大鼠急性低压缺氧时心肌和血清一氧化氮及相关自由基损伤指标的改变
作者:刘志发 吴醒 身 周正谋 赵 力 王大鹏
单位:北京海军总医院(100037)干部病房二科
关键词:一氧化氮合成酶;一氧化氮;超氧化物歧化酶;丙二醛
心肺血管病杂志990320 摘要 探讨一氧化氮合成酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化 酶(SOD)、丙二醛(MDA),在急性低压缺氧时含量变化。将48只wistar大鼠分为实验组和对照 组 。实验组进行模拟高空缺氧,以30 m/s速度直接上升至7500 m高度,分10 min、30 min\,60 min三个暴露组。对照组于低压舱内,不上升高度。对缺氧不同时间心肌组织和血清NOS、N O、SOD和MDA含量进行测定。结果:大鼠急性低压缺氧30 min\,60 min组心肌组织NOS显著高 于10min组及对照组P<0.001;血清NO 10 min、30 min组显著高于60 min组及 对照组P<0.01;SOD,低压缺氧10 min、30 min血清和心肌组织中SOD水平显著 高升,而60 min后降之对照组水平。缺氧时间越长,血清、心肌组织中MDA含量增加越明显 。大鼠急性低压缺氧时,诱导诱生酶(iNOS)的表达,iNOS产生大量的NO造成心肌损伤。
, 百拇医药
一氧化氮(NO)作为一种新型的细胞信使分子,广泛参与机体心血管、 免疫和神经系统的生理和病理调节。NO由L-精氨酸和氧分子在一氧化氮合成酶(NOS)及其辅 因子作用下生成,半衰期仅数秒,NOS作为NO生成关键的限速因子,对其生物学功能的发挥 起着重要的作用。为观察急性低压缺氧对心肌组织NOS及血清NO的影响,我们对48只wistar 大鼠进行模拟高空缺氧,对缺氧不同时间NOS、NO、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含 量进行对比分析,探讨NOS、NO在急性低压缺氧时含量变化。
材料和方法
一、 实验对象 48只wistar大鼠(由军事医学科学院动物中心提供)随机分成实验组和对照组,实验组分3个 组,每组12只;对照组12只,雌雄各半;平均体重分别为203±11.9 g\,200±9.4 g\,206± 12.7 g\,200.5±8.5 g;每组条件基本相同。实验前禁食12 h,自由饮水。
, 百拇医药
二、缺氧方法 将实验组大鼠置于低压舱内,以30 m/s速度直接上升至7500 m高度,分别停 留10 min、30 min、60 min,造成体内重度缺氧,然后以30 m/s速度下降至地面。对照组同 时放入另一实验条件完全相同的低压舱内,但不上升。
三、 标本留取方法 实验组大鼠出舱后,立即从眼眶取血3.0 ml,及时分离血清(4 000r/m in,4℃,20 min)置于-30℃保存。取血完毕后立即开胸,于左心室同一部位剪取心肌 组织一小块,4℃生理盐水漂洗后滤纸吸干组织水分,称取心肌组织湿重200 mg,加2 ml 4 ℃生理盐水,置入微型玻璃匀浆器在冰浴条件下匀浆。对照组大鼠血样本处理与实验组完全 相同。留取每只大鼠血液和心肌组织标本时间共约1 min。
四、 标本的测定
1. 心肌组织NOS测定 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。心肌组织NOS含量,结果以u /mg\5protein表示。
, 百拇医药
2. 血清NO测定 采用硝酸还原酶特异性将NO3还原为NO2,通过显色深浅测定其浓度的 高低(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。结果以umol/L表示。
3. 心肌组织SOD及血清SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。心肌组织SOD含量, 结果以亚硝酸盐单位(NU)/mg. protein表示;血清SOD以NU/ml表示。
4. 心肌组织MDA及血清MDA测定试剂盒由解放军总医院提供。心肌组织MDA含量,结果以nmol /mg.protein表示,血清MDA以nmol/ml表示。
5. 匀浆蛋白质测定 组织匀浆蛋白质测定用双缩脲法。
