套式聚合酶链反应快速诊断结核性心包炎
作者：马路 刘川军 蒋晓钦 苗灵娟 王显
单位：郑州解放军460医院(450007)内四科
关键词：套式聚合酶链反应；心包积液；结核杆菌
套式聚合酶链反应快速诊断结核性心包炎 摘要 快速诊断结核性心包炎以便及早抗痨治疗防止缩窄性心包炎的发生。应用套式聚合酶链反应(Nested-PCR)、直接涂片、培养对83例心包积液标本进行结核菌检测。结果：结核性心包积液Nested-PCR阳性率为72.5%、培养阳性率为19.6%、涂片镜检阳性率为23.5%。非结核性心包积液无1例阳性。Nested-PCR特异性好、敏感性强并可能避免一般聚合酶链反应(PCR)所出现的假阳性。
The Rapid Diagnosis of Tuberculous Pericarditis
, http://www.100md.com
Using Nested Poly merase Chain Reaction
Ma Lu,Liu Chuanjun,Jiang Xiaoqin,et al.
The 460th Hospital of the PLA.Zhengzhou(450007)
Abstract Objective:to evaluate a rapid diagnostic method for tuberculous pericarditis.Met hods:nested polymerase chain reaction(nested-PCR) was used to detect the DNA of mycobacterium tuberculosis in 83 patients with hydropericardium.The results were compared with two traditional methods,acid-fast staining and culture.Results:a mong 51 tuberculous pericarditis patients,the diagnostic positive rates was 72.5 % by nested-PCR,but only 23.5% and 19.6% by acid-fast staining and culture.The sensitivity of nested-PCR for diagnosis of tuberculous pericarditis was much higher than other two methods.(P<0.01) All of 32 non-tuberculous hydroperi card itis had the negative results from nested-PCR.Conclusion:the nested-PCR is a t ime-saving method for rapid diagnosis of tuberculous pericarditis with much hig her sensitivity and specificity compared with that from traditional methods.
, 百拇医药
Key words: Nested polymerase chain reaction;Hydropericardium;Mycobacterium tuberculosis.
对结核性心包炎的诊断，一般常根据临床表现、心包积液的一般性状、化学检查、显微镜检查、涂片染色以及细菌培养等传统方法。这些方法敏感性低、特异性差、操作繁琐费时，常延误治疗时机，一般聚合酶链反应(PCR)又易出现假阳性[1]。我们用Nested-PCR检测结核菌，初步探讨了Nested-PCR诊断结核性心包炎的临床应用价值。
材料与方法
一、材料 1.标本的收集 结核性心包炎51例，根据临床表现、X线检查合并有肺结核及/或纵隔淋巴结结核、心包积液涂片抗酸染色及培养证实且抗痨治疗有效。癌性心包积液27例经组织学证实鳞癌4例、腺癌7例、小细胞癌13例、恶性心包间皮癌3例。急性化脓性心包炎1例。急性非特异性心包炎3例。心肌梗塞后Dressler综合征1例。严格消毒心包穿刺，抽取心包积液同时行涂片镜检、培养及Nested-PCR检测。2.主要试剂和仪器 引物根据吴勤学等[2]报道的序列合成：
, http://www.100md.com
外引物：GTG GCC CAG ATC CGC CAG
CAT GTC GCC ACC GGG AA
内引物：TTG CAA GCG GCC CCG ACC C
CCA CCG GGA ACG GAA GCC TT
外引物对将放大结核菌groEL基因的576bp片段，其中含有内引物对的部位，内引物对将放大出344bp的DNA片断。
TagDNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸(dNTP)均购自Promega公司。DNA标准Maker为：Φ×174RFDNA/HaeⅢFragment和pGEM-72(+)HaeⅢ及其他试剂均购自华美生物工程公司。PCR扩增仪购自华美生物工程公司，型号：ZW-Ⅰ增强型。
, 百拇医药
