红霉素对肺细胞胶原酶表达的影响*
作者：刘新民 许松 谭伟
单位：北京医科大学第一医院(100034)呼吸内科
关键词：红霉素；胶原酶；肺间质纤维化
心肺血管病杂志990419 摘要 为了进一步明确红霉素的抗炎机制。我们利用博莱霉素致纤维化大鼠模型观察红霉素在肺间质纤维化形成时对肺细胞胶原酶表达及肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA的表达的影响。结果发现早期肺泡炎为主的阶段，红霉素治疗组巨噬细胞分泌的胶原酶活性降低，而在后期的肺间质纤维化形成为主的阶段治疗组和对照组间无差异，但无论是在早期或后期红霉素对成纤维细胞分泌的胶原酶的活性以及肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA的表达影响不明显。因此我们推测红霉素的抗炎作用可能与其抑制肺泡巨噬细胞分泌胶原酶有关。
近年来研究发现小剂量红霉素具有抗炎，调节免疫功能的作用，对弥漫性泛细支气管炎以及肺间质纤维化具有治疗作用，其机理尚不清楚，许多作者认为其作用是通过抑制中性粒细胞功能[1]，减轻肺损伤形成来实现。在许多致炎因子刺激下，中性粒细胞激活，释放大量蛋白酶，是肺损伤发生的启动环节。胶原酶是致细胞外基质损伤的重要酶类。为了进一步明确红霉素的抗炎机制，我们利用博莱霉素致纤维化大鼠模型观察红霉素在肺间质纤维化形成时对肺细胞胶原酶表达的影响。现将结果报道如下。
, 百拇医药
材料与方法
一、研究对象 Wistar雄性大鼠35只(北京医科大学实验动物中心提供)，体重220±20g，其中28只经气管插管，给予博莱霉素，每kg体重5mg，制成肺间质纤维化模型，然后将其分为2组，1组为红霉素1周组，另1组为红霉素4周组，每组各7只，每天胃管灌注红霉素(北京第六制药厂)50mg/kg。另外14只动物模型，不给予红霉素，分别作为1周，4周组对照。其余7只健康动物，饲养在同一环境，作为正常对照。
二、研究方法 1.细胞培养 气管插管，肺灌洗，离心收集巨噬细胞，贴壁纯化，计数，原代培养48h，收集上清。肺组织经胰蛋白酶消化，过滤，离心，纯化分离肺成纤维细胞，计数，原代培养，收集上清，分别进行巨噬细胞和成纤维细胞所分泌胶原酶蛋白活性测定。2.胶原酶活性的测定[2] 肺泡巨噬细胞、成纤维细胞胶原酶利用空斑扩散法，测定胶原酶蛋白活性。2%的琼脂糖与0.4胶原蛋白加热混匀，制成凝胶板，打孔。用缓冲液稀释一系列不同浓度的胶原酶，加20ul于孔内，孵育72h，考马斯亮兰染色，脱色后观察扩散圈直径，制作标准曲线。样品用胰蛋白酶，大豆蛋白酶抑制剂处理后取20ul入孔，测定胶原蛋白酶的活性。3.间质胶原酶I、IVm-RNA的表达 间质胶原酶I，(基质金属蛋白酶-1，MMP-1)质粒bluescriptvectors，插入片段1900bp，酶切位点SmaⅢ,来源于WashingtonUniversity。间质胶原酶IV，(基质金属蛋白酶-2，MMP-2，72kd)，质粒PBR322，插入片段为2.65kb，酶切位点HandⅢ,来源于FinlandTryssvaswa教授，利用AGPC法[3]，提取肺组织RNA进行northern杂交[4]，放射自显影，杂交带密度扫描积分，以与β-actin之比表示相对含量。
, 百拇医药
结 果
1.红霉素对肺细胞胶原酶活性的影响 肺巨噬细胞和成纤维细胞分泌的胶原酶活性及红霉素对肺细胞胶原酶活性影响见表1。
表1 红霉素对肺成纤维细胞和巨噬细胞胶原酶活性的影响(u/107细胞)
正常对照组
红霉素治疗
1周组
红霉素治疗
1周对照组
红霉素治疗
4周组
红霉素治疗
, http://www.100md.com
4周对照组
巨噬细胞
20.17±6.35
258.43±56.89
149.76±32.54
148±36.00
139±35.00
成纤维细胞
31.23±5.12
126±43.00
137±41.00
289±24.00
, 百拇医药
275±37.00
2.红霉素肺组织MMP-1、2m-RNA的表达的影响Northern杂交结果显示，正常肺组织无MMP-1、2m-RNA的表达。MMP-1、MMP-2m-RNA博莱霉素动物模型1周时表达增加，4周时MMP-1、MMP-2m-RNA持续稳定的表达，红霉素治疗后对MMP-1、2m-RNA的表达无影响。讨 论