五、 统计学方法 结果均以平均值±标准差(x±s)表示,组间差异用t检验分析。
, 百拇医药
结 果
一、 急性低压缺氧大鼠心肌组织NOS、血清NO检测结果见表1。
表1大鼠急性低压缺氧心肌组织NOS血清NO含量变化(x±s) 组别
鼠数n
NOS(u/mg.pr)
NO(umol/L)
对照
12
0.68±0.12
20.04±2.12
缺氧
, 百拇医药
10min
12
0.75±0.16
48.32±15.26**
30min
12
3.23±0.57***
40.85±12.83**
60min
12
3.15±0.76***
, 百拇医药
26.40±10.72
注: 与对照组比**P<0.01,***P<0.001
表1所见急性缺氧30、60min组心肌组织NOS显著高于10min组P<0.0 01,血清NO 10、30min组显著高于60min组P<0.01和P<0.05。
二、 急性低压缺氧大鼠心肌组织、血清SOD检测结果见表2。
表2大鼠急性低压缺氧心肌组织血清SOD含量变化(x±s) 组别
鼠数n
SOD(Nu/mg.pr)
SOD(Nu/ml)
, 百拇医药
对照
12
5.01±1.25
33.68±11.42
缺氧
10min
12
7.78±3.18\+*
55.42±8.26**
30min
12
10.32±4.27**
, 百拇医药
48.56±5.73*
60min
12
5.65±2.78
36.61±3.55
注: 与对照组比*P<0.05,**P<0.01
表2所见急性缺氧10、30min组心肌组织和血清SOD显著高于60 min组(P< 0.05和P<0.01)。
三、 急性低压缺氧大鼠心肌组织、血清MDA检测结果见表3。
表3大鼠急性低压缺氧心肌组织、血清MDA含量变化(x±s) 组别
, 百拇医药
鼠数n
MDA(nmol/mg.pr)
MDA(nmol/L)
对照
12
2.64±0.96
5.26±1.48
缺氧
10min
12
2.95±1.57
5.72±1.04
, 百拇医药
30min
12
3.80±1.12\+*
7.39±2.76\+*
60min
12
5.86±2.35**
9.42±1.28**
注: 与对照组比*P<0.05,**P<0.01
表3所见急性缺氧30、60 min组心肌组织和血清MDA显著高于10 min组(P< 0.05和P<0.01)
, http://www.100md.com
讨 论
血管内皮细胞和心肌细胞存在两种类型的NOS:原生酶(cNOS)和诱生酶(iNOS)。正常 情况下内皮细胞、心肌细胞通过cNOS合成少量NO来维持生理功能。
文献报道,低氧可以引起血管内皮细胞和单核细胞分泌一些细胞因子如IL-1、IL-8和TNF-a 刺激后上述细胞表达iNOS,导致NO的大量产生,参与病理过程[1~3],它们可能诱 导血管平滑肌细胞产生iNOS。急性中度低压缺氧后血液中血管内皮细胞较缺氧前增加了174% ,急性中度低压缺氧对血管内皮细胞损伤是严重的[4]。正常心脏中不含iNOS,有 报道心肌细胞受炎性细胞因子诱导后可产生iNOS[5]。过量产生的NO使组织环磷酸 鸟苷(cGMP)产生增加,激活cGMP依赖性蛋白激酶,减少细胞钙内流,抑制心肌收缩功能 [6]。
本实验结果发现,大鼠急性低压缺氧30min、60min组心肌组织NOS显著高于10 min组及对 照组P<0.001;血清NO10 min组、30 min组显著高于60 min组及对照组P<0.01。低氧促进体内一些炎症细胞因子产生和释放,从而诱导血管内皮细胞iN OS 的表达;另一方面心肌细胞也可能直接感受低氧应激产生iNOS。给低氧细胞L-精氨酸生成的 NO显著的增加;iNOS基因可能是一种低氧诱导基因[7]。大鼠心肌细胞,cAMP单独 不能诱导iNOS表达,但可促进细胞因子IL-B和TNF-a诱导iNOS表达的作用[8]。通过 cNOS产生的NO,产量较低,主要发挥信息传递作用,而通过iNOS产生的NO,产量提高数千倍 ,主要发挥毒性作用[9]。大量NO可以造成组织和细胞的损害甚至死亡,所以iNOS 的诱导合成就成为众多疾病的发病关键。急性低压缺氧所致的心肌损伤主要表现为心肌细胞 坏死。过多长时间的NO生成可造成细胞损伤甚至DNA破坏等多种病理损害,而且还可以与同 时产生的超氧阴离子对机体造成很大危害[10]。
