普伐他汀对冠心病患者外周血单核细胞功能的影响
作者：梁 春 吴宗贵 仲人前 黄 佐 张玲珍 李 莉 孔宪涛
单位：上海第二军医大学附属长征医院(200003)心内科
关键词：普伐他汀；冠心病；单核细胞
心肺血管病杂志990304
摘要 为探讨普伐他汀对冠心病患者外周血单核细胞(PBMs)功能的影响，对21例血脂正常冠心病患者和9例健康人PBMs粘附分子CD11b、CD49d表达及TNF-α、IL-8分泌情况进行了检测；并在体外分离培养的冠心病患者PBMs中，观察了普伐他汀对其表达CD11b、CD49d及分泌TNF-α、IL-8的影响。结果表明：冠心病患者PBMs表达CD11b、CD49d及分泌INF-α、IL-8的能力明显高于正常对照组(P<0.01)；普伐他汀能下调冠心病患者PBMsCD11b、CD49d表达及降低TNF-α、IL-8的分泌(P<0.05)。说明普伐他汀可抑制冠心病患者外周血单核细胞的功能。
, 百拇医药
Effects of Pravastatin on the Function of Peripheral Blood
Monocytes in Patients with Coronary Heart Disease
Liang Chun,Wu Zonggui,Zhong Renqian, et al.
Department of Cardiology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,(200003)
Abstract The aim of this study was to evaluate the e ffects of pravastatin on the function of peripheral blood monocytes (PBMs)in patients with coronary heart disease(CHD).CD11b,CD49d expression and TNF-α,IL-8 secretion of PBMs were measured in 9 healthy subjects and 21 patients with CHD.The effects of pravastatin on those of PBMs in vitro were investigated in CHD patients. The ability to express CD11b,CD49d and release TNF-α、IL-8 of PBMs in patients with CHD were higher than that in control group (P<0.01).Pravastatin downregulated CD11b,CD49d expression and inhibited TNF-α,IL-8 secretion of PBMs in patients with CHD.In conclusion,pravastatin may suppress the function of PBMs in patients with CHD.
, 百拇医药
Key words: Pravastatin; Coronary hear t disease; Monocyte
近年，他汀类调脂 药的临床应用，取得了突破性进展。REGRESS[1]等大规模药物治疗观察发现，普伐他汀能降低胆固醇水平正常冠心病患者心血管事件的发生率(较安慰剂组减少25%)，说明他汀类调脂药除调脂外，尚具有其它对心血管有益的作用。普伐他汀是否可影响冠心病患者外周血单核细胞功能具有抗炎作用，成为人们关注的问题。
材料与方法
一、 病例选择 以1997年5月至1998年4月在本院住院临床诊断为冠心病且血脂正常并志愿合作患者21例为研究对象。男15例，女6例，年龄34～80(平均62.9)岁，具经冠状动脉造影证实有1支或1支以上冠状动脉主要分支狭窄50%以上，其中陈旧心肌梗塞10例，不稳定性心绞痛6例，稳定性心绞痛5例。以冠状动脉造影正常且排除冠心病诊断为正常对照组，共9例，男6例，女3例，年龄在31～69(50.3)岁。所有受试者近期均无感染性疾病和肿瘤新生物，未用过类固醇类药物，并无肝肾及其他心血管疾病。
, 百拇医药
二、 主要试剂和仪器 普伐他汀标准品：上海施贵宝制药有限公司。RPMI 1640：Gibco公司。PHA：上海生物晶美公司。CD11b、CD49d单克隆抗体：法国Immunotech公司。淋巴细胞分离液：上海试剂二厂。IL-8ELISA药盒：比利时INNOGENETICS公司。主要仪器设备：流式细胞仪：EPICS-XL型美国Culter公司产品。二氧化碳培养箱：德国NAPCO产品。全自动酶标检测仪：Mertertch S960,Sigma。
三、 外周血的采集，外周血单核细胞的分离及培养 于行冠状动脉造影的同时，在股动脉内取动脉血10～20ml，肝素抗凝，立即置4°C冰箱降温，以抑制血中单核细胞的活性，30min后用密度梯度离心法分离单个核细胞，根据单核细胞贴壁的特性，分离出单核细胞，贴壁的单核细胞置含10%人AB血清的RPMI 1640培养液中培养，Giemsa染色纯度90%以上，2%台盼蓝染色示细胞活力>95%。