二、方法 1.心包积液涂片及培养 心包积液离心取沉淀按常规方法涂片作萋—尼氏抗酸染色镜检，结核菌培养及菌型鉴定按照中国防痨协会结核病细菌学检查方法规程进行。2.Nested-PCR检测：心包积液结核菌基因组DNA提取参照Wit等[3]报道的方法并加以改进。先用外引物对将DNA模版放大25个循环，反应体积25ul:外引物对2.0ul，DNA模版2.0ul，DNA聚合酶0.5U,4×dNTP终浓度为0.1mmol/L，10×buffer2.5ul，用蒸镏水补足25ul。(第一次放大条件为：94℃变性3min后，94℃×70秒，55℃×2min，72℃×2min，循环25次。最后72℃延伸8min)，而后用内引物对再放大25个循环(第二次放大条件及反应体积同第一次放大)。取第二次放大产物在1.5%琼脂糖胶(内含嗅乙啶0.5ug/ml)上进行电泳，每槽加样20ul，上样缓冲液5ul，恒流电泳(50mA)待溴酚蓝带泳至胶面4cm处关闭电泳仪，电泳后紫外检测并照像。扩增成功时紫外检测可见344bp桔红色条带。
, http://www.100md.com 结 果
Nested-PCR与培养、涂片镜检比较均有显著性差异(x2检验：P均<0.01)，所有非结核性标本检测均为阳性。
表1 83例心包积液标本检测结果
心包积液性质
例数
涂片镜检
培 养
Nested-PCR
(+)
(-)
(+)
, http://www.100md.com
(-)
(+)
(-)
结核性
51
12
39
10
41
37
14
非结核性
32
, http://www.100md.com 0
32
0
32
0
32
表2 3种方法检测结核菌阳性率的比较
方 法
Nested-PCR
培 养
涂片镜检
阳性率(%)
72.5
, 百拇医药
19.6
23.5
讨 论
心包疾病约占心血管病住院患者的1.5%～6%，在我国结核仍为心包炎的常见病因[4]，结核性心包积液常发展为缩窄性心包炎[5，6]。早期诊断和抗痨治疗对于防止其转变为缩窄性心包炎甚为重要[6]。传统的诊断方法敏感性低、特异性差、操作繁琐费时，常延误治疗时机。众多报道PCR检测各种临床标本中结核菌具有快速、敏感之优点，但容易出现假阳性，即污染[7]和特异性的问题，有报道假阳性高达14.3%[8]。有作者发现肺结核PCR假阳性大部分为肺部恶性肿瘤所致[9]。而Nested-PCR用内引物和第二次放大循环次数少，减少背景带而提高了特异性；且最后产物以内引物特异性为基础放大，与外引物不同，从而克服了污染[10]。我们用Nested-PCR检测83份心包积液标本，51例结核性心包积液的阳性检出率为12.5%，经x2检验明显优于培养和涂片镜检(P均<0.01)，而且Nested-PCR检测只需1天，结核培养时间则需8～49天。涂片镜检与Nested-PCR所需时间相同，但涂片阳性率低，而且镜检所依据的结核菌抗酸染色性实质上是分支杆菌属的特异性，不能作为结核菌种鉴定的细菌学依据。同时，临床标本中经常存在的异型形态，有时会造成结果判定的困难[11]。在本次Nested-PCR实验中，32例非结核性心包积液包括27例癌性心包积液标本无1例阳性。只要严格实验标准，有可能避免一般PCR所出现的假阳性。
, http://www.100md.com
苗灵娟(河南省中医药研究院)；
王显(河南省胸科医院)
参考文献
1 潘毓萱.聚合酶链反应技术在结核病临床诊断中的应用及存在问题.中华结核和呼吸杂志，1995，18：197.
2 吴勤学，李新宇，魏万惠，等.套式结核菌基因扩增试验的建立及初步应用.中华结核和呼吸杂志，1994，17：295.
3 Wit D,Marrtens G,Steyn L,et al.A comparative study of the polymerase c hain reaction and conventional procedures for the diagnosis of tuberculous pleur al effusion.Tuber Lung Dis,1992,73:262.
, 百拇医药
4 陈灏珠主编.内科学.第四版.北京：人民卫生出版社，1997，8：315.
5 张绍仪，杜修海.经剑突下心包穿刺留置导管治疗癌性或结核性心包积液的经验. 中华结核和呼吸杂志，1994，17：52.
6 陈灏珠主编.内科学.第四版.北京：人民卫生出版社，1997，8：318～319.
7 Sarker G,Sommer SS.Shedding light on PCR contamination.Nature,1990,3 43:27.
8 施焕中，李超乾，龙学明，等.聚合酶链反应在诊断结核性胸腔积液中的应用.中华结核和呼吸杂志，1994，17：287.
9 张言斌，谭耀驹，谭守勇，等.聚合酶链反应用于涂阴结核早期诊断的评价.中华 结核和呼吸杂志，1998，21：60.
, http://www.100md.com
10 Plikaytis BB,Gelber RH,Shinnick TM,et al.Rapid and sensitive detecti on of M.Leprae using a nested-primer gene amplification assays.J Clin Microbiol,1 990,28:1913.