红霉素属大环内脂类抗生素，近年研究发现其具有抗炎和调节免疫功能的作用，其机理未明，日本学者OdaJ采用小剂量红霉素治疗弥漫性细支气管炎(DPB)取得了明显疗效。并发现红霉素能抑制中性粒细胞对趋化因子的反应，抑制中性粒细胞在肺上皮细胞的粘附，减少中性粒细胞肺泡内聚集，因而减轻肺损伤的发生[1]。胶原酶是参与调节肺损伤与修复的重要酶类，在肺泡炎和肺间质纤维化形成中发挥重要的作用。
我们利用博莱霉素致肺间质纤维化大鼠模型观察了红霉素在早期的肺泡炎阶段和后期的纤维化形成阶段对肺巨噬细胞和成纤维细胞胶原酶活性的影响，以及应用红霉素对肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA表达(MMP-1、MMP-2mRNA)的影响。发现在病理表现早期以肺泡炎为主的阶段，红霉素治疗组巨噬细胞分泌的胶原酶活性降低，而在后期的肺间质纤维化形成为主的阶段治疗组和对照组间无差异，但无论是在早期或后期红霉素对成纤维细胞分泌的胶原酶的活性以及肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA的表达影响不明显。
, 百拇医药
已有资料显示胶原酶在早期的肺损伤阶段主要来自肺内的炎性细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞，而后期主要来自肺组织细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞等。MMP-1又称间质胶原酶-1其作用底物是间质胶原Ⅲ型[5]。IV型胶原酶即MMP-2，其自然底物主要是IV型胶原分子[6]，对纤维连接蛋白(Fn)也有一定的作用。MMP-1、MMP-2对肺损伤与修复起重要的调节作用。其主要来源于肺间质细胞[7]。因此我们认为红霉素作用的靶细胞可能主要是肺泡炎阶段的炎性细胞，而对间质细胞影响不大，因而对成纤维细胞分泌的胶原酶以及肺组织MMP-1、MMP-2mRNA的影响不大。红霉素的抗炎作用不仅作用于中性粒细胞而且对巨噬细胞的功能也有影响，这一作用可能与其抑制肺泡巨噬细胞分泌胶原酶有关。
*卫生部基金资助课题(基金号：96-1-266)
许松(北京医科大学第一医院中心实验室)
, http://www.100md.com
参考文献
1 OdaJ,Kadota J, Kohno S, et al. Erythromycin inhibits neutrophil c hemotexis in bronchoalveoli of diffuse panbronchiolitis. Chest 1994,106:1116～11 23.
2 Harris ED, Vater CA: Vertebrate Collagenase, In Methods in “Methods in Enzymology” Ed Cunningham LW, 1982, vol 82 pp423～452，Academic Press, NY.
3 Chomaynoki P, Saochi N. Single-step method of RNA isolation by acid guan idium thiocyanate phenol chlororoform extraction. Anal Biochem 1987,162:156～159 .
, http://www.100md.com
4 Sabrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual . 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. New York.
5 Mallya SK, Mookhtiar KA, Gao Y, Brew K, Dioszegi M, Birkedal-Hansen H, et al. Characterization of 58-kilodalton human neutrophil collagenase:comparison with human fibroblast collagenase. Biochemistry 1990, 289:10628～10634.
6 Liotta LA, Trvggvason K, Garbisa S, Hart I, Foltz CM, Shatic S. Metastat ic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collage. Nature 1980,284:67～68.