四、 实验分组 1.正常对照组：分离出的健康人PMBs只加培养基。2.冠心病组：分离出的冠心病人PBMs只加培养基。3.正常对照+普伐他汀组：分离出的健康人PBMs加100μ mol/L普伐他汀。4.冠心病+普伐他汀组：分离出的冠心病人PBMs加50～100μ mol/L普伐他汀。上述各组于37°C，5%CO2细胞培养箱中继培养24h后用于检测。
, http://www.100md.com
五、 CD11b、CD49d表达的测定 调待测的PBMs 1×105/ml,2000rpm离心4min,弃上清。沉淀部分加PBS再2000rpm离心4min,洗涤2遍弃上清，加鼠抗人单抗4°C与细胞共育30min，PBS冲洗2次后，再加入FIFC-免抗小鼠IgG4°C共育30min，PBS冲洗1次，流式细胞仪检测，计数5000个细胞，以平均荧光密度值(道数)代表细胞CD表达水平。同时对各标本做阴性对照，阴性对照除了以等量PBS+CD单克隆抗体外，操作同前。所用的鼠抗人单克隆抗体包括CD11b、CD49d。
六、 TNF-α和IL-8的测定 调待测的PBMs 1×105/ml,加入1 0μ g/ml的PHA，于37°C，5%CO2细胞培养箱中继育6 h，2000rpm 4min离心收集上清，-80°C储存待测。1.测定TNF-α：采用小鼠L929细胞为靶细胞，用MTT比色法检测TNF-α杀伤的L929细胞毒指数，反映TNF-a的活性；测波长为570nm处A值，计算样本稀释倍数线形回归，以引起50%细胞毒性的样品最大稀释倍数的倒数为该样品活性单位。2.测定IL-8：采用IL-8 ELISA药盒，严格按说明书操作。
, 百拇医药
七、 统计分析 数据用
±s表示，2组 间采用t检验。
结 果
一、 普伐他汀对冠心病患者PBMs CD 11b、CD49d表达的影响：冠心病组PBMs表面CD11b和CD49d平均荧光密度值表达高于正常对照组，相差显著(P<0.05)；在体外分离的冠心病患者PBMs组，加普伐他汀(100 μ mol/L)组低于未加药组，有明显差异(P<0.05)，详见表1。
表1普伐他汀对冠心病患者PBMsCD11b、CD49d表达的影响(±s) 分组
CD49d平均荧光密度值
, 百拇医药
CD11b平均荧光密度值
正常对照组
1022±165
248 ±22
冠心病组
1553±231
360±35
正常对照+P组(100μ mol/L)
1011±131
231±31
冠心病+P组(50μ mol/L)
, 百拇医药
1399±201
326±25
冠心病+P组(100μ mol/L)
1182±176△
269±13△
注：P：普伐他汀，与对照组相比，P<0.05；△与冠心病组相比P<0.05 表2普伐他汀对冠心病患者PBMs分泌TNF-α、IL-8的影响(±s) 分组
IL-8(ng/ml)
TNF-α(U/ml)
, 百拇医药
正常对照组
43.3±21.6
7 4±22
冠心病组
78.6±19.5
103±11
正常对照+P组(100μ mol/L)
31.4±17.3
60±15
冠心病+P组(50μ mol/L)
59.9±15.3
, 百拇医药
88±14
冠心病+P组(100μ mol/L)
34.5±13.8△
46±12△
注：P：普伐他汀，与对照组相比，P<0.01；△与冠心病组相比P<0.01 二、普伐他汀对冠心病患者PBMs分泌TNF-a、IL-8的影响：冠心病患者PBMs经PHA刺激后，其分泌TNF-a、IL-8的量明显高于正常对照组，加普伐他汀100 μ mol/L可降低此作用，有非常显著差异，P<0.01(表2)。
讨 论
循环血单核细胞是斑 块部位泡沫巨噬细胞主要来源之一，单核细胞是如何从血循环中进入到病灶处的机制尚不清楚。目前认为单核细胞跨内皮迁移与细胞表面粘附分子表达升高，局部细胞生长因子增多有关。
, 百拇医药
近年研究表明，单核细胞与内皮的粘附，与单核细胞表面及病变局部内皮的粘附分子表达增加有关，主要是CD11b/CD18-ICAM、CD49d-VCAM-1配体相互间作用。有资料表明，用流式细胞仪检测冠心病患者单核细胞膜CD11b/CD18表达较正常对照组明显增高，且不稳定心绞痛组高于稳定心绞痛组，存在显著差异P<0.01[2]。我们检测21例冠心病人其单核细胞表面CD11b、CD49d表达均高于正常人(P<0.05)，与文献报道一致[3]。从外周动脉血分离出的冠心病患者单核细胞，经有丝分裂原PHA激活后，其分泌TNF-a、IL-8的能力明显高于正常人，而TNF-a、IL-8主要由活化的淋巴和单核细胞分泌，是免疫和炎症反应的重要调节因子，说明冠心病人外周血单核细胞处于激活或半激活状态，易对外界刺激产生反应。我们推测动脉血中单核细胞，是AS形成中的直接参与者。