, http://www.100md.com
本实验结果发现,大鼠急性低压缺氧10 min、30 min血清和心肌组织中SOD水平显著升高, 而60 min后降之对照组水平。过量NO与急性低压缺氧时产生的大量超氧离子生成过氧化亚硝 酸盐阴离子(ONOO-),NO与超氧阴离子反应形成有较强细胞毒性的过氧化亚硝酸根ONOO- 过多,SOD呈代偿性升高,促进体内超氧阴离子的歧化反应,SOD的过度表达是机体通过内在 的抗氧化保护机制来清除ONOO-等有毒物质。但这种保护作用总是有限的,当体内合成这 些毒性 产物的量超过了机体所能清除的限度,ONOO-,进一步分解产生自由基HO.和NO2,促使 细 胞膜发生脂质过氧化,损害心肌收缩功能。本实验结果表明,心肌NOS和血NO产生增加,导 致心肌和血MDA增高,缺氧时间越长,MDA增高越明显,表明过量NO对心肌功能是有害的。因 此,急性缺氧时,阻止iNOS的诱导表达,抑制过量NO的产生可防止心肌受损。
参考文献
, 百拇医药
1 Ghezzi P, Dinarello CA, Bianchi S, et al. Hypoxia increases production of interleukin-1 and tumor necrosis factor by human mononuclear cells . Cyto-kines, 1991, 3:189~192.
2 Karakum M, Shreeniwas R, Chen J, et al. Hypoxia induction of interleuk in-8 gene exprssion in human endothelium cells. J Ckin Invest, 1994, 93:1564~1569.
3 Loscalzo J, Welch G. Nitric oxide and its role in the cardiovascular system. Prog Cardiovasc Dis, 1995, 38:87~91.
, http://www.100md.com
4 俞启福,虞积耀,杨晔,等.急性中度缺氧对体循环血液中血管内皮细胞数量的影响.中 华航海医学杂志,1993,4:193~195.
5 Oddis CV, Finkel MS. NF-B and GTP cyclodrolase regulate cytokine-induced niri c oxide production by cardiac myocytes. Am J Physiol, 1996,270:1864~1968.
6 Mery PF, Lohmann SM, Walter U, et al. Ca current is regulated by cyclic GMP-d ependent protein kinase in mammalian cardiac myocytes. Proc Nat1 Acad Sci, 1991, 88:1197~1204.
, 百拇医药 7 林红,蔡英年,邓希贤,等.低氧诱导肺血管平滑肌细胞诱生型一氧化氮合酶基因表达. 基础医学与临床,1997,3:199~203.
8 Ikeda U, Yamamoto K, Ichida M, et al. Cyclic AMP augments cytokine-stimulated nitric oxide synthase in rat cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol, 1996,28:789 ~795.
9 Moncada S, Palmeer RMJ, Higgea. Nitric oxide: physiology, pathophysiology an d pharmacology. Pharmacol Rev, 1991, 43:109~134.
10 Pou S, Pou WS, Bredt DS, et al. Generation of superoxide by purified brain n itric oxide synthase. J Biol Chem, 1992, 267:24173~24176.