11 马
，潘毓萱.结核病的诊断.中华结核和呼吸杂志，1995，18：70.
(1998-12-09收稿), http://www.100md.com
单位：郑州解放军460医院(450007)内四科
关键词：套式聚合酶链反应；心包积液；结核杆菌
套式聚合酶链反应快速诊断结核性心包炎 摘要 快速诊断结核性心包炎以便及早抗痨治疗防止缩窄性心包炎的发生。应用套式聚合酶链反应(Nested-PCR)、直接涂片、培养对83例心包积液标本进行结核菌检测。结果：结核性心包积液Nested-PCR阳性率为72.5%、培养阳性率为19.6%、涂片镜检阳性率为23.5%。非结核性心包积液无1例阳性。Nested-PCR特异性好、敏感性强并可能避免一般聚合酶链反应(PCR)所出现的假阳性。
The Rapid Diagnosis of Tuberculous Pericarditis
, http://www.100md.com
Using Nested Poly merase Chain Reaction
Ma Lu,Liu Chuanjun,Jiang Xiaoqin,et al.
The 460th Hospital of the PLA.Zhengzhou(450007)
Abstract Objective:to evaluate a rapid diagnostic method for tuberculous pericarditis.Met hods:nested polymerase chain reaction(nested-PCR) was used to detect the DNA of mycobacterium tuberculosis in 83 patients with hydropericardium.The results were compared with two traditional methods,acid-fast staining and culture.Results:a mong 51 tuberculous pericarditis patients,the diagnostic positive rates was 72.5 % by nested-PCR,but only 23.5% and 19.6% by acid-fast staining and culture.The sensitivity of nested-PCR for diagnosis of tuberculous pericarditis was much higher than other two methods.(P<0.01) All of 32 non-tuberculous hydroperi card itis had the negative results from nested-PCR.Conclusion:the nested-PCR is a t ime-saving method for rapid diagnosis of tuberculous pericarditis with much hig her sensitivity and specificity compared with that from traditional methods.
, 百拇医药
Key words: Nested polymerase chain reaction;Hydropericardium;Mycobacterium tuberculosis.
对结核性心包炎的诊断，一般常根据临床表现、心包积液的一般性状、化学检查、显微镜检查、涂片染色以及细菌培养等传统方法。这些方法敏感性低、特异性差、操作繁琐费时，常延误治疗时机，一般聚合酶链反应(PCR)又易出现假阳性[1]。我们用Nested-PCR检测结核菌，初步探讨了Nested-PCR诊断结核性心包炎的临床应用价值。
材料与方法
一、材料 1.标本的收集 结核性心包炎51例，根据临床表现、X线检查合并有肺结核及/或纵隔淋巴结结核、心包积液涂片抗酸染色及培养证实且抗痨治疗有效。癌性心包积液27例经组织学证实鳞癌4例、腺癌7例、小细胞癌13例、恶性心包间皮癌3例。急性化脓性心包炎1例。急性非特异性心包炎3例。心肌梗塞后Dressler综合征1例。严格消毒心包穿刺，抽取心包积液同时行涂片镜检、培养及Nested-PCR检测。2.主要试剂和仪器 引物根据吴勤学等[2]报道的序列合成：
, http://www.100md.com
外引物：GTG GCC CAG ATC CGC CAG
CAT GTC GCC ACC GGG AA
内引物：TTG CAA GCG GCC CCG ACC C
CCA CCG GGA ACG GAA GCC TT
外引物对将放大结核菌groEL基因的576bp片段，其中含有内引物对的部位，内引物对将放大出344bp的DNA片断。
TagDNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸(dNTP)均购自Promega公司。DNA标准Maker为：Φ×174RFDNA/HaeⅢFragment和pGEM-72(+)HaeⅢ及其他试剂均购自华美生物工程公司。PCR扩增仪购自华美生物工程公司，型号：ZW-Ⅰ增强型。