普伐他汀是HMG-CoA还原酶的一种具有亲水性的竞争性抑制剂，除调脂作用外，尚具有其它对心血管有益的作用。普伐他汀能改善AS段内皮细胞的功能，抑制单核细胞趋化[4]。本研究显示，在体外100 μ mol/L普伐他汀可抑制单核细胞粘附分子表达及分泌细胞因子的能力，推测普伐他汀在细胞水平， 能抑制循环血中单核细胞到血管内皮的粘附、激活和分泌多种生物活性分子，延缓AS病变的进展和使斑块稳定，从而可部分解释普伐他汀减少心血管事件发生的机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1 J ukema JW，Brusckke AV，Van Rappard FM,et al.Effects of lipid lowering by pravastatin on progression of coronary artery disease in symptomatic men with normal to moderately elevated serum cholesterol levels:the regression of growth evaluation statin study (REGRESS).Circulation 1995,91:2528～2540.
2 张进虎，陈新义，孙济川，等.冠心病患者白细胞CD11b/CD18受体表达及内皮细胞数量的变化.中华医学杂志，1997，77：335.
3 安靓，李进，刘小蓉，等.IL-6、TNF调节冠心病人单核细胞CD11b抗原表达的研究.第一军医大学学报，1995，15：188～190.
4 Jorg Kreuzer,Jorg Bader,Lothar Jshn, et al.Chemotaxis of the monocyto cell line U937:dependence on cholesterol and early mevalonate pathway products.Athrosclerosis，1991,90:203～209.
(1998-10-20收稿)
(1999-03-09修回), http://www.100md.com
单位：上海第二军医大学附属长征医院(200003)心内科
关键词：普伐他汀；冠心病；单核细胞
心肺血管病杂志990304
摘要 为探讨普伐他汀对冠心病患者外周血单核细胞(PBMs)功能的影响，对21例血脂正常冠心病患者和9例健康人PBMs粘附分子CD11b、CD49d表达及TNF-α、IL-8分泌情况进行了检测；并在体外分离培养的冠心病患者PBMs中，观察了普伐他汀对其表达CD11b、CD49d及分泌TNF-α、IL-8的影响。结果表明：冠心病患者PBMs表达CD11b、CD49d及分泌INF-α、IL-8的能力明显高于正常对照组(P<0.01)；普伐他汀能下调冠心病患者PBMsCD11b、CD49d表达及降低TNF-α、IL-8的分泌(P<0.05)。说明普伐他汀可抑制冠心病患者外周血单核细胞的功能。
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Effects of Pravastatin on the Function of Peripheral Blood
Monocytes in Patients with Coronary Heart Disease
Liang Chun,Wu Zonggui,Zhong Renqian, et al.
Department of Cardiology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,(200003)
Abstract The aim of this study was to evaluate the e ffects of pravastatin on the function of peripheral blood monocytes (PBMs)in patients with coronary heart disease(CHD).CD11b,CD49d expression and TNF-α,IL-8 secretion of PBMs were measured in 9 healthy subjects and 21 patients with CHD.The effects of pravastatin on those of PBMs in vitro were investigated in CHD patients. The ability to express CD11b,CD49d and release TNF-α、IL-8 of PBMs in patients with CHD were higher than that in control group (P<0.01).Pravastatin downregulated CD11b,CD49d expression and inhibited TNF-α,IL-8 secretion of PBMs in patients with CHD.In conclusion,pravastatin may suppress the function of PBMs in patients with CHD.