(1998-10-26收稿)
(1999-01-06修回), 百拇医药
单位:北京海军总医院(100037)干部病房二科
关键词:一氧化氮合成酶;一氧化氮;超氧化物歧化酶;丙二醛
心肺血管病杂志990320 摘要 探讨一氧化氮合成酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化 酶(SOD)、丙二醛(MDA),在急性低压缺氧时含量变化。将48只wistar大鼠分为实验组和对照 组 。实验组进行模拟高空缺氧,以30 m/s速度直接上升至7500 m高度,分10 min、30 min\,60 min三个暴露组。对照组于低压舱内,不上升高度。对缺氧不同时间心肌组织和血清NOS、N O、SOD和MDA含量进行测定。结果:大鼠急性低压缺氧30 min\,60 min组心肌组织NOS显著高 于10min组及对照组P<0.001;血清NO 10 min、30 min组显著高于60 min组及 对照组P<0.01;SOD,低压缺氧10 min、30 min血清和心肌组织中SOD水平显著 高升,而60 min后降之对照组水平。缺氧时间越长,血清、心肌组织中MDA含量增加越明显 。大鼠急性低压缺氧时,诱导诱生酶(iNOS)的表达,iNOS产生大量的NO造成心肌损伤。
, 百拇医药
一氧化氮(NO)作为一种新型的细胞信使分子,广泛参与机体心血管、 免疫和神经系统的生理和病理调节。NO由L-精氨酸和氧分子在一氧化氮合成酶(NOS)及其辅 因子作用下生成,半衰期仅数秒,NOS作为NO生成关键的限速因子,对其生物学功能的发挥 起着重要的作用。为观察急性低压缺氧对心肌组织NOS及血清NO的影响,我们对48只wistar 大鼠进行模拟高空缺氧,对缺氧不同时间NOS、NO、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含 量进行对比分析,探讨NOS、NO在急性低压缺氧时含量变化。
材料和方法
一、 实验对象 48只wistar大鼠(由军事医学科学院动物中心提供)随机分成实验组和对照组,实验组分3个 组,每组12只;对照组12只,雌雄各半;平均体重分别为203±11.9 g\,200±9.4 g\,206± 12.7 g\,200.5±8.5 g;每组条件基本相同。实验前禁食12 h,自由饮水。
, 百拇医药
二、缺氧方法 将实验组大鼠置于低压舱内,以30 m/s速度直接上升至7500 m高度,分别停 留10 min、30 min、60 min,造成体内重度缺氧,然后以30 m/s速度下降至地面。对照组同 时放入另一实验条件完全相同的低压舱内,但不上升。
三、 标本留取方法 实验组大鼠出舱后,立即从眼眶取血3.0 ml,及时分离血清(4 000r/m in,4℃,20 min)置于-30℃保存。取血完毕后立即开胸,于左心室同一部位剪取心肌 组织一小块,4℃生理盐水漂洗后滤纸吸干组织水分,称取心肌组织湿重200 mg,加2 ml 4 ℃生理盐水,置入微型玻璃匀浆器在冰浴条件下匀浆。对照组大鼠血样本处理与实验组完全 相同。留取每只大鼠血液和心肌组织标本时间共约1 min。
四、 标本的测定
1. 心肌组织NOS测定 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。心肌组织NOS含量,结果以u /mg\5protein表示。
, 百拇医药
2. 血清NO测定 采用硝酸还原酶特异性将NO3还原为NO2,通过显色深浅测定其浓度的 高低(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。结果以umol/L表示。
3. 心肌组织SOD及血清SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。心肌组织SOD含量, 结果以亚硝酸盐单位(NU)/mg. protein表示;血清SOD以NU/ml表示。
4. 心肌组织MDA及血清MDA测定试剂盒由解放军总医院提供。心肌组织MDA含量,结果以nmol /mg.protein表示,血清MDA以nmol/ml表示。
5. 匀浆蛋白质测定 组织匀浆蛋白质测定用双缩脲法。
五、 统计学方法 结果均以平均值±标准差(x±s)表示,组间差异用t检验分析。
, 百拇医药