7 Connor, CMO, FitzGerld MX, Matrix metalloproteases and lung disease . Thorax 1994,49:602～609.
(1999-01-25收稿)
(1999-03-08修回), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第一医院(100034)呼吸内科
关键词：红霉素；胶原酶；肺间质纤维化
心肺血管病杂志990419 摘要 为了进一步明确红霉素的抗炎机制。我们利用博莱霉素致纤维化大鼠模型观察红霉素在肺间质纤维化形成时对肺细胞胶原酶表达及肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA的表达的影响。结果发现早期肺泡炎为主的阶段，红霉素治疗组巨噬细胞分泌的胶原酶活性降低，而在后期的肺间质纤维化形成为主的阶段治疗组和对照组间无差异，但无论是在早期或后期红霉素对成纤维细胞分泌的胶原酶的活性以及肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA的表达影响不明显。因此我们推测红霉素的抗炎作用可能与其抑制肺泡巨噬细胞分泌胶原酶有关。
近年来研究发现小剂量红霉素具有抗炎，调节免疫功能的作用，对弥漫性泛细支气管炎以及肺间质纤维化具有治疗作用，其机理尚不清楚，许多作者认为其作用是通过抑制中性粒细胞功能[1]，减轻肺损伤形成来实现。在许多致炎因子刺激下，中性粒细胞激活，释放大量蛋白酶，是肺损伤发生的启动环节。胶原酶是致细胞外基质损伤的重要酶类。为了进一步明确红霉素的抗炎机制，我们利用博莱霉素致纤维化大鼠模型观察红霉素在肺间质纤维化形成时对肺细胞胶原酶表达的影响。现将结果报道如下。
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材料与方法
一、研究对象 Wistar雄性大鼠35只(北京医科大学实验动物中心提供)，体重220±20g，其中28只经气管插管，给予博莱霉素，每kg体重5mg，制成肺间质纤维化模型，然后将其分为2组，1组为红霉素1周组，另1组为红霉素4周组，每组各7只，每天胃管灌注红霉素(北京第六制药厂)50mg/kg。另外14只动物模型，不给予红霉素，分别作为1周，4周组对照。其余7只健康动物，饲养在同一环境，作为正常对照。
二、研究方法 1.细胞培养 气管插管，肺灌洗，离心收集巨噬细胞，贴壁纯化，计数，原代培养48h，收集上清。肺组织经胰蛋白酶消化，过滤，离心，纯化分离肺成纤维细胞，计数，原代培养，收集上清，分别进行巨噬细胞和成纤维细胞所分泌胶原酶蛋白活性测定。2.胶原酶活性的测定[2] 肺泡巨噬细胞、成纤维细胞胶原酶利用空斑扩散法，测定胶原酶蛋白活性。2%的琼脂糖与0.4胶原蛋白加热混匀，制成凝胶板，打孔。用缓冲液稀释一系列不同浓度的胶原酶，加20ul于孔内，孵育72h，考马斯亮兰染色，脱色后观察扩散圈直径，制作标准曲线。样品用胰蛋白酶，大豆蛋白酶抑制剂处理后取20ul入孔，测定胶原蛋白酶的活性。3.间质胶原酶I、IVm-RNA的表达 间质胶原酶I，(基质金属蛋白酶-1，MMP-1)质粒bluescriptvectors，插入片段1900bp，酶切位点SmaⅢ,来源于WashingtonUniversity。间质胶原酶IV，(基质金属蛋白酶-2，MMP-2，72kd)，质粒PBR322，插入片段为2.65kb，酶切位点HandⅢ,来源于FinlandTryssvaswa教授，利用AGPC法[3]，提取肺组织RNA进行northern杂交[4]，放射自显影，杂交带密度扫描积分，以与β-actin之比表示相对含量。
, 百拇医药
结 果
1.红霉素对肺细胞胶原酶活性的影响 肺巨噬细胞和成纤维细胞分泌的胶原酶活性及红霉素对肺细胞胶原酶活性影响见表1。
表1 红霉素对肺成纤维细胞和巨噬细胞胶原酶活性的影响(u/107细胞)
正常对照组
红霉素治疗
1周组
红霉素治疗
1周对照组
红霉素治疗
4周组
红霉素治疗
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4周对照组
巨噬细胞
20.17±6.35
258.43±56.89
149.76±32.54
148±36.00
139±35.00
成纤维细胞
31.23±5.12
126±43.00
137±41.00
289±24.00
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275±37.00
2.红霉素肺组织MMP-1、2m-RNA的表达的影响Northern杂交结果显示，正常肺组织无MMP-1、2m-RNA的表达。MMP-1、MMP-2m-RNA博莱霉素动物模型1周时表达增加，4周时MMP-1、MMP-2m-RNA持续稳定的表达，红霉素治疗后对MMP-1、2m-RNA的表达无影响。讨 论
