和延缓其发生。动脉粥样硬化形成过程是一个十分复杂的过程，摄取适当低的动物脂肪食物，即选择低胆固醇及低饱和脂肪的膳食，有利于控制血浆胆固醇特别是LDL的浓度，去除对LDLR表达的抑制，必要时适当调控其表达，可有效降低LDL浓度。 这样，相信可有效预防和治疗动脉粥样硬化，进而减少脑血管病的发生。
* 本课题为北京市科技新星计划和北京市优秀青年知识分子基金资助项目
参考文献
, 百拇医药 [1] Schneider WJ,Beisigei V,Goldstein JL,et al.Purification of the low density lipoprotein receptor,a acidic glycoprotein of 164 000 molecular weight.J Biol Chem,1982,257:2664～2670.
[2] Russell DW,Yamamoto T,Schneider WJ,et al. CNDA clonong of the bovine low density lipoprotein receptor feedback regulation of a recptor mRNA.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80:7501～7507.
[3] Yamamoto T,Davis CG,Brown MS,et al.The human LDL receptor:a cystein-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA.Cell,1984,39:27～33.
, http://www.100md.com
[4] Talyor DC,Strandness DE.Carotid artery duplex scanning.J Clin Ultrasound,1987,15:635～639.
[5] Pitsch A,Eri W.Lovastatin reduces expression of the combined adhesion and scavenger receptor CD36 in human monocytic cells. Biochem Pharmacol,1996,52:433～439.
[6] Lecras TD,Gherardi E,and Bowyer DE,A sensitive Rnase protection assay for the quantitation of the mRNAs for the LDL receptor and HMG-CoA reductase in human total RNA.Atherosclerosis,1991,90:81～90.
, 百拇医药
[7] Wang AM,Doyle MV,and Mark DF.Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction.Poc Natl Acad,1992,1127:57～66.
[8] Cuthbert JA,Russell DW,and Lipsky PE.Regulation of low density lipoprotein receptor gene expression in human lymphocytes.J Biol Chem,1989,264:1298～1303.
[9] Horton JD,Cuthberty JA,and Spady DK.Dietary fatty acide regulate hepatic low density lipoprotein transport by altering LDL receptor protein and mRNA levels.J Clin Invest,1993,92:743～749.
(1998-08-10收稿)
(1998-09-01修改), 百拇医药
单位：首都医科大学宣武医院(100053) 神经内科
关键词：颈动脉；动脉粥样硬化；低密度脂蛋白受体；基因表达
颈动脉粥样硬化病人血单个核细胞中 低密度脂蛋白受体基因表达的研究 摘要 研究颈动脉粥样硬化病人外周血单个核细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)基因表达与颈动脉粥样硬化程度的相关性。选择颈动脉粥样硬化病人35例和对照组31例，采用逆转录PCR (RT-PCR)定量测定LDLR的基因表达，以β-actin作为内标物。颈动脉粥样硬化病人外周血单核细胞LDLR基因表达量低于对照组，LDLR基因表达量与血中低密度脂蛋白(LDL)水平呈负相关。LDLR表达减少参与了颈动脉粥样硬化的发病过程。
Expression of LDLR Gene in Monocytic Cells in
, http://www.100md.com
the Patients with Carotid Atherosclerosis
Wang Yongjun,Zhang Liqun,Yu Kai,et al.
Department of Neurology,Xuanwu Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing (100053)
Abstract We have investigated low density lipoprotein receptor(LDLR)gene expression in periphery blood monocytic cells (PBMC)and their relation to carotid atheroslerosis.We studied 35 patient with carotid atherosclerosis and 31 control subjects.We quantified the expression of LDLR gene by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) with β-actin as the internal standard.LDLR gene expression was significantly reduced in the patient group,as compared to the control group.The levels of LDLR gene expression correlated negatively with serum low density lipoprotein (LDL) levels.The reduced expression of LDLR gene is responsible to carotid atherosclerosis.