结 果
一、 急性低压缺氧大鼠心肌组织NOS、血清NO检测结果见表1。
表1大鼠急性低压缺氧心肌组织NOS血清NO含量变化(x±s) 组别
鼠数n
NOS(u/mg.pr)
NO(umol/L)
对照
12
0.68±0.12
20.04±2.12
缺氧
, 百拇医药
10min
12
0.75±0.16
48.32±15.26**
30min
12
3.23±0.57***
40.85±12.83**
60min
12
3.15±0.76***
, 百拇医药
26.40±10.72
注: 与对照组比**P<0.01,***P<0.001
表1所见急性缺氧30、60min组心肌组织NOS显著高于10min组P<0.0 01,血清NO 10、30min组显著高于60min组P<0.01和P<0.05。
二、 急性低压缺氧大鼠心肌组织、血清SOD检测结果见表2。
表2大鼠急性低压缺氧心肌组织血清SOD含量变化(x±s) 组别
鼠数n
SOD(Nu/mg.pr)
SOD(Nu/ml)
, 百拇医药
对照
12
5.01±1.25
33.68±11.42
缺氧
10min
12
7.78±3.18\+*
55.42±8.26**
30min
12
10.32±4.27**
, 百拇医药
48.56±5.73*
60min
12
5.65±2.78
36.61±3.55
注: 与对照组比*P<0.05,**P<0.01
表2所见急性缺氧10、30min组心肌组织和血清SOD显著高于60 min组(P< 0.05和P<0.01)。
三、 急性低压缺氧大鼠心肌组织、血清MDA检测结果见表3。
表3大鼠急性低压缺氧心肌组织、血清MDA含量变化(x±s) 组别
, 百拇医药
鼠数n
MDA(nmol/mg.pr)
MDA(nmol/L)
对照
12
2.64±0.96
5.26±1.48
缺氧
10min
12
2.95±1.57
5.72±1.04
, 百拇医药
30min
12
3.80±1.12\+*
7.39±2.76\+*
60min
12
5.86±2.35**
9.42±1.28**
注: 与对照组比*P<0.05,**P<0.01
表3所见急性缺氧30、60 min组心肌组织和血清MDA显著高于10 min组(P< 0.05和P<0.01)
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讨 论
血管内皮细胞和心肌细胞存在两种类型的NOS:原生酶(cNOS)和诱生酶(iNOS)。正常 情况下内皮细胞、心肌细胞通过cNOS合成少量NO来维持生理功能。
文献报道,低氧可以引起血管内皮细胞和单核细胞分泌一些细胞因子如IL-1、IL-8和TNF-a 刺激后上述细胞表达iNOS,导致NO的大量产生,参与病理过程[1~3],它们可能诱 导血管平滑肌细胞产生iNOS。急性中度低压缺氧后血液中血管内皮细胞较缺氧前增加了174% ,急性中度低压缺氧对血管内皮细胞损伤是严重的[4]。正常心脏中不含iNOS,有 报道心肌细胞受炎性细胞因子诱导后可产生iNOS[5]。过量产生的NO使组织环磷酸 鸟苷(cGMP)产生增加,激活cGMP依赖性蛋白激酶,减少细胞钙内流,抑制心肌收缩功能 [6]。
本实验结果发现,大鼠急性低压缺氧30min、60min组心肌组织NOS显著高于10 min组及对 照组P<0.001;血清NO10 min组、30 min组显著高于60 min组及对照组P<0.01。低氧促进体内一些炎症细胞因子产生和释放,从而诱导血管内皮细胞iN OS 的表达;另一方面心肌细胞也可能直接感受低氧应激产生iNOS。给低氧细胞L-精氨酸生成的 NO显著的增加;iNOS基因可能是一种低氧诱导基因[7]。大鼠心肌细胞,cAMP单独 不能诱导iNOS表达,但可促进细胞因子IL-B和TNF-a诱导iNOS表达的作用[8]。通过 cNOS产生的NO,产量较低,主要发挥信息传递作用,而通过iNOS产生的NO,产量提高数千倍 ,主要发挥毒性作用[9]。大量NO可以造成组织和细胞的损害甚至死亡,所以iNOS 的诱导合成就成为众多疾病的发病关键。急性低压缺氧所致的心肌损伤主要表现为心肌细胞 坏死。过多长时间的NO生成可造成细胞损伤甚至DNA破坏等多种病理损害,而且还可以与同 时产生的超氧阴离子对机体造成很大危害[10]。