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Key words: Pravastatin; Coronary hear t disease; Monocyte
近年，他汀类调脂 药的临床应用，取得了突破性进展。REGRESS[1]等大规模药物治疗观察发现，普伐他汀能降低胆固醇水平正常冠心病患者心血管事件的发生率(较安慰剂组减少25%)，说明他汀类调脂药除调脂外，尚具有其它对心血管有益的作用。普伐他汀是否可影响冠心病患者外周血单核细胞功能具有抗炎作用，成为人们关注的问题。
材料与方法
一、 病例选择 以1997年5月至1998年4月在本院住院临床诊断为冠心病且血脂正常并志愿合作患者21例为研究对象。男15例，女6例，年龄34～80(平均62.9)岁，具经冠状动脉造影证实有1支或1支以上冠状动脉主要分支狭窄50%以上，其中陈旧心肌梗塞10例，不稳定性心绞痛6例，稳定性心绞痛5例。以冠状动脉造影正常且排除冠心病诊断为正常对照组，共9例，男6例，女3例，年龄在31～69(50.3)岁。所有受试者近期均无感染性疾病和肿瘤新生物，未用过类固醇类药物，并无肝肾及其他心血管疾病。
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二、 主要试剂和仪器 普伐他汀标准品：上海施贵宝制药有限公司。RPMI 1640：Gibco公司。PHA：上海生物晶美公司。CD11b、CD49d单克隆抗体：法国Immunotech公司。淋巴细胞分离液：上海试剂二厂。IL-8ELISA药盒：比利时INNOGENETICS公司。主要仪器设备：流式细胞仪：EPICS-XL型美国Culter公司产品。二氧化碳培养箱：德国NAPCO产品。全自动酶标检测仪：Mertertch S960,Sigma。
三、 外周血的采集，外周血单核细胞的分离及培养 于行冠状动脉造影的同时，在股动脉内取动脉血10～20ml，肝素抗凝，立即置4°C冰箱降温，以抑制血中单核细胞的活性，30min后用密度梯度离心法分离单个核细胞，根据单核细胞贴壁的特性，分离出单核细胞，贴壁的单核细胞置含10%人AB血清的RPMI 1640培养液中培养，Giemsa染色纯度90%以上，2%台盼蓝染色示细胞活力>95%。
四、 实验分组 1.正常对照组：分离出的健康人PMBs只加培养基。2.冠心病组：分离出的冠心病人PBMs只加培养基。3.正常对照+普伐他汀组：分离出的健康人PBMs加100μ mol/L普伐他汀。4.冠心病+普伐他汀组：分离出的冠心病人PBMs加50～100μ mol/L普伐他汀。上述各组于37°C，5%CO2细胞培养箱中继培养24h后用于检测。
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五、 CD11b、CD49d表达的测定 调待测的PBMs 1×105/ml,2000rpm离心4min,弃上清。沉淀部分加PBS再2000rpm离心4min,洗涤2遍弃上清，加鼠抗人单抗4°C与细胞共育30min，PBS冲洗2次后，再加入FIFC-免抗小鼠IgG4°C共育30min，PBS冲洗1次，流式细胞仪检测，计数5000个细胞，以平均荧光密度值(道数)代表细胞CD表达水平。同时对各标本做阴性对照，阴性对照除了以等量PBS+CD单克隆抗体外，操作同前。所用的鼠抗人单克隆抗体包括CD11b、CD49d。
六、 TNF-α和IL-8的测定 调待测的PBMs 1×105/ml,加入1 0μ g/ml的PHA，于37°C，5%CO2细胞培养箱中继育6 h，2000rpm 4min离心收集上清，-80°C储存待测。1.测定TNF-α：采用小鼠L929细胞为靶细胞，用MTT比色法检测TNF-α杀伤的L929细胞毒指数，反映TNF-a的活性；测波长为570nm处A值，计算样本稀释倍数线形回归，以引起50%细胞毒性的样品最大稀释倍数的倒数为该样品活性单位。2.测定IL-8：采用IL-8 ELISA药盒，严格按说明书操作。
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七、 统计分析 数据用
±s表示，2组 间采用t检验。结 果
一、 普伐他汀对冠心病患者PBMs CD 11b、CD49d表达的影响：冠心病组PBMs表面CD11b和CD49d平均荧光密度值表达高于正常对照组，相差显著(P<0.05)；在体外分离的冠心病患者PBMs组，加普伐他汀(100 μ mol/L)组低于未加药组，有明显差异(P<0.05)，详见表1。
表1普伐他汀对冠心病患者PBMsCD11b、CD49d表达的影响(
±s) 分组CD49d平均荧光密度值
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CD11b平均荧光密度值
正常对照组
1022±165
248 ±22
冠心病组