, 百拇医药
Key words: Carotid artery;Atheroclerosis;Low density lipoprotein receptor;Gene expression
颈动脉粥样硬化是脑血管病重要的危险因素，颈动脉粥样硬化的发病是一个复杂的过程，其中涉及低密度脂蛋白(LDL)的代谢。LDL受体(LDLR)通过胞吞作用将LDL吞入细胞内，进而起到降解LDL的作用。1982年Scheider等首先从牛的肾上腺分离纯化了LDLR[1]，1983年Russell克隆了这一分子羧基端三分之一的cDNA[2]，1984年Yamamoto等报告了人LDLR的全基因顺序[3]，以后世界各地实验室对这一基因进行了广泛的研究，但是研究集中于基因多态性和粥样硬化斑块基因表达上，很少研究外周血单个核细胞LDLR的基因表达。LDLR主要存在于肝脏和外周血单核细胞上，测定LDLR受体的表达可以反映LDL的代谢状态，而LDL是动脉粥样硬化形成的重要因素，因此研究外周血单个核细胞LDLR的基因表达有助于理解动脉粥样硬化的发病机制。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、 研究对象 颈动脉粥样硬化的诊断使用颈动脉双功能超声(Duplex)[4]，以测得狭窄率作为颈动脉粥样硬化程度的指标。有多处斑块者，以狭窄率最高处计。共选择颈动脉粥样硬化组35例，其中男19例，女16例，平均年龄62.1±10.4岁。对照组31例，其中男17例，女14例，平均年龄59.9±6.5岁。
二、血单个核细胞LDLR基因表达的测定 所有受检者于晨8～9点空腹采集静脉血5ml，0.2%EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞(PBMC)。用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取总RNA，使用Oligo(dT)随机引物逆转录获得cDNA模板。取逆转录cDNA模板10μl，加入一定量的LDLR引物和内标物β-actin引物在PE2400基因扩增仪中进行PCR扩增。扩增产物经2%琼脂糖电泳，电泳完毕后，在GDS 8000凝胶扫描仪中进行扫描，测定LDLR和β-actin产物的光密度，以LDLR/β-actin光密度的比值表示LDLR基因表达水平。
, 百拇医药
LDLR和β-actin扩增引物按照Pietsch设计的引物[5]，LDLR的引物顺序为：5′-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3′，5′-TCTGTCTCGAGGGGAGCTG-3′，扩增产物为258bp。β-actin的引物顺序为：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增产物540bp。
逆转录方法：取2μg总RNA(约8μl)，依次加入5×Buffer 4μl，2.5mmol/LdNTP3μl,0.5μg/μl随机引物Oligo(dT)1μl，40μ/μl RNAsin 1μl，0.1MDTT 2μl，200μ/μl mmlv反转录酶1μl，加入去RNA酶水，使总体积达20μl。37℃1h，95℃ 5 min止反应。
取反转录产物10μl，依次加入10×Buffer5μl，25mM MgCl25μl，2.5mM dNTP4μl，CD36上游引物(40pM)2μl，下游引物(40pM)2μl，β-actin上游引物(20pM)2μl，下游引物(20pM)2μl，5μ/μl Taq DNA合成酶1μl，加双蒸水补总体积至50μl。变性95℃30秒，退火58℃1min，延伸72℃1min，循环30次，终延伸72℃10min。
, http://www.100md.com
三、 血清LDL含量测定 血清LDL测定采用中生试剂公司提供的试剂盒，操作完全按照试剂盒的要求。
四、统计学方法 所有数据采用SPSS软件处理，数值表达为均数±标准差，两样本均数比较采用Student t检验，两变量相关分析采用直线相关与回归。
结果
一、RT-PCR产物 电泳定量，LDLR cDNA片段为260bp，β-actin cDNA片段为540bp，分别与所设计的相应的cDNA片段相同，表明扩增产物即为本实验的目的基因片段(图1)。
图1 RT-PCR扩增LDLR和β-actin基因片段琼脂糖凝胶电泳
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二、颈动脉粥样硬化组和对照组LDLR mRNA表达水平分别取颈动脉粥样硬化患者和正常对照者PBMC提取的总RNA，测定LDLR mRNA量。发现颈动脉粥样硬化患 者的LDLR mRNA表达量(0.25±0.10)低于正常对照组(0.49±0.17)，两者有显著性差异(P<0.001)。
三、人PBMC LDLR mRNA表达量与血浆中LDL关系将人PBMC LDLR mRNA表达量与血清中LDL含量显示于图2。从图中可见LDLR与LDL存在负相关，相关分析表明r=0.26,P<0.05，回归方程为LDL=153.87～57.40LDLR。
图2 人PBMC LDLR mRNA表达量与血浆中LDL关系
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讨论