, http://www.100md.com
本实验结果发现,大鼠急性低压缺氧10 min、30 min血清和心肌组织中SOD水平显著升高, 而60 min后降之对照组水平。过量NO与急性低压缺氧时产生的大量超氧离子生成过氧化亚硝 酸盐阴离子(ONOO-),NO与超氧阴离子反应形成有较强细胞毒性的过氧化亚硝酸根ONOO- 过多,SOD呈代偿性升高,促进体内超氧阴离子的歧化反应,SOD的过度表达是机体通过内在 的抗氧化保护机制来清除ONOO-等有毒物质。但这种保护作用总是有限的,当体内合成这 些毒性 产物的量超过了机体所能清除的限度,ONOO-,进一步分解产生自由基HO.和NO2,促使 细 胞膜发生脂质过氧化,损害心肌收缩功能。本实验结果表明,心肌NOS和血NO产生增加,导 致心肌和血MDA增高,缺氧时间越长,MDA增高越明显,表明过量NO对心肌功能是有害的。因 此,急性缺氧时,阻止iNOS的诱导表达,抑制过量NO的产生可防止心肌受损。
参考文献
, 百拇医药
1 Ghezzi P, Dinarello CA, Bianchi S, et al. Hypoxia increases production of interleukin-1 and tumor necrosis factor by human mononuclear cells . Cyto-kines, 1991, 3:189~192.
2 Karakum M, Shreeniwas R, Chen J, et al. Hypoxia induction of interleuk in-8 gene exprssion in human endothelium cells. J Ckin Invest, 1994, 93:1564~1569.
3 Loscalzo J, Welch G. Nitric oxide and its role in the cardiovascular system. Prog Cardiovasc Dis, 1995, 38:87~91.
, http://www.100md.com
4 俞启福,虞积耀,杨晔,等.急性中度缺氧对体循环血液中血管内皮细胞数量的影响.中 华航海医学杂志,1993,4:193~195.
5 Oddis CV, Finkel MS. NF-B and GTP cyclodrolase regulate cytokine-induced niri c oxide production by cardiac myocytes. Am J Physiol, 1996,270:1864~1968.
6 Mery PF, Lohmann SM, Walter U, et al. Ca current is regulated by cyclic GMP-d ependent protein kinase in mammalian cardiac myocytes. Proc Nat1 Acad Sci, 1991, 88:1197~1204.
, 百拇医药 7 林红,蔡英年,邓希贤,等.低氧诱导肺血管平滑肌细胞诱生型一氧化氮合酶基因表达. 基础医学与临床,1997,3:199~203.
8 Ikeda U, Yamamoto K, Ichida M, et al. Cyclic AMP augments cytokine-stimulated nitric oxide synthase in rat cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol, 1996,28:789 ~795.
9 Moncada S, Palmeer RMJ, Higgea. Nitric oxide: physiology, pathophysiology an d pharmacology. Pharmacol Rev, 1991, 43:109~134.
10 Pou S, Pou WS, Bredt DS, et al. Generation of superoxide by purified brain n itric oxide synthase. J Biol Chem, 1992, 267:24173~24176.
(1998-10-26收稿)
(1999-01-06修回), 百拇医药