红霉素属大环内脂类抗生素，近年研究发现其具有抗炎和调节免疫功能的作用，其机理未明，日本学者OdaJ采用小剂量红霉素治疗弥漫性细支气管炎(DPB)取得了明显疗效。并发现红霉素能抑制中性粒细胞对趋化因子的反应，抑制中性粒细胞在肺上皮细胞的粘附，减少中性粒细胞肺泡内聚集，因而减轻肺损伤的发生[1]。胶原酶是参与调节肺损伤与修复的重要酶类，在肺泡炎和肺间质纤维化形成中发挥重要的作用。
我们利用博莱霉素致肺间质纤维化大鼠模型观察了红霉素在早期的肺泡炎阶段和后期的纤维化形成阶段对肺巨噬细胞和成纤维细胞胶原酶活性的影响，以及应用红霉素对肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA表达(MMP-1、MMP-2mRNA)的影响。发现在病理表现早期以肺泡炎为主的阶段，红霉素治疗组巨噬细胞分泌的胶原酶活性降低，而在后期的肺间质纤维化形成为主的阶段治疗组和对照组间无差异，但无论是在早期或后期红霉素对成纤维细胞分泌的胶原酶的活性以及肺组织间质胶原酶I、IVm-RNA的表达影响不明显。
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已有资料显示胶原酶在早期的肺损伤阶段主要来自肺内的炎性细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞，而后期主要来自肺组织细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞等。MMP-1又称间质胶原酶-1其作用底物是间质胶原Ⅲ型[5]。IV型胶原酶即MMP-2，其自然底物主要是IV型胶原分子[6]，对纤维连接蛋白(Fn)也有一定的作用。MMP-1、MMP-2对肺损伤与修复起重要的调节作用。其主要来源于肺间质细胞[7]。因此我们认为红霉素作用的靶细胞可能主要是肺泡炎阶段的炎性细胞，而对间质细胞影响不大，因而对成纤维细胞分泌的胶原酶以及肺组织MMP-1、MMP-2mRNA的影响不大。红霉素的抗炎作用不仅作用于中性粒细胞而且对巨噬细胞的功能也有影响，这一作用可能与其抑制肺泡巨噬细胞分泌胶原酶有关。
*卫生部基金资助课题(基金号：96-1-266)
许松(北京医科大学第一医院中心实验室)
, http://www.100md.com
参考文献
1 OdaJ,Kadota J, Kohno S, et al. Erythromycin inhibits neutrophil c hemotexis in bronchoalveoli of diffuse panbronchiolitis. Chest 1994,106:1116～11 23.
2 Harris ED, Vater CA: Vertebrate Collagenase, In Methods in “Methods in Enzymology” Ed Cunningham LW, 1982, vol 82 pp423～452，Academic Press, NY.
3 Chomaynoki P, Saochi N. Single-step method of RNA isolation by acid guan idium thiocyanate phenol chlororoform extraction. Anal Biochem 1987,162:156～159 .
, http://www.100md.com
4 Sabrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual . 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. New York.
5 Mallya SK, Mookhtiar KA, Gao Y, Brew K, Dioszegi M, Birkedal-Hansen H, et al. Characterization of 58-kilodalton human neutrophil collagenase:comparison with human fibroblast collagenase. Biochemistry 1990, 289:10628～10634.
6 Liotta LA, Trvggvason K, Garbisa S, Hart I, Foltz CM, Shatic S. Metastat ic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collage. Nature 1980,284:67～68.
7 Connor, CMO, FitzGerld MX, Matrix metalloproteases and lung disease . Thorax 1994,49:602～609.
(1999-01-25收稿)
(1999-03-08修回), http://www.100md.com