LDLR是血浆胆固醇降解代谢的主要途径。其在胆固醇代谢中有双重作用：一方面增加循环中中密度脂蛋白(IDL)的清除，以减少LDL的产生：另一方面，LDLR介导细胞摄取LDL以增加LDL的降解。细胞培养的研究提示，细胞LDLR表达量受细胞内胆固醇浓度的调节，当细胞内有大量胆固醇堆积时，LDLR表达量减少。已经证实血浆胆固醇水平很大程度上取决于LDLR基因表达水平的高低[6]，即LDLR表达水平降低，则血浆胆固醇降解受阻，造成高脂血症，而高脂血症与动脉粥样硬化直接相关。Wang等[7]在颈动脉和冠状动脉组织中对LDLR mRNA含量的RT-PCR测定结果表明，动脉粥样硬化斑块中LDLR转录水平明显低于正常动脉组织，直接提示动脉粥样硬化形成与LDLR低表达相关。
LDLR大部分分布在肝脏，新鲜人外周血单个核细胞表面具有LDLR，其表达水平的高低代表人体内其他细胞特别是肝细胞的LDLR状况[8]。本研究结果发现动脉粥样硬化患者的单个核细胞LDLR水平较正常对照组明显降低。
, http://www.100md.com
对所有受检者PBMC LDLR mRNA表达量与血浆中LDL水平做相关分析表明有统计意义两者是负相关。LDLR表达的调控是负向调节的，采取适当措施解除抑制LDLR表达的因素，有可能成为防治动脉粥样硬化的有效手段，动物实验发现正红花油对LDLR的表达可能有正向调节作用。[9]。
对颈动脉粥样硬化形成机制的研究目的在于采取有效措施预防和延缓其发生。动脉粥样硬化形成过程是一个十分复杂的过程，摄取适当低的动物脂肪食物，即选择低胆固醇及低饱和脂肪的膳食，有利于控制血浆胆固醇特别是LDL的浓度，去除对LDLR表达的抑制，必要时适当调控其表达，可有效降低LDL浓度。 这样，相信可有效预防和治疗动脉粥样硬化，进而减少脑血管病的发生。
* 本课题为北京市科技新星计划和北京市优秀青年知识分子基金资助项目
参考文献
, 百拇医药 [1] Schneider WJ,Beisigei V,Goldstein JL,et al.Purification of the low density lipoprotein receptor,a acidic glycoprotein of 164 000 molecular weight.J Biol Chem,1982,257:2664～2670.
[2] Russell DW,Yamamoto T,Schneider WJ,et al. CNDA clonong of the bovine low density lipoprotein receptor feedback regulation of a recptor mRNA.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80:7501～7507.
[3] Yamamoto T,Davis CG,Brown MS,et al.The human LDL receptor:a cystein-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA.Cell,1984,39:27～33.
, http://www.100md.com
[4] Talyor DC,Strandness DE.Carotid artery duplex scanning.J Clin Ultrasound,1987,15:635～639.
[5] Pitsch A,Eri W.Lovastatin reduces expression of the combined adhesion and scavenger receptor CD36 in human monocytic cells. Biochem Pharmacol,1996,52:433～439.
[6] Lecras TD,Gherardi E,and Bowyer DE,A sensitive Rnase protection assay for the quantitation of the mRNAs for the LDL receptor and HMG-CoA reductase in human total RNA.Atherosclerosis,1991,90:81～90.
, 百拇医药
[7] Wang AM,Doyle MV,and Mark DF.Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction.Poc Natl Acad,1992,1127:57～66.
[8] Cuthbert JA,Russell DW,and Lipsky PE.Regulation of low density lipoprotein receptor gene expression in human lymphocytes.J Biol Chem,1989,264:1298～1303.
[9] Horton JD,Cuthberty JA,and Spady DK.Dietary fatty acide regulate hepatic low density lipoprotein transport by altering LDL receptor protein and mRNA levels.J Clin Invest,1993,92:743～749.
(1998-08-10收稿)
(1998-09-01修改), 百拇医药