, 百拇医药
二、方法 1.心包积液涂片及培养 心包积液离心取沉淀按常规方法涂片作萋—尼氏抗酸染色镜检，结核菌培养及菌型鉴定按照中国防痨协会结核病细菌学检查方法规程进行。2.Nested-PCR检测：心包积液结核菌基因组DNA提取参照Wit等[3]报道的方法并加以改进。先用外引物对将DNA模版放大25个循环，反应体积25ul:外引物对2.0ul，DNA模版2.0ul，DNA聚合酶0.5U,4×dNTP终浓度为0.1mmol/L，10×buffer2.5ul，用蒸镏水补足25ul。(第一次放大条件为：94℃变性3min后，94℃×70秒，55℃×2min，72℃×2min，循环25次。最后72℃延伸8min)，而后用内引物对再放大25个循环(第二次放大条件及反应体积同第一次放大)。取第二次放大产物在1.5%琼脂糖胶(内含嗅乙啶0.5ug/ml)上进行电泳，每槽加样20ul，上样缓冲液5ul，恒流电泳(50mA)待溴酚蓝带泳至胶面4cm处关闭电泳仪，电泳后紫外检测并照像。扩增成功时紫外检测可见344bp桔红色条带。
, http://www.100md.com 结 果
Nested-PCR与培养、涂片镜检比较均有显著性差异(x2检验：P均<0.01)，所有非结核性标本检测均为阳性。
表1 83例心包积液标本检测结果
心包积液性质
例数
涂片镜检
培 养
Nested-PCR
(+)
(-)
(+)
, http://www.100md.com
(-)
(+)
(-)
结核性
51
12
39
10
41
37
14
非结核性
32
, http://www.100md.com 0
32
0
32
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32
表2 3种方法检测结核菌阳性率的比较
方 法
Nested-PCR
培 养
涂片镜检
阳性率(%)
72.5
, 百拇医药
19.6
23.5
讨 论
心包疾病约占心血管病住院患者的1.5%～6%，在我国结核仍为心包炎的常见病因[4]，结核性心包积液常发展为缩窄性心包炎[5，6]。早期诊断和抗痨治疗对于防止其转变为缩窄性心包炎甚为重要[6]。传统的诊断方法敏感性低、特异性差、操作繁琐费时，常延误治疗时机。众多报道PCR检测各种临床标本中结核菌具有快速、敏感之优点，但容易出现假阳性，即污染[7]和特异性的问题，有报道假阳性高达14.3%[8]。有作者发现肺结核PCR假阳性大部分为肺部恶性肿瘤所致[9]。而Nested-PCR用内引物和第二次放大循环次数少，减少背景带而提高了特异性；且最后产物以内引物特异性为基础放大，与外引物不同，从而克服了污染[10]。我们用Nested-PCR检测83份心包积液标本，51例结核性心包积液的阳性检出率为12.5%，经x2检验明显优于培养和涂片镜检(P均<0.01)，而且Nested-PCR检测只需1天，结核培养时间则需8～49天。涂片镜检与Nested-PCR所需时间相同，但涂片阳性率低，而且镜检所依据的结核菌抗酸染色性实质上是分支杆菌属的特异性，不能作为结核菌种鉴定的细菌学依据。同时，临床标本中经常存在的异型形态，有时会造成结果判定的困难[11]。在本次Nested-PCR实验中，32例非结核性心包积液包括27例癌性心包积液标本无1例阳性。只要严格实验标准，有可能避免一般PCR所出现的假阳性。
, http://www.100md.com
苗灵娟(河南省中医药研究院)；
王显(河南省胸科医院)
参考文献
1 潘毓萱.聚合酶链反应技术在结核病临床诊断中的应用及存在问题.中华结核和呼吸杂志，1995，18：197.
2 吴勤学，李新宇，魏万惠，等.套式结核菌基因扩增试验的建立及初步应用.中华结核和呼吸杂志，1994，17：295.
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, 百拇医药
4 陈灏珠主编.内科学.第四版.北京：人民卫生出版社，1997，8：315.
5 张绍仪，杜修海.经剑突下心包穿刺留置导管治疗癌性或结核性心包积液的经验. 中华结核和呼吸杂志，1994，17：52.
6 陈灏珠主编.内科学.第四版.北京：人民卫生出版社，1997，8：318～319.
7 Sarker G,Sommer SS.Shedding light on PCR contamination.Nature,1990,3 43:27.
8 施焕中，李超乾，龙学明，等.聚合酶链反应在诊断结核性胸腔积液中的应用.中华结核和呼吸杂志，1994，17：287.
9 张言斌，谭耀驹，谭守勇，等.聚合酶链反应用于涂阴结核早期诊断的评价.中华 结核和呼吸杂志，1998，21：60.
, http://www.100md.com
10 Plikaytis BB,Gelber RH,Shinnick TM,et al.Rapid and sensitive detecti on of M.Leprae using a nested-primer gene amplification assays.J Clin Microbiol,1 990,28:1913.
11 马
，潘毓萱.结核病的诊断.中华结核和呼吸杂志，1995，18：70.(1998-12-09收稿), http://www.100md.com