1553±231
360±35
正常对照+P组(100μ mol/L)
1011±131
231±31
冠心病+P组(50μ mol/L)
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1399±201
326±25
冠心病+P组(100μ mol/L)
1182±176△
269±13△
注：P：普伐他汀，与对照组相比，P<0.05；△与冠心病组相比P<0.05 表2普伐他汀对冠心病患者PBMs分泌TNF-α、IL-8的影响(
±s) 分组IL-8(ng/ml)
TNF-α(U/ml)
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正常对照组
43.3±21.6
7 4±22
冠心病组
78.6±19.5
103±11
正常对照+P组(100μ mol/L)
31.4±17.3
60±15
冠心病+P组(50μ mol/L)
59.9±15.3
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88±14
冠心病+P组(100μ mol/L)
34.5±13.8△
46±12△
注：P：普伐他汀，与对照组相比，P<0.01；△与冠心病组相比P<0.01 二、普伐他汀对冠心病患者PBMs分泌TNF-a、IL-8的影响：冠心病患者PBMs经PHA刺激后，其分泌TNF-a、IL-8的量明显高于正常对照组，加普伐他汀100 μ mol/L可降低此作用，有非常显著差异，P<0.01(表2)。
讨 论
循环血单核细胞是斑 块部位泡沫巨噬细胞主要来源之一，单核细胞是如何从血循环中进入到病灶处的机制尚不清楚。目前认为单核细胞跨内皮迁移与细胞表面粘附分子表达升高，局部细胞生长因子增多有关。
, 百拇医药
近年研究表明，单核细胞与内皮的粘附，与单核细胞表面及病变局部内皮的粘附分子表达增加有关，主要是CD11b/CD18-ICAM、CD49d-VCAM-1配体相互间作用。有资料表明，用流式细胞仪检测冠心病患者单核细胞膜CD11b/CD18表达较正常对照组明显增高，且不稳定心绞痛组高于稳定心绞痛组，存在显著差异P<0.01[2]。我们检测21例冠心病人其单核细胞表面CD11b、CD49d表达均高于正常人(P<0.05)，与文献报道一致[3]。从外周动脉血分离出的冠心病患者单核细胞，经有丝分裂原PHA激活后，其分泌TNF-a、IL-8的能力明显高于正常人，而TNF-a、IL-8主要由活化的淋巴和单核细胞分泌，是免疫和炎症反应的重要调节因子，说明冠心病人外周血单核细胞处于激活或半激活状态，易对外界刺激产生反应。我们推测动脉血中单核细胞，是AS形成中的直接参与者。
普伐他汀是HMG-CoA还原酶的一种具有亲水性的竞争性抑制剂，除调脂作用外，尚具有其它对心血管有益的作用。普伐他汀能改善AS段内皮细胞的功能，抑制单核细胞趋化[4]。本研究显示，在体外100 μ mol/L普伐他汀可抑制单核细胞粘附分子表达及分泌细胞因子的能力，推测普伐他汀在细胞水平， 能抑制循环血中单核细胞到血管内皮的粘附、激活和分泌多种生物活性分子，延缓AS病变的进展和使斑块稳定，从而可部分解释普伐他汀减少心血管事件发生的机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1 J ukema JW，Brusckke AV，Van Rappard FM,et al.Effects of lipid lowering by pravastatin on progression of coronary artery disease in symptomatic men with normal to moderately elevated serum cholesterol levels:the regression of growth evaluation statin study (REGRESS).Circulation 1995,91:2528～2540.
2 张进虎，陈新义，孙济川，等.冠心病患者白细胞CD11b/CD18受体表达及内皮细胞数量的变化.中华医学杂志，1997，77：335.
3 安靓，李进，刘小蓉，等.IL-6、TNF调节冠心病人单核细胞CD11b抗原表达的研究.第一军医大学学报，1995，15：188～190.
4 Jorg Kreuzer,Jorg Bader,Lothar Jshn, et al.Chemotaxis of the monocyto cell line U937:dependence on cholesterol and early mevalonate pathway products.Athrosclerosis，1991,90:203～209.
(1998-10-20收稿)
(1999-03-09修回), http://www.100md.com